Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Untergruppen humaner embryonaler Stammzellen nach ihrer Zelloberflächenantigenbindung der beiden monoklonalen Antikörper TG 30 und GC TM zu sortieren. Dies wird erreicht, indem zunächst humane embryonale Stammzell- oder HESC-Kulturen in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werden. Im zweiten Schritt werden die HESC mit den monoklonalen Antikörpern TG 30 und GCTM two gefärbt.

Schließlich werden die Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung getrennt und in die Kultur zurückgeführt. Letztendlich kann die Fähigkeit der sortierten Zellen zur Koloniebildung mittels Durchflusszytometrie und Phasenkontrastmikroskopie beurteilt werden. Das Hauptbild dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der visuellen Beobachtung besteht darin, dass sie ein objektives Maß für die Pluripotenz von Zelle zu Zelle für eine große Anzahl von Zellen liefert, was die Trennung der embryonalen Stammzellen von den differenzierten Zellen erleichtert.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pluripotenz zu beantworten, z. B. wie sich Änderungen der Kulturbedingungen quantitativ auf verschiedene humane embryonale Stammzellen und humane induzierte pluripotente Stammzelllinien auswirken. Um eine Hess-Einzelzellsuspension herzustellen, beginnen Sie mit dem Aspirieren des Hess-Kulturmediums aus zwei T 75-Flaschen, die eine kultivierte Hess-Zelllinie enthalten. Waschen Sie jeden Kolben mit 10 Millilitern DPBS und inkubieren Sie dann jede Kultur mit drei Millilitern Triple E exprimierter Dissoziationslösung bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Nach fünf Minuten stoßen Sie die Seite des Kolbens an, um die Zellen zu lösen, und bestätigen Sie dann die Ablösung unter dem Mikroskop. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Kaltkulturmedium mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette in jeden Kolben. Die dissoziierten Zellen werden mehrmals vorsichtig gegen die Kolbenwand tritriert, um eine überwiegend einzelzellige Suspension zu erhalten.

Nun werden die hes-Einzelzellsuspensionen durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein steriles 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen gepoolt, um Antigene auf der Oberfläche von Hess-Zellen zu färben. Zuerst wird Eloqua etwa 100.000 Zellen in 150 Mikroliter Medium in jeweils sechs 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Als nächstes inkubieren Sie die Kontrollröhrchen und die verbleibende Sortierprobe mit den primären Antikörpern von Interesse in endgültigen Reaktionsvolumina von 200 Mikrolitern bzw. etwa neun Millilitern in Nährmedien, einschließlich der Isotypkontrollen.

Legen Sie die Röhrchen waagerecht auf Eis und mischen Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig auf einer Schaukelplattform. Nach dem Schleudern der Zellen wird der Überstand verworfen und die Sortierprobe in 20 Millilitern kaltem Kulturmedium und die Kontrollproben in 200 Mikrolitern desselben gewaschen. Inkubieren Sie nun die Sortierprobe in einem Endvolumen von 2,5 Millilitern mit den entsprechenden Sekundärantikörpern in Kaltkulturmedien und die Kontrollen in einem Endvolumen von 200 Mikrolitern desselben und geben Sie zu diesem Zeitpunkt ebenfalls frisch zubereiteten PE-Anti-US-Antikörper CD 90.2 in das entsprechende Kontrollröhrchen.

Mischen Sie die Röhrchen erneut vorsichtig 30 Minuten lang auf einer Schaukelplattform waagerecht auf Eis. Nach dem Schleudern der Zellen wird die Sortierprobe erneut in 20 Millilitern kaltem Kulturmedium und die Kontrollen in 200 Mikrolitern resuspendiert und die Zellen zweimal in dem Medium gewaschen. Die Sortierprobe wird in zwei bis drei Millilitern kaltem Kulturmedium, das mit Propidiumiodid ergänzt ist, resuspendiert, und jede der Kontrollen, mit Ausnahme der ungefärbten Zellen, in 300 Mikrolitern desselben.

Dann seihen Sie jede einzelne Zellsuspension durch ein 35-Mikron-Deckel-Zellsieb, das mit fünf Millilitern Polystyrol-Reagenzgläsern mit rundem Boden gekoppelt ist, und zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die verbleibende Zellsuspension auf den Siebdeckeln in die Röhrchen zu drücken. Klopfen Sie dann auf die Seiten der Röhrchen, um jede einzelne Zellsuspension wieder zu resuspendieren und die Zellen auf Eis zu legen. Richten Sie das Durchflusszytometer für TG 30 GCTM mit zwei fluoreszenzaktivierten Zellsortierungen so ein, dass die dissoziierten Hess-Zellsuspensionen als Einzelzellen angesteuert werden, um potenzielle Klumpen und Dubletten zu eliminieren.

Entfernen Sie anschließend die potenziellen Ablagerungen mit den vorderen und seitlichen Streuschiebern, so dass nur die intakten Zellen sortiert werden. Schließen Sie dann die nicht lebensfähigen Zellen basierend auf ihrer Propidiumiodid-Expression aus. Die embryonalen Fibroblasten der Maus oder die Meth-Feeder-Zellen werden durch negative Selektion auf der Grundlage ihrer Expression von Maus-CD 90.2 pe ausgeschaltet.

Stellen Sie den TG 30 G CTM auf zwei negative Gangarten ein, entsprechend der Hintergrund-Autofluoreszenz für die ungefärbten Zellen und auch den Isotypkontrollen. Die isolierte lebensfähige HESC-Fraktion, die frei von Meth-Feedern ist, kann dann schließlich in TG 30 negative GCT M, zwei negative TG 30 niedrige GCT M, zwei niedrige TG 30 mittlere GC TM TM zwei mittlere und TG 30 hohe GCTM zwei hohe Subpopulationen fraktioniert werden. Geben Sie nach dem Einrichten des Durchflusszytometers jeweils einen Milliliter Meth-konditioniertes Medium in zwei Fünf-Milliliter-Polystyrol-Reagenzgläser mit rundem Boden und legen Sie sie auf Eis.

Dann werden jeweils 400.000 Zellen aus den differenzierten TG 30 negativen GC TM zwei negativen und der pluripotenten TG 30 hohen GCTM zwei hohen Zellfraktionen gewonnen. Nach dem Schleudern der Sammelröhrchen wird jedes Zellpellet in einem Milliliter voräquilibriertem MEF-konditioniertem Medium aufgehängt. Dann säen Sie einen voräquilibrierten Kolben mit einer Dicke von MEF und T 75 mit dem HESC aus jeder Fraktion in methkonditionierten Medien aus, inkubieren Sie die Zellkulturen bei 37 Grad Celsius bei 5 % CO2 und erfrischen Sie das Medium täglich für etwa zwei Wochen.

Kulturen von pluripotenten TG 30 mit hohem GCTM zwei zeigen nach einer Woche humane stammähnliche Kolonien und erreichen nach neun bis 11 Tagen eine Flüssigkeit von etwa 80 %. Kulturen von TG 30 negativen GC TM zwei negativen Zellen wachsen meist als Rasen von Fibroblasten ähnlichen Zellen, die nach 11 bis 13 Tagen ihre Kofluenz erreichen. Der kombinierte Nachweis der Zelloberflächenantigene TG 30 und GC TM zwei ermöglicht die Unterscheidung einer Reihe von Zelluntergruppen im pluripotenten Stadium und in verschiedenen Stadien der frühen HESC-Differenzierung, wie durch ihre Expression von Stammzellmarkern und linienspezifischen Transkriptionsfaktoren in Übereinstimmung mit früheren Berichten angezeigt, die TG 30 GC TM zwei negative niedrige, mittlere und hohe Subfraktionen sind in der Lage, innerhalb der menschlichen embryonalen Stammzelle männlich unterschieden zu werden Eine Linie, die für diese Studie verwendet wird Hier werden die Prozentsätze der verschiedenen Gated-Subpopulationen, die für eine TG 30 GCTM Zwei-Durchflusszytometrie-Analyse typisch sind, in dem hier gezeigten Experiment gezeigt.

Eine definierte Anzahl von TG 30 negativen GCT M zwei negativen Zellen wurde nach der Sortierung etwa zwei Wochen lang nacheinander kultiviert und dann nur die TG 30 negativen GCT M zwei negativen Fraktionen vor der Replatintierung gesammelt. Bei jeder Passage zeigen die Ergebnisse, dass die anfängliche TG 30 negative gct M zwei negative Unterfraktion für TG 30 negative GCT M zwei negative differenzierte Zellen nach aufeinanderfolgender Verpackung anreichert. Eine kleine Population von TG 30 hohen GCT M zwei hohen Zellen wird bei der ersten Passage nachgewiesen, verschwindet aber schließlich mit weiterer Verpackung, so dass nur pluripotente Stammzell-freie Proben übrig bleiben.

Hier ist die typische Morphologie des Rasens von differenzierten TG 30 negativen GCT M zwei negativen Zellen nach 14 Tagen dargestellt. Es ist zu beachten, dass sich die sporadischen HESC-ähnlichen Kolonien, die nach 14 Tagen beobachtet wurden, mit den TG 30 negativen GC TM vermischten, zwei negativen Zellen, die höchstwahrscheinlich von den kontaminierenden TG 30 hohen GCT M zwei hohen Zellen erzeugt wurden. Beachten Sie, dass dies nur selten vorkommt und in der ersten Post-Facts-Passage auf der Grundlage früherer Beobachtungen mit diesem Assay erwartet wird, dass die Entnahme und Kultivierung von TG 30 hohen GCTM zwei hohen Zellen für koloniebildende pluripotente HSCs anreichern sollte.

Daher wurde die aufeinanderfolgende Verpackung von pluripotenten TG 30 hohen GCTM zwei hohen Zellen nach Sortierung durch Durchflusszytometrie auch in diesen repräsentativen Kulturen untersucht, die Zellen wurden mit TG 30 und G CT M zwei faxsortiert, wobei nur die TG 30 hohen G CTM zwei hohen Zellen an jeder Passage ersetzt wurden. Auf diese Weise wurde beobachtet, dass sich die Mehrzahl der Zellen in den Unterfraktionen befand, die mit Pluripotenz assoziiert sind, was auf eine angereicherte Population pluripotenter Zellen hinweist, die auch die Fähigkeit zur Differenzierung und Regeneration eines kleinen Prozentsatzes von TG 30 negativen G CTM zwei negativen Zellen beibehält. Darüber hinaus weisen aufeinanderfolgende Kulturen von TG 30 mit hohem G CTM und zwei hochsortierten Zellen nach der Passage eine große Anzahl von HESC-ähnlichen Kolonien auf, was ebenfalls auf die Aufrechterhaltung des Pluripotenzzustands hinweist.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Faxgerät jedes Mal vor der Verwendung zu kalibrieren, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nach diesem Verfahren zu gewährleisten. Andere Methoden wie Microarrays, Sequenzierung des gesamten Genoms oder Teratome können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, wie z.B. sind diese Zellen wirklich pluripotent Nach ihrer Entwicklung? Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der induzierten pluripotenten Stammzellen den Weg, um die Sicherheit und Stabilität dieser Zellen im Vergleich zu menschlichen embryonalen Stammzellen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mischkulturen von humanen Enbr-Stammzellen sorgfältig vorbereitet und färbt, um sie für Periot-Zellen anzureichern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten mit der Sicherheitswerkbank der Klasse zwei bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.