Die kovalente Bindung von BMP-2 auf Oberflächen mit einem selbstorganisierten Monoschicht-Ansatz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zwei Moleküle kovalent an Oberflächen zu binden, ohne ihre Bioaktivität zu verlieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Goldschicht auf einem Substrat durch physikalische Gasphasenabscheidung gebildet wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine selbstorganisierte Monoschicht aus mu NHSA bifunktionalem NHS Thiol-Linker zu erzeugen.

Als nächstes wird RH BMP zwei kovalent an den Linker gebunden. Der letzte Schritt besteht darin, das ungebundene BMP zwei durch Beschallung zu entfernen. Abschließend wird ein Antikörper-Bindungsassay verwendet, um die erfolgreiche Bindung von BMP zwei an die Oberflächen zu zeigen, und die biologische Aktivität von oberflächengebundenem BMP zwei wird in Zellen durch Analyse der SMA 1 5 8 Phosphorylierung bestimmt.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wachstumsfaktorbiologie zu beantworten, z. B. ob die anfängliche Bindung von Wachstumsfaktoren an ihre Rezeptoren an der Zelloberfläche ausreicht, um Signalantworten auszulösen. Das Verfahren wird von zwei Mitgliedern meines Labors, Teresa Paul und Elizabeth Schwab, demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie die Glasdeckgläser mit Präzisionstüchern und beschallen Sie sie fünf Minuten lang in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Ethylacetat und Methanol.

Spülen Sie die Substrate nach der Beschallung mit Methanol und trocknen Sie sie unter Stickstofffluss. Legen Sie die sauberen Substrate in eine Sputterbeschichtungsvorrichtung und evakuieren Sie die Kammer. Entfernen Sie die oberste Chromoxidschicht vom Chrom-Target, indem Sie 60 Sekunden lang sputtern.

Anschließend wird das Substrat mit einer 10 Nanometer dicken Chromschicht beschichtet und anschließend mit einer 40 Nanometer dicken Goldschicht beschichtet. Wenn du fertig bist, entferne die Goldsubstrate aus der Kammer und lege sie beiseite. Die Goldsubstrate werden in einen zweihalsigen Rundkolben überführt und in einem Millimolar M-U-N-H-S in DMF vier Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre inkubiert.

Nach der Inkubation beschallen Sie die Substrate zwei Minuten lang in DMF. Spülen Sie sie mit DMF und Methanol ab und trocknen Sie sie unter Stickstofffluss. Verdünnen Sie die RHB MP Zwei-Stamm-Lösung mit einem molaren Natriumchlorid in PBS, um eine Endkonzentration von 3,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.

Stellen Sie diese Arbeitslösung unmittelbar vor der Verwendung mit sterilem 10 millimolaren Kaliumhydroxid auf pH 8,5 ein. Legen Sie den A-P-D-M-S-Ring auf die Probe. Übertragen Sie das Substrat auf eine Sechs-Well-Platte, um sicherzustellen, dass nur die Substratoberflächen der Inkubationslösung ausgesetzt sind.

Anschließend inkubieren Sie die funktionalisierten M-U-N-H-S-Substrate mit der Arbeitslösung RHB MP two bei vier Grad Celsius über Nacht. Nach Entfernen des Inkubationsüberstands wird ein molares Natriumchlorid in PBS zugegeben und die Substrate zwei Minuten lang beschallt. Wenn Sie fertig sind, waschen Sie die Substrate dreimal mit sterilem einmolaren Natriumchlorid in PBS, um eine unspezifische Absorption von Antikörpern zu blockieren.

Inkubieren Sie die Substrate in 5%BSA in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann inkubieren Sie die Substrate eine Stunde lang bei Raumtemperatur, wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie die Substrate zweimal mit PBS und beschallen Sie sie 30 Sekunden lang. Inkubieren Sie anschließend die Substrate 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer HRP-konjugierten Sekundärantikörperlösung und waschen Sie sie dann zweimal mit PBS.

Verwenden Sie den Amply Flu Red Assay, um die enzymatische Aktivität von HRP bei 570 Nanometern mit einem Plattenleser zu messen: Seed eins mal 10 bis zum fünften Mund C, zwei C 12-Myoblasten pro Vertiefung in sechs Well-Platten in Wachstumsmedium und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nachdem die Platten aus dem Inkubator entnommen wurden, aspirieren Sie das Medium aus den Vertiefungen und hungern die Zellen drei bis fünf Stunden lang in serumfreiem DMEM, bevor Sie es auf die funktionalisierten BMP-Substratoberflächen aussäen, um die kurzfristige Signalinduktion zu untersuchen. Ersetzen Sie das Medium durch 200 Mikroliter frisches serumfreies DMEM und platzieren Sie das immobilisierte BMP zwei Substrate über den Zellen mit einer Pinzette mit feiner Spitze nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Entfernen Sie die Substrate vorsichtig und saugen Sie das Medium mit einer Pipette ab. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit PBS und fahren Sie mit der Analyse der Zellreaktionen mittels Gelelektrophorese und Western Blotting zur Analyse der langfristigen biologischen Aktivität fort. Plattieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben auf die Oberflächen und kultivieren Sie sie sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in 2 % FBS.

Nach der Inkubation. Bildten Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie, um RH BMP zu verifizieren, zwei Bindungsoberflächen mit immobilisiertem RH BMP zwei wurden mit einem BMP zwei spezifischen Antikörper und einem sekundären Antikörper, der mit HRP konjugiert war, inkubiert. Der oberflächenimmobilisierte RH BMP zwei oder I BMP zwei wurde vor und nach der Zellstimulation nachgewiesen.

Hier ist die erfolgreiche Bindung von RH BMP two an die Oberfläche zu sehen, eine Bestätigung, die durch das Anti BMP zwei IgG anerkannt wird. Das oberflächenimmobilisierte RH BMP zwei wurde mit dem amli flu red chole metric Assay quantifiziert und die Daten zeigen, dass das Protein nach der Zellstimulation immer noch auf der Oberfläche nachgewiesen wurde, die Zellreaktionen auf Oberflächen mit immobilisiertem RHB MP zwei wurden ausgewertet und mit der Wirkung von unbehandelten Goldsubstraten verglichen. Hier wurden C zwei C 12 Zellen für 30 Minuten durch RHB MP zwei funktionalisierte Oberflächen, die sich von oben näherten, stimuliert.

In diesem Modell hemmt BMP zwei die Differenzierung von Zellen in mehrkernige Myotuben und induziert Osteoblasten-Phänotypen. Die Aktivierung von SMAD 1 5 8, die nachgeschaltete Reporter des BMP two-Signalwegs sind, wird durch Western Blot analysiert, wie hier gezeigt. Eine SM-Phosphorylierung wird nach 30-minütiger Stimulation durch I BMP zwei beobachtet, während in Zellen, die unbehandelten Goldproben ausgesetzt waren, keine Phosphorylierung von SMAD 1 58 auftritt.

Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Immobilisierungsprozess die kurzfristige Aktivität von BMP zwei nicht verändert und frühe Schritte in der smad-Signalgebung auslöst, um zu bestimmen, ob I BM P zwei die langfristige osteogene Differenzierung beeinflusst. Das Expressionsniveau der alkalischen Phosphatase wurde mit einem cholemetrischen Assay untersucht. Die alkalische Phosphataseaktivität der C zwei C 12 Zellen wurde nach sechstägiger Inkubation der Zellen auf glattem Gold und auf IBP zwei Oberflächen gemessen.

Die alkalische Phosphataseaktivität in Lysaten von Zellen, die auf I BM P zwei Oberflächen kultiviert wurden, zeigte eine signifikant höhere Absorption im Vergleich zur Kontrolle. Dieses Ergebnis zeigt, dass IBMP zwei die Expression von alkalischer Phosphatase in C zwei C 12 Zellen induziert, um die Wirkung von IBP zwei zu untersuchen. Bei Myogenesis C wurden zwei C 12-Zellen direkt auf Gold oder auf funktionalisierten Oberflächen plattiert und unter niedrigen Serumbedingungen kultiviert.

Nach sechs Tagen wurde die Färbung der Myosin-Schwerkette durchgeführt, wie hier gezeigt. C zwei C 12-Zellen konnten in Gegenwart von I BM P zwei im Gegensatz zu den Zellen auf Goldsubstraten keine Myosin-Schwerketten-positiven Myo-Röhrchen bilden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immobilisierung von BMP zwei auf Goldnanopartikeln durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Zum Beispiel, wie viel von immobilisiertem BMP zwei lokal benötigt wird, um Signalantworten effizient auszulösen.