Transformation und Klonierung in Hefen

Hefe, oder or Saccharomyces cerevisiae, ist ein weit verbreitetes, einfaches eukaryotisches Modellsystem, mit dem man Genetik und Zellbiologie untersuchen und somit Einblicke in humane zelluläre Prozesse erhalten kann. Dieses Video behandelt die Transformation, also die Aufnahme von Fremd-DNA durch die Hefezelle. Wir werden außerdem Hefeplasmide einführen, zeigen wie man Hefezellen für die Transformation vorbereitet, eine Schritt-für-Schritt Anleitung für die Transformation geben, und einige Anwendungen und wichtige Methoden erläutern.

Bevor wir über die Hefetransformation sprechen, behandeln wir zuerst die Art der DNA, die für Transformationen verwendet wird: das Plasmid. Ein Plasmid ist eine kleine, ringförmige, doppelsträngige supercoil DNA, die einfach durch die Poren in der Zellmembran passt.

Plasmide enthalten eine multiple Klonierungsstelle (MCS), wo Restriktionsendonukleasen, auch als Restriktionsenzyme bekannt, DNA schneiden können. Andere DNA Fragmente, welche mit den selben Enzymen geschnitten worden sind, können in die MCS ligiert werden. Plasmide enthalten außerdem einen Replikationsursprung oder ORI, welcher der Zelle signalisiert wo die Replikation anfängt. Zusätzlich verfügen Plasmide über einen Selektionsmarker, durch welchen Hefezellen mit dem Plasmid bei spezifischen Bedingungen wachsen können. Hefezellen ohne Plasmid, können in Medium mit Selektionsmarker nicht überleben. Selektionsmarker können Gene sein, welche zum Beispiel Resistenz gegen ein Medikament erzeugen oder Enzyme kodieren, die es der Hefe ermöglichen eine bestimmte Aminosäuren herzustellen, welche sie normalerweise nicht selbst herstellen kann.

Shuttle-Vektoren sind Plasmide, die in mehr als einem Wirt repliziert werden können. Ein Plasmid von E. coli kann zum Beispiel auch in Hefe vermehrt werden. Hefe-Plasmide können entweder in das Genom integrieren oder nicht. Das heißt, dass das Plasmid entweder in die genomische DNA aufgenommen wird oder unabhängig bleibt.

Es gibt fünf verschiedene allgemeine Plasmide oder Vektoren, welche in Hefe verwendet werden. Die Plasmide, die am häufigsten verwendet werden sind das „Yeast Episomal plasmid“ (YEp), und das „Yeast Centromeric plasmid“ (YCp). Beide Plasmide enthalten eine autonome Replikationssequenz, oder ARS. Die ARS enthält den Replikationsursprung und ermöglicht daher die extrachromosomale Replikation in der Hefe.

Es gibt verschiedene Methoden, mit welchen man Hefe transformieren kann. Dazu gehören die Sphäroplast Methode, die Elektroporation, und die Lithium-Acetat Transformation. In diesem Video konzentrieren wir uns auf die Lithium-Acetat-Methode.

In dieser Transformationsmethode neutralisieren positiv geladene Lithium Kationen die negative Ladung der Zellmembran und der Plasmid-DNA. Einzelsträngige DNA – welche zu dem Transformationsgemisch dazugegeben wird – bindet die Zellwand der Hefe und stellt sie damit der Aufnahme durch die Hefe zur Verfügung. Ein Druckunterschied zwischen der Innen- und Außenseite der Zelle entsteht, wenn die Zellen einem Hitzeschock, also einer plötzlichen Erhöhung der Temperatur, ausgesetzt werden. Dadurch entstehen Poren, durch welche die Plasmid-DNA die Zellwand durchdringen kann. Wenn die Temperatur wieder abgesenkt wird, kann sich die Zellwand selbst reparieren und der Transformationsprozess ist abgeschlossen.

Fangen wir mit einer Schritt-für-Schritt Anleitung an, wie man die Hefe für die Transformation vorbereitet. Hefezellen werden vorbereitet, indem man zuerst eine Kolonie von einer Agarplatte auswählt, und dann die Kolonie in dem „Yeast Extract Pepton-Dextrose Medium“ (abgekürzt YPD) – ein komplettes Medium für Hefewachstum, vermehrt.

Nachdem die Kolonie von einer Platte ausgewählt und in YPD Medium gegeben worden ist, wird die Kultur über Nacht bei 30°C in einem Schüttler oder Roller, wie hier zu sehen ist, gestellt. Die Hefezellen werden dann durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand wird abgegossen. Das Pellet wird in dem gewünschten Puffer oder in sterilem Wasser resuspendiert. Diese kompetenten, vorbereiteten Hefezellen benutzen wir nun in der folgenden Transformationsmethode.

Wenn die Hefezellen erst einmal vorbereitet sind, kann die Transformation ausgeführt werden, indem man zuerst das Transformationsgemisch herstellt.

Das Reagenzgemisch enthält die folgenden Bestandteile: steriles, destilliertes Wasser, eine 50% Lösung von Polyethylenglycol (oder PEG), 1M Lithium-Acetat, eine 10mg/ml Lösung der einzelsträngigen DNA, Plasmid DNA und den kompetenten Hefezellen. Die genauen Verhältnisse jeder Lösung sollten vor Beginn des Experiments berechnet werden. Genauere Informationen kann man in einem Laborhandbuch für Hefetransformationen nachschlagen.

Die Mischung wird dann für 30 Minuten bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Die Lösung sollte geschüttelt werden, aber ein Vortex sollte nicht verwendet werden. Damit stellt man sicher, dass die Hefezellen nicht auseinander fallen.

Der Hitzeschock wird dann in einem 42°C warmen Wasserbad bei 15 Minuten durchgeführt. Dann wird die Reaktion für 2 Minuten auf Eis gekühlt. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren geerntet.

Danach resuspendiert man die Zellen in doppel-destilliertem Wasser und verteilt sie auf Agarplatten, auf welchen die transformierten Hefezellen selektiert werden. Die Transformationsplatten werden dann bei 30°C für zwei bis vier Tage gelagert, bis Kolonien entstehen.

Die Transformationsmethode sollte, bis die Methode optimiert ist, immer positive und negative Kontrollplatten enthalten. Eine Positivkontrolle sollte eine Hefezellsuspension mit Plasmid-DNA auf einer YPD Platte ohne Selektionsmarker sein. Dadurch kontrolliert man wie gesund die Zellen nach der Transformationsmethode sind. Die Negativkontrollplatte sollte eine Hefesuspension auf der jeweiligen Selektionsplatte mit dem Antibiotikum sein. Diese Platte sollte keine Kolonien haben und zeigt dadurch an ob es eine Verunreinigung gegeben hat.

Es gibt viele verschiedene Anwendungen der Hefetransformation. Eine Anwendung von transformierter Hefe ist das Hefe-Zwei-Hybrid-System, mit dem man Proteine identifizieren kann, welche das gewünschte Protein (dem Bait-Fusionsprotein) binden. Wenn ein Plasmid von einer Bibliothek aus möglichen Bindungspartnern (oder Prey-Fusionsproteinen) transformiert wird und eine Interaktion stattfindet, wird ein Transkriptionsfaktor freigesetzt, welcher wiederum ein Reportergen aktiviert, wie zum Beispiel Beta-Galaktosidase. Das Reportergen lässt die Kolonien, in welchen die Interaktion stattfinden, blau werden auf Platten, die X-Gal – ein Substrat der Beta-Galactoside - enthalten.

Mehrere Lösungen können in der Hefe durch die Sexualzyklus- Methode, induziert werden. Haploide Zellen, welche einen Reporter und einen gelöschten Lokus enthalten werden in eine Zelle durch die zufällige Verteilung der meiotischen Rekombination zusammengefügt. Selektionsmarker werden benutzt, um Hefen zu selektieren, welche die Löschung erfolgreich durchgeführt haben. Hier wird die Durchflusszytometrie benutzt, um Zellen, welche GFP exprimieren, auszuwählen.

Hefen können auch mit fluoreszenten Proteinen transformiert werden, um den Effekt einer Mutation einer Protein-Protein Bindung zu untersuchen. Dieses Video benutzt die Fluoreszenzmikroskopie, um zu untersuchen welche Effekte die verschiedenen Mutationen auf die Protein-Protein Interaktionen haben, die wichtig für die Endozytose sind.

Das war die Einführung in die Hefetransformation von JoVE. Ihr solltet nun die grundlegenden Aspekte eines Plasmids, wie man Hefezellen für die Transformation vorbereitet, und wie man die Transformation ausführt, verstehen. Wie immer, danke für eure Aufmerksamkeit!