Name: Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Lernen Sie die FACS-basierte Sortierung humaner embryonaler Stammzellen mit den monoklonalen Antikörpern TG30 und GCTM-2. Diese Methode ermöglicht die objektive Quantifizierung von Pluripotenz und die Trennung von differenzierten Zellen.

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Wir danken der StemCore-Einrichtung an der Monash University für die Bereitstellung von hESC-Linien und der FlowCore-Anlage an der Monash University für FACS-Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des Australian Stem Cell Centre, des New South Wales and Victorian Government Stem Cell Research Grant Program to ALL unterstützt. ALL ist Partner Investigator der Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative in Stem Cell Science, Stem Cells Australia.

Das folgende Protokoll wurde mit hESC-MEL111 Standard-Massenkulturen durchgeführt, die von der StemCore-Anlage an der Monash University (Melbourne) bereitgestellt wurden. Diese Zelllinie wird routinemäßig auf einer Schicht von mitotisch inaktivierten Maus-Embryonal-Fibroblasten (MEFs) in bFGF-ergänztem hESC/KOSR-Medium7 kultiviert und mit enzymatischer Dissoziation (Collagenase) alle 5-7 Tage8aufrechterhalten. hESC-Kulturen, die in 75 cm2 (T75) Kolben auf 80 % Konfluenz angebaut werden, werden als Eingangspopulationen für dieses Protokoll verwendet. Alle unten beschriebenen Zellmanipulationsverfahren sollten unter aseptischen Bedingungen in einem HEPA-gefilterten Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden.
Bereiten Sie zwei Tage vor der Durchführung eines TG30/GCTM-2 FACS-Assays die T75-Kulturplatten (beschrieben in Abschnitt 1) vor, die für die Rekultur von Nach FACS zurückgewonnenen Zellen verwendet werden sollen (siehe Abschnitt 4).
1. Aussaat von MEFs und Vorbereitung von MEF-konditioniertem Medium
1.1 TAG -2: Beschichtung von MEFs in T75-Flaschen
<ol><li>Pipette 10 ml 0,1% w/v Gelatine in jeden T75 Kolben und neigung zur gleichmäßigen Beschichtung oberfläche.</li>
	<li>30 min bei Raumtemperatur in einem Biosicherheitsschrank inkubieren.</li>
	<li>Aspirieren Gelatinelösung.</li>
	<li>20 ml MEF-Medium in den Kolben geben und in einem Zellkultur-Inkubator 30 min auf 37 °C/5%CO2 voraussetzen.</li>
	<li>Platte mitotisch inaktivierte MEFs auf vorbereiteten Kolben in den folgenden Dichten. Für 1/3 MEF Dichtesamen 1,4 x 104 Zellen/cm2 (T75= 1 x 106 MEFs). Für MEF-Saatgut mit voller Dichte 5,3 x 104 Zellen/cm2 (T75 = 4 x 106 MEFs).</li>
</ol>Hinweis: Wir verwenden routinemäßig MEFs, die durch γ-Bestrahlung mitotisch inaktiviert wurden. Ein Protokoll zur Herstellung γ bestrahlter MEFs finden Sie in Michalska12.
<ol start="6"><li>Inkubationsbestrahlte MEF-Kulturen bei 37 °C/5%CO2 über Nacht. Die 1/3-Flaschen können 1-4 Tage ohne MEF-Medium-Wechsel inkubiert werden. Diese Kolben werden zum Replatieren von Post-FACS-Zellen verwendet (wie in Protokoll 4). Volle MEF-Flaschen werden über Nacht inkubiert, um CM gemäß unten in Schritt 1.2 zu erzeugen.</li>
</ol>1.2 TAG -1: Vorbereitung des MEF-bedingten Mediums (CM)
<ol><li>Aspirieren MEF-medium aus VollmeF T75-Flaschen.</li>
	<li>Vorverwertte 25 ml hESC/KOSR-Medium mit 5 ng/ml HumanfGF-2 pro T75-Kolben ergänzen. Bei 37 °C/5% CO2 für 24 Stunden inkubieren.</li>
	<li>MEF-konditioniertes Medium (CM) in ein steriles Gewebekulturrohr zu sammeln, CM mit 10 ng/ml Human FGF-2 frisch zu ergänzen und mit einem 0,22 m Polyethersulfonfilter zu filtern.</li>
	<li>Um zusätzliche CM zu produzieren, wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 täglich auf derselben MEF-Kultur für eine Woche.</li>
</ol>Ersetzen Sie am Tag der Durchführung eines TG30/GCTM-2-Assays MEF-medium in 1/3 MEF T75-Flaschen durch CM und vordem Ausgleich für mindestens 30 min, bevor Sie hESCs oder hESC-derivat-Derivatezellen aus dem verfahren wie unten beschrieben ensaatieren. CM wird entweder frisch verwendet oder bei 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert. CM wird in diesem Protokoll verwendet, da es in unseren Händen die Lebensfähigkeit der Zellen nach FACS im Vergleich zu nicht konditionierten Medien erhöht (Ergebnisse nicht gezeigt).
2. Durchführung eines TG30/GCTM-2 FACS-Assays: Dissoziation von hESC-Massenkulturen in Einzelzellen
Hinweis: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medium bei 4 °C.
<ol><li>Aspirieren Sie die hESC/KOSR-Medien aus zwei T75-Flaschen mit einer kultivierten hESC-Linie.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen in jedem T75 mit 10 ml DPBS und aspirieren zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml TrypLE Express Dissoziationslösung in jeden T75-Kolben ein. Bei 37 °C/5%CO2 für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Bump die Seite der Kolben, um eine vollständige Auflösung der Zellen zu erhalten. Unter dem Mikroskop überprüfen. Wenn sich die Zellen nicht leicht lösen, brüten Sie weitere 2-3 min bei 37 °C/5%CO2.</li>
	<li>10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C gehalten) zu jedem T75-Kolben geben. Mit einer sterilen 10 ml Pipette trituieren die dissoziierten Zellen mehrmals gegen die Kolbenwand, um eine überwiegend einzellige Suspension zu erreichen.</li>
	<li>Legen Sie ein 70-m-Zellsieb auf ein 50 ml steriles Polypropylen-Rohr. Verwenden Sie eine sterile 10 ml Pipette, um die hESC Einzelzellensuspensionen zu erzwingen, die aus den beiden T75-Flaschen durch das Sieb gepoolt werden.</li>
	<li>Zellesieb entsorgen, den Rohrdeckel ersetzen und die gepoolte hESC-Aufhängung bei 1.000 x g für 2 min zentrieren.</li>
	<li>Überstand entsorgen und die Zellen waschen, indem Sie das Pellet in 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) sanft aufhängen.</li>
	<li>Führen Sie eine zweite Zentrifugation bei 1.000 x g für 2 min durch.</li>
	<li>Überstand entsorgen, 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) hinzufügen und sanft trituieren, um Zellen wieder aufzusetzen. Die 50 ml Tube auf Eis legen. Dieses Rohr wird für das unten beschriebene Sortierproben-Immunostaining-Verfahren verwendet. </li>
	<li>Nehmen Sie 20 l der hESC Einzelzellsuspension (Schritt 2.10) für die Zellzahlzählung mit einem Hemotozytometer. Sie sollten eine Ausbeute von 10-15 Millionen Zellen pro T75-Kolben erwarten.</li>
</ol>Hinweis: FBS wird in diesem Teil des Protokolls verwendet, um die Zelllebensfähigkeit nach FACS zu erhöhen.
3. ImmunfluoreszenzFärbung der Zelloberflächenantigene TG30 und GCTM-2
<ol><li>Aliquot 150 l (ca. 100.000 Zellen) einer hESC Einzelzellsuspension (ab Schritt 2.11) in jeweils sechs Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml. Diese sechs Aliquots werden für die Färbekontrollen verwendet, die erforderlich sind, um den Test auf der FACS-Maschine zu kalibrieren. Die verbleibende Zellsuspension mit 9 ml wird Ihre Sortierprobe sein, in der die dissoziierte Kultur für den Nachweis von TG30 und GCTM-2 gemäß den Tabellen 1 und 2gecostainiert wird.</li>
	<li>Führen Sie Bindungsreaktionen von primärantikörpern in 20% FBS/DMEM-F12 durch. Die Endreaktionsvolumina sollten für die Sortierprobe 9 ml und für die Kontrollen 200 ml betragen. Isotypsteuerelemente als primäre Antikörper einschließen. Rohre horizontal auf Eis legen und 30 min auf einer Schaukelplattform sanft mischen.</li>
	<li>Zentrifugen-Primärantikörperreaktionen bei 1.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Überstand entsorgen und die Zellen waschen, indem Sie das Pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C) für die Sortierprobe und 200 l für die Kontrollen wieder aufhängen.</li>
	<li>Führen Sie eine zweite Drehung bei 1.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Führen Sie Bindungsreaktionen von sekundären Antikörpern in 20% FBS/DMEM-F12 durch. Die Endreaktionsvolumina sollten 2,5 ml für die Sortierprobe und 200 ml für die Kontrollen betragen. Bereiten Sie die PE-Anti-Maus CD90.2 Reaktionsröhre in diesem Stadium vor. Rohre horizontal auf Eis legen und 30 min auf einer Schaukelplattform sanft mischen.</li>
</ol>Hinweis: Während dieser Inkubationszeit ist es praktisch, CM zu sammeln und 1/3 MEF T75-Flaschen mit CM wie in Abschnitt 1.2 vorzubereiten.
<ol start="7"><li>Zentrifugen-Sekundärantikörperreaktionen bei 1.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Überstand entsorgen und die Zellen TWICE waschen, indem Sie das Pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) für die Sortierprobe und 200 l für die Kontrollen wieder aufhängen.</li>
	<li>Führen Sie eine Drehung bei 1.000 x g für 2 min nach jedem Waschen und legen Sie Rohre auf Eis.</li>
	<li>Überstand entsorgen und Zellpellets in 20% FBS/DMEM-F12, ergänzt mit Propidiumjodid (PI) bei 0,3 g/ml, wieder aufsetzen. Verwenden Sie 2-3 ml für die Sortierprobe und 300 l für die Kontrollen.</li>
</ol>Hinweis: Fügen Sie dem Steuerrohr MIT unbefleckten Zellen NICHT PI hinzu.
<ol start="11"><li>Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um jede einzelne Zellsuspension durch ein 35-m-Deckelzellsieb zu erzwingen, das an 5 ml Tube Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläser gekoppelt ist.</li>
	<li>Zentrifuge bei 50 g/min, um durch die Restzellsuspension auf den Siebdeckeln zu erzwingen.</li>
	<li>Setzen Sie jede einzelne Zellsuspension durch Antippen der Seiten der Rohre aus und legen Sie sie auf Eis. Ihre Zellen sind jetzt bereit für FACS. Bitte fahren Sie sofort fort.</li>
</ol>4. Post-FACS-Kultur von TG30/GCTM-2 Unterbrechungszellen in 75 cm2 (T75) Flaschen
<ol><li>Wir haben bereits berichtet, wie man eine FACS-Maschine für TG30/GCTM-2 Immunprofiling7einrichtet. Das Verfahren ermöglicht die Wiederherstellung lebensfähiger einzeler HESCs, frei von MEFs, und innerhalb der Tore von P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) - siehe Abbildung 1E. Richten Sie die FACS-Maschine für TG30/GCTM-2 FACS ein, wie in unserem vorherigen Bericht, um die als nächstes zu verwendenden Zellunterfraktionen wiederherzustellen.</li>
	<li>1 ml CM, wie in Schritt 1.2 zubereitet, zu je zwei 5 ml Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläsern geben, bevor Zellen von der FACS-Maschine gesammelt werden. Auf Eis legen.</li>
	<li>Stellen Sie jeweils 400.000 Zellen aus differenzierten P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) und pluripotenten P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellsubfraktionen mit TG30/GCTM-2 FACS wieder her.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Sammelrohre bei 1.000 x g für 5 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Überstand. Fügen Sie 1 ml vorgläsige 37 °C/5% CO2 CM hinzu, um jedes Zellpellet mit einem P1000-Mikropipettor wieder aufzuhängen. Säen Sie die Zellen für jede Fraktion auf einen vorausgeglichenen 1/3 MEF T75 Kolben mit CM (vorbereitet nach Schritt 1.2)</li>
	<li>Kultur bei 37 °C/5%CO2 für 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator.</li>
	<li>ASpirieren Sie CM täglich und ersetzen Sie durch frisch zubereitete CM (wie in Schritt 1.2) für etwa zwei Wochen. Kulturen pluripotenter P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) zeigen nach einer Woche menschliche stammähnliche Kolonien und erreichen nach 9-11 Tagen eine Konfluenz von 80 %. Kulturen von P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) Zellen wachsen meist als Rasen von fibroblastenähnlichen Zellen, die nach 11-13 Tagen die Konfluenz erreicht. In diesem Stadium können bei Bedarf P4- und P7-Zellkulturen für TG30/GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutive Rekulturalon von P4- oder P7-Unterfraktionen verwendet werden (siehe Abbildungen 2 und 3).</li>
</ol>

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</ol>

Nichts zu verraten.

Im klinischen Kontext sind differenzierte somatische Zelltypen das endgewünschte Produkt für Transplantations- und Therapieanwendungen, und hPSC ist eine sich selbst erneuernde und skalierbare Quelle, um diese somatischen Zellen oder ihre Vorfahren im Labor zu erzeugen. Das Vorhandensein von verbleibenden undifferenzierten hESCs mit einem inhärenten Potenzial für die Teratombildung stellt ein Sicherheitsrisiko dar, wenn man hESC-abgeleitete somatische Zellen für die Transplantation bei Patienten in Betracht zieht. Eine Überprüfung dieser und anderer Risiken im Zusammenhang mit der Zelltherapie finden Sie unter Sharpe et al. 16 Um solche Anwendungen zu realisieren, ist es daher unerlässlich, dass die Forscher Zielzellpopulationen erzeugen wollen, die auch pluripotente Stammzellfrei sind. Zu diesem Zweck zeigen wir hier, dass es mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik möglich ist, das Vorhandensein von pluripotenten Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) in einer differenzierenden Zellpopulation zu überwachen und tragfähige hESC-differenzierte Derivate zu erhalten, die nach FACS angereichert und rekultiviert werden können. Obwohl es nicht möglich ist, 100% pluripotente Stammzellfreie Proben mit einem einzigen Durchlauf unseres Protokolls zu erhalten, können angereicherte hESC-Derivate rekultiviert werden und nach aufeinanderfolgender Passierung wird 100% somatische Zellreinheit erreicht. Die nachgewiesene Lebensfähigkeit somatischer Zellen für die Expansion nach FACS ermöglicht möglicherweise auch die Produktion einer ausreichenden Anzahl von Zellen, die für potenzielle Transplantationstherapien geeignet sind.
Die ermutigenden Ergebnisse dieser Pilotstudie veranlassten uns, eine umfassendere Untersuchung mit unserem TG30/GCTM-2-Protokoll in einer vergleichenden Studie mit mehreren humaninduzierten pluripotenten Stammzelllinien (hiPSC)15durchzuführen. In dieser Studie fanden wir heraus, dass pluripotente Stammzellfreie Proben, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll gewonnen wurden, bei der Transplantation in immunbenachteiligte Mäuse keine Teratome erzeugten. Daher können wir getrost feststellen, dass mit der Verwendung dieses In-vitro-Protokolls, Frühstadium Differenzierung Zellkulturen bestimmt frei von pluripotenten TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen entwickeln teratomas in vivo. Dies unterstützt nachdrücklich die Robustheit unseres Assays und bietet einen potenziellen Ansatz, um das Risiko einer Teratombildung vor der Verwendung von hPSC-abgeleiteten Zellen in klinischen Anwendungen zu eliminieren.
Umgekehrt zeigen wir auch, dass der TG30/GCTM-2 FACS-Assay verwendet werden kann, um eine pluripotente Zellpopulation mit hohem Expressioniergrad dieser beiden Oberflächenantigene (TG30Hi-GCTM-2Hi) abzurufen. Frühere Studien haben gezeigt, dass TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen die höchste Korrelation mit OCT4hi Expression aufweisen und die höchste Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien5,6,13,15bilden. Wir gehen daher davon aus, dass das Pluripotenznetzwerk in TG30Hi-GCTM-2 Hi-Exemittenzellen auf seinen Höchstwerten aktiviert ist. Wir sind der Ansicht, dass die Verwendung unserer TG30/GCTM-2 FACS-Protokolle und das Abrufen von P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) eine großflächige Reinigung von angereicherten lebenden hESC-Kulturen als Inputs für Differenzierungstests ermöglichen könnte.
Zusammenfassend zeigen wir hier die Potenzialität unserer FACS-Assays basierend auf der kombinierten Expression der Oberflächenantigene TG30 und GCTM-2 sowohl für die Reinigung als auch für die Anreicherung von hESCs. Zukünftige Studien mit Protokollen zur gezielten Differenzierung von hPSCs dürften auch in Bezug auf diese Potenzialität informativ sein. Wir sind uns bewusst, dass in einigen Assays, in denen differenzierte hESC-Derivate vorübergehend TG30 (CD9) oder GCTM-2 ausdrücken, diese beiden Antikörper möglicherweise nicht geeignet oder ausreichend sind, um pluripotente Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt im Test6aus einer differenzierten Population zu säubern. Daher besteht die ständige Notwendigkeit, neuartige Antikörper zu finden, die lebende hESCs spezifisch erkennen, um die mögliche Begrenzung der Kreuzreaktion mit einigen differenzierten Zelltypen zu überwinden.

HPSC (hPSC) umfassen menschliche embryonale Stammzellen (hESC) und humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC). HPSC kann sich unter geeigneten Kulturbedingungen auf unbestimmte Zeit erneuern, ohne seine Fähigkeit zu verlieren, die als "Pluripotenz" bekannt ist. Pluripotenz ist definiert als das Potenzial für eine Zelle, sich in im Wesentlichen jede somatische Zelllinie zu unterscheiden, einschließlich Zellen, die für jede der drei embryonalen Keimzellschichten repräsentativ sind. Das bemerkenswerte Potenzial von hPSC bietet ein Mittel für eine Vielzahl von zellbasierten Anwendungen, einschließlich therapeutischer Optionen. Zum Beispiel gibt es Erkrankungen mit Zelltod und Degeneration, bei denen die normale Funktionsfähigkeit von Zellen im menschlichen Körper beeinträchtigt ist, wie bei Herzinsuffizienz, Wirbelsäulenverletzungen, Diabetes, Parkinson-Krankheit, einigen Krebsarten und anderen klinischen Pathologien. Patienten, die unter diesen Erkrankungen leiden, könnten möglicherweise durch Transplantation gesunder und funktioneller somatischer Zellen behandelt werden, die aus hPSC im Labor abgeleitet wurden. Die aktuellen hPSC-Differenzierungsprotokolle sind jedoch nicht 100% effizient und ergeben eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie Rest-hPSCs, die keiner Differenzierung unterzogen wurden, sondern erneuern sich weiterselbst 1-3. Das Vorhandensein einer kleinen Anzahl von hPSC in einer Probe von hPSC-abgeleiteten somatischen Zellen, die für die Transplantation in Patienten bestimmt sind, stellt ein ernstes klinisches Risiko dar, da diese Zellen aufgrund ihrer inhärenten Natur Gewebe aller drei embryonalen Keimschichten bilden könnten, potenziell in vivo eine Art von Tumor bilden könnten, der als Teratom bekannt ist. Daher können nur Zielzellpopulationen, die als frei von pluripotenten Stammzellen bestimmt sind, als sicher für die Transplantation bei Patienten angesehen werden. Es gibt mehrere Ansätze, um möglicherweise die Reinigung von Rest-HPSCs nach Differenzierung zu erreichen (zur Überprüfung siehe Polanco und Laslett4). Wir haben bereits über die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 gekoppelt an fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) berichtet, um pluripotente Stammzellen zu identifizieren und sie von Zellen zu unterscheiden, die sich einem frühen Stadium der Differenzierung in Kulturen derhESC-Linien 5-7unterziehen.
Ein Vorteil der Verwendung von Antikörpern zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen besteht darin, dass die Zielzellen nach der Antikörperbindung und/oder Etikettierung in der Regel lebensfähig sind. Daher können Zielzellen nach der Antikörperkennzeichnung gesammelt und für Erweiterungen und weitere Anwendungen vor der Transplantation rekultiviert werden. Eine Einschränkung für Zelloberflächenantigene, die auf hPSC exprimiert werden, ist, dass sie nicht ausschließlich für das pluripotente Stadium gelten und in vielen Fällen während der Entwicklung zeitlich neu ausgedrückt werden und daher in einigen differenzierten Zelltypen nachgewiesen werden. Wenn es daher darum geht, Antikörper zu verwenden, um menschliche pluripotente Zellen zu erkennen und sie aus einer Probe von hPSC-abgeleiteten Zellen zu säubern, sollten ausgewählte Antikörper nicht auch mit Antigenen auf die spezifischen differenzierten Zelltypen reagieren, die für die Transplantation bestimmt sind. Leider gibt es eine begrenzte Anzahl von Antikörpern, die Zelloberflächenmarker auf Live-hPSCs 4erkennen, wodurch die Auswahlmöglichkeiten eingeschränkt sind. Darüber hinaus haben einige Studien darauf hingewiesen, dass der Nachweis eines einzelnen Zell-Oberflächen-Markers nicht ausreicht, um alle hPSC zu eliminieren, was darauf hindeutet, dass jeder Versuch, alle pluripotenten Subpopulationen von hPSC zu beseitigen, sich auf Methoden stützen sollte, die zwei oder mehr Antikörper verwenden, die verschiedene Epitope erkennen, die durch hPSCs 9-10ausgedrückt werden. Wie bereits erwähnt, sind nur hPSC-abgeleitete Zellen, die als pluripotente Stammzellfreie Zellpopulationen bestimmt werden könnten, für eine menschliche Transplantation geeignet. Das Erreichen dieses Stringenzniveaus kann nicht mit einem einzigen Durchgang durch eine antikörpervermittelte Zellsortiertechnologie erreicht werden. Eine Rekulturierung der angereicherten Population differenzierter Zielzellen und nachfolgende Zellsortierungsrunden können erforderlich sein, um endgültig pluripotente stammzellfreie Proben zu erhalten.
In unserem Labor haben wir zwei hES-Zell-Oberflächen-Antikörper, TG30 (CD9) und GCTM-2, für den Nachweis lebender pluripotenter Zellen extensiv charakterisiert. Unsere Studien haben gezeigt, dass der kombinierte Nachweis von TG30 und GCTM-2 stark mit der Expression kanonischer Pluripotenzassoziierter Gene in den hESC-Linien 5-7korreliert. TG30/GCTM-2 FACS Immunprofiling hat immer wieder gezeigt, dass hESC-Kulturen einen quantitativen kontinuierlichen Gradienten des TG30/GCTM-2-Expressions 5-7darstellen. Wir haben willkürlich vier Populationen (P) von Zellen innerhalb dieses TG30/GCTM-2 Gradienten etabliert: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Unsere Charakterisierung dieser P4-, P5-, P6- und P7-Zellpopulationen hat gezeigt, dass die P6- und P7-Unterfraktionen eine große Anzahl von pluripotenzassoziierten Genen ausdrücken und effizient stammähnliche Kolonien bilden, wenn sie nach FACS 2-3rekultiviert werden. Andererseits exprimieren P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) eine große Anzahl von Differenzierungsmarkern und bilden die spontan differenzierten Zelltypen, die typischerweise in expandierenden Kulturen der hESC-Linien 5-6vorkommen. Wir haben beschlossen, die Potenzialität unserer TG30/GCTM-2 FACS für die selektive Eliminierung von ResthPSC nach früherdischer Differenzierung und auch für die Anreicherung pluripotenter Stammzellpopulationen zu testen. Das unten beschriebene Protokoll zeigt, wie man differenzierte P4 -Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) nach FACS sammelt und rekultiviert, um die Reinigung von pluripotentem P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) zu erreichen. Darüber hinaus erklären wir auch die Sammlung und Rekultur von pluripotenten P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi), um eine angereicherte Kultur pluripotenter Zellen zu erhalten, die anschließend als definierte Inputpopulation verwendet werden könnten, um die Effizienz und Konsistenz von Differenzierungstests potenziell zu erhöhen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td>Langer Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nährstoffmischung F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>Langer Name: Knockout Serum Ersatz</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Langer Name: GlutaMAX Ergänzung</td></tr><tr><td>Nicht essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Langer Name: MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung</td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td>langer Name: 2-Mercaptoethanol</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td>langer Name: Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung, kein Kalzium, kein</td></tr><tr><td>Magnesium TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604039</td><td>langer Name: TrypLE Express (1x), kein Phenolrot</td></tr><tr><td>AF-488</td><td>Life Technologies</td><td>A21131</td><td>Langer Name: Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG2a</td></tr><tr><td>AF-647</td><td>Life Technologies</td><td>A21238</td><td>Langer Name: Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Maus IgM</td></tr><tr><td>PE-Anti IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>P21139</td><td>Langer Name: R-Phycoerythrin Ziege Anti-Maus IgG2a (&gamma; 2a) Konjugat</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Langer Name: Dulbecco's Modified Eagle Mittlerer</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Langer Name: Penicillin-Streptomycin,</td></tr><tr><td>flüssiges destilliertes Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089.</td><td>Langer Name: Steriles destilliertes Wasser</td></tr><tr><td>PI</td><td>SIGMA</td><td>P4864</td><td>Langer Name: Propidiumiodid-Lösung</td></tr><tr><td>FBS</td><td>SIGMA</td><td>12203C</td><td>Langer Name: Fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Langer Name: Gelatine aus Schweinehaut</td></tr><tr><td>Menschlicher FGF-2</td><td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>Langer Name: Fibroblasten-Wachstumsfaktor basisch, human rekombinant, tierversuchsfrei</td></tr><tr><td>Filter 0,22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>Langer Name: Stericup-GP, 0,22 &mu; M, Polyethersulfon, 250 ml, radiosterilisiert</td></tr><tr><td>70 &mu; m Zellsieb</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>Langer Name: Zellsieb mit 70 μm; m Nylon Mesh</td></tr><tr><td>35 &mu; m Deckel Zellsieb, 5 ml Röhrchen</td><td>Becton Dickinson 352235</td><td></td><td>Langer Name: 5 ml Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden, mit einer Kappe für ein Zellsieb (35 &mu; m)</td></tr><tr><td>5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>langer Name: 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, steriles</td></tr><tr><td>IgG2a-Isotyp-Kontrollröhr</td><td>Becton Dickinson</td><td>554126</td><td>langer Name: gereinigtes Maus-IgG2a &amppa; Isotyp-Kontrolle</td></tr><tr><td>IgM Isotyp-Kontrolle</td><td>Becton Dickinson</td><td>553472</td><td>langer Name: Purified Mouse IgM, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td></tr><tr><td>PE-CD90.2</td><td>Becton Dickinson</td><td>553014</td><td>Langer Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2</td></tr><tr><td>8-Peaks Kalibrierung</td><td>Becton Dickinson</td><td>559123</td><td>Langer Name: Rainbow Calibration Particles (8 Peaks)</td></tr><tr><td>50 ml steriles Polypropylen-Röhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Langer Name: 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden, Sterile</td></tr><tr><td>T75-Flasche</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Langer Name: CELLSTAR Filterkappe Zellkultur 75 cm2 Kolben</td></tr><tr><td>TG30</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4427</td><td>Langer Name: TG30 Antikörper, Klon TG30</td></tr><tr><td>GCTM-2</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4346</td><td>Langer Name: GCTM-2 ist nicht im Handel erhältlich, aber TG343 und äquivalenter monoklonaler Antikörper ist</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 4. Liste der Materialien und Reagenzien</td></tr><tr><td>FACS-Gerät</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>FACSVantage SE mit FACSDiva-Option</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX71<</td></tr><tr>td colspan="4">Table 5. Liste der Geräte.</td></tr></tbody></table>

anreicherung und reinigung menschlicher embryonaler stammzellen durch nachweis von zelloberflächenantigenen unter verwendung der monoklonalen antikörper tg30 und gctm-2

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Menschliche embryonale Stammzellen (hESC) können sich in vitrounbegrenzt selbst erneuern und mit den entsprechenden Hinweisen induziert werden, um sich in potenziell alle somatischen Zelllinien zu differenzieren. Differenzierte hESC-Derivate können möglicherweise in Transplantationstherapien zur Behandlung einer Vielzahl von zelldegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden. HESC-Differenzierungsprotokolle ergeben jedoch in der Regel eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie verbleibenden undifferenzierten Zellen. Für die Übersetzung differenzierter hESC-Derivate aus dem Labor in die Klinik ist es wichtig, zwischen undifferenzierten (pluripotenten) und differenzierten Zellen unterscheiden zu können und Methoden zur Trennung dieser Populationen zu generieren. Die sichere Anwendung von hESC-abgeleiteten somatischen Zelltypen kann nur mit pluripotenten Stammzellfreien Populationen erreicht werden, da Rest-HESCs nach der Transplantation Tumoren induzieren könnten, die als Teratome bekannt sind. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier eine Methodik zum Nachweis von pluripotenten TG30 Hi-GCTM-2 Hi hESCs mit positiver Selektion mit pluripotenten TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs. Mit Hilfe der negativen Selektion mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik konnten wir undifferenzierte hESCs in Populationen erkennen und säubern, die sehr früh gedifferenzierung erfahren (TG30Neg-GCTM-2Neg). In einer weiteren Studie bildeten pluripotente StammzellfreieProben von differenzierten TG30 Neg-GCTM-2Neg-Zellen, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll ausgewählt wurden, keine Teratome, sobald sie in immungeschwächte Mäuse transplantiert wurden, was die Robustheit unseres Protokolls unterstützt. Auf der anderen Seite, TG30/ GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Konsekutive TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs beeinträchtigte nicht ihre Fähigkeit, sich in vitro selbst zu erneuern oder ihre intrinsische Pluripotenz. Daher bieten die Eigenschaften unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik einen empfindlichen Test, um hoch angereicherte HPSC-Populationen als Inputs für Differenzierungstests zu erhalten und potenziell tumorigenic (oder Rest-) hESC von abgeleiteten Zellpopulationen zu befreien.

hESC-Derivate, die pluripotente Stammzellfrei sind, können durch konsekutives Passieren von Zellen aus der P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) Subfraktion erhalten werden.
Frühere Berichte haben festgestellt, dass in hESC-Standardkulturen eine Mischung von Subpopulationen koexistiert, die einen Expressionsgradienten von Genen aufweisen, die mit Pluripotenz assoziiert sind5,6,13. Der kombinierte Nachweis von Zelloberflächenantigenen wie TG30 (CD9) und GCTM-2 ermöglicht die Diskriminierung einer Reihe von Teilmengen von Zellen im pluripotenten Stadium und in verschiedenen Stadien der frühen Differenzierung, wie ihre Expression von Stammzellmarkern und linienspezifischen Transkriptionsfaktoren5,6,13anzeigt. In Übereinstimmung mit früheren Berichten konnten wir P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen in der hESC-MEL1-Linie für diese Studie(Abbildung 1) unterscheiden. Mit diesem Ergebnis sammelten wir differenzierte P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) und pluripotente P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) für weitere Kultur in den unten beschriebenen Studien.
Wir untersuchten, ob wir mit einem negativen Selektionsansatz undifferenzierte hESCs von Zellpopulationen säubern könnten, die sehr früh in der Differenzierung unterzogen werden (TG30Neg-GCTM-2Neg). Wir verwendeten eine definierte Anzahl von P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg), die nacheinander nach FACS (Abbildung 2A) für etwa zwei Wochen kultiviert wurden, und analysierten mit TG30/GCTM-2 FACS, bevor sie an jeder Passage replatiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die p4-Subfraktion, angereichert für TG30Neg-GCTM-2Neg differenzierte Zelltypen nach aufeinanderfolgenden Passaging, und eine geringfügige Anwesenheit von P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen in der Ersten Passage (Abbildung 2A, Passage 1) verschwand schließlich nach weiteren Passaging und wurde zu pluripotenten Stammzellen-freien Proben (Abbildung 2A, Passage 3).
Die Anreicherung pluripotenter hESC-Zellen kann durch die Entnahme von Zellen TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen erreicht werden.
Basierend auf früheren Beobachtungen, die diesen Test verwenden, würden wir eine Anreicherung von pluripotenten hESCs erwarten, indem wir P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen sammeln, die hESC-Kolonien bilden sollten. Daher haben wir auch TG30/GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Durchblutung von pluripotenten P7 -Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) untersucht. In diesen P7-Kulturen wurde die TG30/GCTM-2 FACS-Immunoprofilierung vor der Replatierung von Zellen an jedem Durchgang durchgeführt und nur P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) rekultiviert. Auf diese Weise beobachteten wir, dass die Mehrheit der Zellen in den Subfraktionen im Zusammenhang mit Pluripotenz (P6 und P7) lagen, was auf eine Anreicherung von pluripotenten Zellen hindeutet, die auch die Fähigkeit zur Differenzierung und Generierung eines kleinen Prozentsatzes von P4 -TG30 Neg-GCTM-2Neg)Zellen aufrechterhielten (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigten Kulturen von P7-Zellen eine große Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien während der Passierung (Abbildung 3B), was auch auf die Aufrechterhaltung des Pluripotenzzustands hindeutet.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg"> Abbildung 1. Repräsentative Sortierstrategie, um TG30/GCTM-2 FACS-Subfraktionen zu erhalten. (A): Dissoziierte hES-Zellsuspensionen werden als Einzelzellen sortiert und potenzielle Klumpen oder Doublets mit der Vorwärtsstreuung für Höhe und Fläche (FSC-H und FSC-A) abgegrenzt. (B): Potenzielle Trümmer werden mit FSC-A und SSC-A entfernt, und nur intakte Zellen werden weiter sortiert. (C): Nicht lebensfähige Zellen sind aufgrund von Propidiumjodid (PI) Fluoreszenz (FSC-A und FL3-A) ausgeschlossen. (D): MEF-Feederzellen wurden durch negative Selektion basierend auf der Expression von Maus-CD90.2-PE (FL2-A und SSC-A) abgegrenzt. (E): Die isolierte lebensfähige hESC-Fraktion, frei von MEF-Feedern, wird schließlich in P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Subpopulationen zerlegt. Das negative Gate (TG30Neg-GCTM-2Neg, genannt P4) wurde entsprechend der Hintergrund-Autofluoreszenz für die ungefärbten Zellen und auch für Isotyp-Kontrollen eingestellt. (F): Prozentsätze der verschiedenen Gated-Subpopulationen, die typisch für eine TG30/GCTM-2-Flow-Zytometrie-Analyse sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg"> Abbildung 2. Repräsentative aufeinanderfolgende Kulturen spontan differenzierter P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) aus der hESC-MEL1-Linie. (A): Repräsentative TG30/GCTM-2 FACS-Plots, die gated subsets von Zellen (P4, P5, P6 und P7) zeigen, die durch den Grad der nachgewiesenen Expression von TG30- und GCTM-2-Zelloberflächenmarkern diskriminiert werden. Eine anfängliche Population von 400.000 hESC-Derivaten mit P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) Immunoprofiling wird aus Massenkulturen der hESC-MEL1-Linie gesammelt. Diese P4 -(TG30Neg-GCTM-2Neg) Zellen werden nacheinander nach FACS unter Bedingungen, die für die hESC-Erneuerung in T75-Flaschen unterstützen, bis zum Erreichen der Konfluenz (11-13 Tage) durchgesieflimmert. Vor jeder Passage wird TG30/GCTM-2 FACS durchgeführt, um nur die p4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) differenzierten Zelltypen zu sammeln und zu rekulturieren. (B): Typische Morphologie des Rasens von differenzierten P4 -TG30Neg-GCTM-2Neg) Zellen nach 14 Tagen. (C): Sporadische hESC-ähnliche Kolonien, die nach 14 Tagen gesehen werden, vermischt mit dem Rasen von P4 -TG30Neg-GCTM-2Neg)Zellen nur in Durchgang 1, werden höchstwahrscheinlich durch kontaminierende P7 -Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) erzeugt. Skalenbalken = 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg"> Abbildung 3. P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen, die aus hESC-Linien abgeleitet sind, können nacheinander nach FACS durchgehend durchgehend werden, ohne ihre intrinsischen pluripotenten Eigenschaften zu verlieren. Vertreter TG30/GCTM-2 FACS-Immunoprofilierung der verschiedenen aufeinanderfolgenden Passagen, die die diskriminierten Teilmengen von Zellen (P4, P5, P6 und P7) nach dem Expressionsgrad von TG30 und GCTM-2 zeigen. (A): Eine Startpopulation von 400.000 Zellen mit P7-Eigenschaften (TG30Hi-GCTM-2Hi) wird aus Massenkulturen der hESC-MEL1-Linie abgerufen. Pluripotente P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) werden nacheinander nach FACS unter Bedingungen durchgesieht, die für die hESC-Erneuerung in T75-Flaschen unterstützen, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen (9-11 Tage). TG30/GCTM-2 FACS Immunprofilierung wird vor der Replatierung von Zellen an jedem Durchgang durchgeführt und nur die P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) Zellen werden rekultiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) ihre pluripotenten Eigenschaften mit anschließender Passaging erhalten, einschließlich der Konservierung des (TG30Hi-GCTM-2Hi) Ausdrucks, die hESC-ähnliche Kolonien bilden (siehe B) und die Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten, wie aus der Rekapitulation eines kleinen Bruchteils des differenzierten P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)in jedem der FACS abgeleitet werden kann. Skalenbalken = 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Probe (Reaktionsvolumen)</td>
			<td>Primärer Antikörper</td>
			<td>Sekundärer Antikörper</td>
			<td>PE Ratte Anti-Maus CD90.2 b</td>
			<td>Propidium Iodid c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortierprobe (ca. 9 ml für primäre ABs, 2,5 ml für sekundäre ABs)</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2) a
</td>
			<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a + AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-1: TG30 (200 l)</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-2: GCTM-2 (200 l)</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-3: Anti-Maus-CD90.2 (200 l)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-4: Phycoerythrin (PE) (200 l)</td>
			<td>Maus IgG2a Isotyp</td>
			<td>R-Phycoerythrin Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-5: Maus-Immunglobulin-Isotyp (200 l)</td>
			<td>Maus IgG2a Isotyp + IgM-Isotyp</td>
			<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a + AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steuerung-6: Ungefärbte Zellen (200 l)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Sortieren Sie Beispiel und Steuerelemente für die FACS-Sortierung. a Die Sortierprobe wird gleichzeitig mit TG30- und GCTM-2-Antikörpern immunstainiert. b PE-anti-mouse CD90.2 wird verwendet, um Mauszellen zu erkennen und MEFs von hESCs während FACS14zu entfernen. c Nicht lebensfähige Zellen sind mit Propidiumjodid in einer Endkonzentration von 0,3 g/ml ausgeschlossen. Reagenz hinzugefügt (+), nicht (-) zu Reaktionsrohr hinzugefügt.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Antikörper </td>
			<td>Host</td>
			<td>Isotyp</td>
			<td>Arbeitsverdünnung</td>
		</tr>
<tr>
<td>TG30 (1,4 mg/ml)</td>
			<td>Maus</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>GCTM-2 (Hybridonotant)</td>
			<td>Maus</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:5 bis 1:10 a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 647 Ziege Anti-Maus IgM</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Phycoerythrin (PE) Ziege Anti-Maus IgG2a</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Maus-CD90.2</td>
			<td>Ratte</td>
			<td>IgG2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gereinigte Maus IgG2a, Isotype-Steuerung</td>
			<td>Maus</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gereinigte Maus IgM, Isotype Control</td>
			<td>Maus</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Antikörperdetails und Verdünnungen für die FACS-Sortierung. a Aufgrund der extrem hohen Expression von GCTM-2 auf der Zelloberfläche von hESCs ist es nicht möglich, mit diesem Antikörper eine Sättigung zu erreichen. Jede Charge des GCTM-2-Hybridom-Überstandes muss mit einer Standardkontrolle oder einer früheren Charge titriert werden, um ähnliche Ergebnisse mit hESCs in der Skala zu erzielen und eine Überfärbung zu vermeiden.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Name des Mediums</td>
			<td>Zusammensetzung</td>
		</tr>
<tr>
<td>hESC/KOSR mittel</td>
			<td>Dulbecco es Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ergänzt durch 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Nonessential Amino Acids, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) und Pen/Strep bei 1x.</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEF mittel</td>
			<td>Dulbecco es Modified Eagle Medium, High Glucose (DMEM) ergänzt durch 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM GlutaMAX und Pen/Strep bei 1x.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Zusammensetzung der Kulturmedien.

Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.

Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Untergruppen humaner embryonaler Stammzellen nach ihrer Zelloberflächenantigenbindung der beiden monoklonalen Antikörper TG 30 und GC TM zu sortieren. Dies wird erreicht, indem zunächst humane embryonale Stammzell- oder HESC-Kulturen in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werden. Im zweiten Schritt werden die HESC mit den monoklonalen Antikörpern TG 30 und GCTM two gefärbt.Schließlich werden die Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung getrennt und in die Kultur zurückgeführt. Letztendlich kann die Fähigkeit der sortierten Zellen zur Koloniebildung mittels Durchflusszytometrie und Phasenkontrastmikroskopie beurteilt werden. Das Hauptbild dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der visuellen Beobachtung besteht darin, dass sie ein objektives Maß für die Pluripotenz von Zelle zu Zelle für eine große Anzahl von Zellen liefert, was die Trennung der embryonalen Stammzellen von den differenzierten Zellen erleichtert.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pluripotenz zu beantworten, z. B. wie sich Änderungen der Kulturbedingungen quantitativ auf verschiedene humane embryonale Stammzellen und humane induzierte pluripotente Stammzelllinien auswirken. Um eine Hess-Einzelzellsuspension herzustellen, beginnen Sie mit dem Aspirieren des Hess-Kulturmediums aus zwei T 75-Flaschen, die eine kultivierte Hess-Zelllinie enthalten. Waschen Sie jeden Kolben mit 10 Millilitern DPBS und inkubieren Sie dann jede Kultur mit drei Millilitern Triple E exprimierter Dissoziationslösung bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.Nach fünf Minuten stoßen Sie die Seite des Kolbens an, um die Zellen zu lösen, und bestätigen Sie dann die Ablösung unter dem Mikroskop. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Kaltkulturmedium mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette in jeden Kolben. Die dissoziierten Zellen werden mehrmals vorsichtig gegen die Kolbenwand tritriert, um eine überwiegend einzelzellige Suspension zu erhalten.Nun werden die hes-Einzelzellsuspensionen durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein steriles 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen gepoolt, um Antigene auf der Oberfläche von Hess-Zellen zu färben. Zuerst wird Eloqua etwa 100.000 Zellen in 150 Mikroliter Medium in jeweils sechs 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Als nächstes inkubieren Sie die Kontrollröhrchen und die verbleibende Sortierprobe mit den primären Antikörpern von Interesse in endgültigen Reaktionsvolumina von 200 Mikrolitern bzw. etwa neun Millilitern in Nährmedien, einschließlich der Isotypkontrollen.Legen Sie die Röhrchen waagerecht auf Eis und mischen Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig auf einer Schaukelplattform. Nach dem Schleudern der Zellen wird der Überstand verworfen und die Sortierprobe in 20 Millilitern kaltem Kulturmedium und die Kontrollproben in 200 Mikrolitern desselben gewaschen. Inkubieren Sie nun die Sortierprobe in einem Endvolumen von 2,5 Millilitern mit den entsprechenden Sekundärantikörpern in Kaltkulturmedien und die Kontrollen in einem Endvolumen von 200 Mikrolitern desselben und geben Sie zu diesem Zeitpunkt ebenfalls frisch zubereiteten PE-Anti-US-Antikörper CD 90.2 in das entsprechende Kontrollröhrchen.Mischen Sie die Röhrchen erneut vorsichtig 30 Minuten lang auf einer Schaukelplattform waagerecht auf Eis. Nach dem Schleudern der Zellen wird die Sortierprobe erneut in 20 Millilitern kaltem Kulturmedium und die Kontrollen in 200 Mikrolitern resuspendiert und die Zellen zweimal in dem Medium gewaschen. Die Sortierprobe wird in zwei bis drei Millilitern kaltem Kulturmedium, das mit Propidiumiodid ergänzt ist, resuspendiert, und jede der Kontrollen, mit Ausnahme der ungefärbten Zellen, in 300 Mikrolitern desselben.Dann seihen Sie jede einzelne Zellsuspension durch ein 35-Mikron-Deckel-Zellsieb, das mit fünf Millilitern Polystyrol-Reagenzgläsern mit rundem Boden gekoppelt ist, und zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die verbleibende Zellsuspension auf den Siebdeckeln in die Röhrchen zu drücken. Klopfen Sie dann auf die Seiten der Röhrchen, um jede einzelne Zellsuspension wieder zu resuspendieren und die Zellen auf Eis zu legen. Richten Sie das Durchflusszytometer für TG 30 GCTM mit zwei fluoreszenzaktivierten Zellsortierungen so ein, dass die dissoziierten Hess-Zellsuspensionen als Einzelzellen angesteuert werden, um potenzielle Klumpen und Dubletten zu eliminieren.Entfernen Sie anschließend die potenziellen Ablagerungen mit den vorderen und seitlichen Streuschiebern, so dass nur die intakten Zellen sortiert werden. Schließen Sie dann die nicht lebensfähigen Zellen basierend auf ihrer Propidiumiodid-Expression aus. Die embryonalen Fibroblasten der Maus oder die Meth-Feeder-Zellen werden durch negative Selektion auf der Grundlage ihrer Expression von Maus-CD 90.2 pe ausgeschaltet.Stellen Sie den TG 30 G CTM auf zwei negative Gangarten ein, entsprechend der Hintergrund-Autofluoreszenz für die ungefärbten Zellen und auch den Isotypkontrollen. Die isolierte lebensfähige HESC-Fraktion, die frei von Meth-Feedern ist, kann dann schließlich in TG 30 negative GCT M, zwei negative TG 30 niedrige GCT M, zwei niedrige TG 30 mittlere GC TM TM zwei mittlere und TG 30 hohe GCTM zwei hohe Subpopulationen fraktioniert werden. Geben Sie nach dem Einrichten des Durchflusszytometers jeweils einen Milliliter Meth-konditioniertes Medium in zwei Fünf-Milliliter-Polystyrol-Reagenzgläser mit rundem Boden und legen Sie sie auf Eis.Dann werden jeweils 400.000 Zellen aus den differenzierten TG 30 negativen GC TM zwei negativen und der pluripotenten TG 30 hohen GCTM zwei hohen Zellfraktionen gewonnen. Nach dem Schleudern der Sammelröhrchen wird jedes Zellpellet in einem Milliliter voräquilibriertem MEF-konditioniertem Medium aufgehängt. Dann säen Sie einen voräquilibrierten Kolben mit einer Dicke von MEF und T 75 mit dem HESC aus jeder Fraktion in methkonditionierten Medien aus, inkubieren Sie die Zellkulturen bei 37 Grad Celsius bei 5 % CO2 und erfrischen Sie das Medium täglich für etwa zwei Wochen.Kulturen von pluripotenten TG 30 mit hohem GCTM zwei zeigen nach einer Woche humane stammähnliche Kolonien und erreichen nach neun bis 11 Tagen eine Flüssigkeit von etwa 80 %. Kulturen von TG 30 negativen GC TM zwei negativen Zellen wachsen meist als Rasen von Fibroblasten ähnlichen Zellen, die nach 11 bis 13 Tagen ihre Kofluenz erreichen. Der kombinierte Nachweis der Zelloberflächenantigene TG 30 und GC TM zwei ermöglicht die Unterscheidung einer Reihe von Zelluntergruppen im pluripotenten Stadium und in verschiedenen Stadien der frühen HESC-Differenzierung, wie durch ihre Expression von Stammzellmarkern und linienspezifischen Transkriptionsfaktoren in Übereinstimmung mit früheren Berichten angezeigt, die TG 30 GC TM zwei negative niedrige, mittlere und hohe Subfraktionen sind in der Lage, innerhalb der menschlichen embryonalen Stammzelle männlich unterschieden zu werden Eine Linie, die für diese Studie verwendet wird Hier werden die Prozentsätze der verschiedenen Gated-Subpopulationen, die für eine TG 30 GCTM Zwei-Durchflusszytometrie-Analyse typisch sind, in dem hier gezeigten Experiment gezeigt.Eine definierte Anzahl von TG 30 negativen GCT M zwei negativen Zellen wurde nach der Sortierung etwa zwei Wochen lang nacheinander kultiviert und dann nur die TG 30 negativen GCT M zwei negativen Fraktionen vor der Replatintierung gesammelt. Bei jeder Passage zeigen die Ergebnisse, dass die anfängliche TG 30 negative gct M zwei negative Unterfraktion für TG 30 negative GCT M zwei negative differenzierte Zellen nach aufeinanderfolgender Verpackung anreichert. Eine kleine Population von TG 30 hohen GCT M zwei hohen Zellen wird bei der ersten Passage nachgewiesen, verschwindet aber schließlich mit weiterer Verpackung, so dass nur pluripotente Stammzell-freie Proben übrig bleiben.Hier ist die typische Morphologie des Rasens von differenzierten TG 30 negativen GCT M zwei negativen Zellen nach 14 Tagen dargestellt. Es ist zu beachten, dass sich die sporadischen HESC-ähnlichen Kolonien, die nach 14 Tagen beobachtet wurden, mit den TG 30 negativen GC TM vermischten, zwei negativen Zellen, die höchstwahrscheinlich von den kontaminierenden TG 30 hohen GCT M zwei hohen Zellen erzeugt wurden. Beachten Sie, dass dies nur selten vorkommt und in der ersten Post-Facts-Passage auf der Grundlage früherer Beobachtungen mit diesem Assay erwartet wird, dass die Entnahme und Kultivierung von TG 30 hohen GCTM zwei hohen Zellen für koloniebildende pluripotente HSCs anreichern sollte.Daher wurde die aufeinanderfolgende Verpackung von pluripotenten TG 30 hohen GCTM zwei hohen Zellen nach Sortierung durch Durchflusszytometrie auch in diesen repräsentativen Kulturen untersucht, die Zellen wurden mit TG 30 und G CT M zwei faxsortiert, wobei nur die TG 30 hohen G CTM zwei hohen Zellen an jeder Passage ersetzt wurden. Auf diese Weise wurde beobachtet, dass sich die Mehrzahl der Zellen in den Unterfraktionen befand, die mit Pluripotenz assoziiert sind, was auf eine angereicherte Population pluripotenter Zellen hinweist, die auch die Fähigkeit zur Differenzierung und Regeneration eines kleinen Prozentsatzes von TG 30 negativen G CTM zwei negativen Zellen beibehält. Darüber hinaus weisen aufeinanderfolgende Kulturen von TG 30 mit hohem G CTM und zwei hochsortierten Zellen nach der Passage eine große Anzahl von HESC-ähnlichen Kolonien auf, was ebenfalls auf die Aufrechterhaltung des Pluripotenzzustands hinweist.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Faxgerät jedes Mal vor der Verwendung zu kalibrieren, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nach diesem Verfahren zu gewährleisten. Andere Methoden wie Microarrays, Sequenzierung des gesamten Genoms oder Teratome können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, wie z.B. sind diese Zellen wirklich pluripotent Nach ihrer Entwicklung? Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der induzierten pluripotenten Stammzellen den Weg, um die Sicherheit und Stabilität dieser Zellen im Vergleich zu menschlichen embryonalen Stammzellen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mischkulturen von humanen Enbr-Stammzellen sorgfältig vorbereitet und färbt, um sie für Periot-Zellen anzureichern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten mit der Sicherheitswerkbank der Klasse zwei bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.

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Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2 (Video) | JoVE Journal

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