Name: Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Kokultur-Screens und fluoreszierenden Reporterstämmen von Bacillus subtilis chemisch vermittelte Interaktionen zwischen Mikroben erkennen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Genexpressionsänderungen durch sekretierte Verbindungen.

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Der Autor dankt Roberto Kolter (Harvard Medical School) für seine wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Entwicklung dieser Kokultur Bildschirm. Sie hat auch dank Matthew Powers zum Lesen des Manuskripts für Klarheit und Chia Cheng-yi um Unterstützung bei der Erlangung Abbildung 6.

<ol><li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+microbial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li>
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<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
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<li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li>
<li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li>
<li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li>
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<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796(2012).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+culture+of+%27unculturable%27+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Eine der inhärenten Beschränkungen des Protokolls ist, dass es auf der Kultivierbarkeit von mikrobiellen Organismen beruht. Wie gut dokumentiert 24, die meisten mikrobiellen Lebens auf dem Planeten kann (noch) nicht unter den Kulturbedingungen bis heute erforscht angebaut werden. So wird eine große Anzahl von Interaktionen zwischen Mikrobenarten, die in natürlicher Umgebung auftreten, unerkannt mit diesem Ansatz. Da unser Wunsch ist es, die Existenz solcher Wechselwirkungen nicht nur zu identifizieren, dann a...

Wir interessieren uns für das Verständnis, wie die Metaboliten, die Bakterien absondern, beeinflussen die Physiologie und die Entwicklung der Nachbar Mikroben. Viele Metaboliten wurden für ihre bioaktiven Effekte auf andere Mikroben gekennzeichnet. Zwei gut beschriebenen Beispiele sind Antibiotika, die das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen und Quorum Sensing-Moleküle, die die globale Genexpression von anderen Mikroben zu ändern. Allerdings Bakterien produzieren viele andere kleine Molekül natürlichen Produkten, die keine bekannten Bioaktivitäten 1 haben. Wir vermuten, dass Bakterien entwickelt haben und erhalten die Möglichkeit, einige dieser Stoffwechselprodukte, weil sie es ihnen ermöglichen, die zelluläre Physiologie ihrer mikrobielle Nachbarn in den komplexen mikrobiellen Gemeinschaften, in dem die meisten Bakterien existieren modulieren. Bacillus subtilis Zelltypen Wir haben unsere Studien über chemisch vermittelte mikrobielle Interaktionen, die bacil beinhalten konzentriertlus subtilis. Dies ist nicht nur wegen ihres Status als den gram-positiven Bakterium Modell und den daraus resultierenden genetischen Werkzeuge für seine Betätigung zur Verfügung, sondern auch wegen seiner Fähigkeit, gekennzeichnet Zelltypen. Beispiele sind Zellen, die sind: Schwimmen, Herstellung der extrazellulären Matrix, die für robuste Biofilmbildung erforderlich ist; zuständigen aufnehmen DNA aus der Umgebung, und sporenbildenden, unter anderen zwei. Jeder dieser Zelltypen exprimiert ein Merkmal Transkriptions-Regulon, das sie physiologisch und / oder physikalisch von den genetisch identischen Geschwistern macht. Unter vielen Wachstumsbedingungen, mehreren Zelltypen existieren verschiedene Subpopulationen innerhalb einer einzigen Kolonie von B. subtilis-Zellen 3. Obwohl viele Arten von Bakterien können analog Zelltyp Heterogenität aufweisen, dieses Phänomen wurde besonders gut in B. studierte subtilis. Insbesondere sind Gene, die UPRInnerhalb jeder dieser spezifischen B egulated subtilis Zelltypen identifiziert worden. Identifizieren solcher hochregulierte Gene ist für die hier beschriebene Arbeit, weil viele dieser mikrobiellen Phänotypen von Interesse schwierig oder unmöglich direkt zu beobachten sind. Zum Beispiel können wir nicht visuell ein Merkmal zu erkennen, wie Schwimmen auf solide (1,5%)-Agar-Platten, auch wenn eine Subpopulation von B. subtilis-Zellen produzieren Geißeln unter diesen Bedingungen 3. Ein weiteres Beispiel ist Biofilmmatrix-Produktion. Matrixproduktion durch Koloniemorphologie sichtbar gemacht werden (wie es in makroskopisch faltige Kolonien führt), sondern nur auf bestimmte Wachstumsmedium, und erst nach mehreren Tagen des Wachstums 4. Doch wir wissen, welche Gene während der Differenzierung hochreguliert, können wir Transkriptions Reportern, die als Marker für zelluläre Differenzierung in diesen Zelltypen wirken zu konstruieren. Reporter-Konstrukte Diese Fluoreszenz transcriptional Reporter aus den Promotoren für die Zelltyp-spezifische Gene Antreiben der Herstellung eines Reportergens, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein ist. Beispiele umfassen P hag-YFP (zum Schwimmen Zellen), P Tapa-YFP (für Biofilm-Matrix-produzierenden Zellen) und P SSPB-YFP (für sporen Zellen), wobei P x die Promotorregion für die Gen-x. Diese Reporterkonstrukte werden in einem neutralen Locus auf Chromosom integriert (Fig. 1 und siehe unten), so daß das native Regelung der Phänotyp bleibt intakt. Aber jetzt, wenn eine Zelle diesen Phänotyp exprimiert, es drückt auch ein fluoreszierendes Protein. Dies stellt eine leicht visualisiert Auslesen der Aktivierung bestimmter phänotypisches Verhalten, so dass wir für diese Mikroben, die physiologische Reaktion zu aktivieren screenen. Obwohl solche Journalisten werden häufig in der Mikrobiologie eingesetzt, sie wurden nicht weitgehend Bildschirme identif angewendety metabolische Wechselwirkungen zwischen Mikroben vor dieser Methode wurde 5 beschrieben. Es gibt eine Anzahl von wichtigen Überlegungen bei der Gestaltung und Konstruktion von Zelltyp-spezifischen Reporterstämmen. Wir haben ausschließlich Transkriptions fluoreszierenden Reportern verwendet, obwohl andere Typen von Konstrukten sind sicherlich möglich. Wir raten von der Verwendung der translationalen Fusionen als Marker für Zelltyp Differenzierung in unserem Bildschirm, jedoch aus zwei Gründen: 1) der Wunsch, die nativen Zelltyp-spezifischen Protein unbeeindruckt lassen, und 2) die Erkenntnis, dass eine diffuse, Zell- breite Fluoreszenz wird leichter zu erkennen als in den Zellen lokalisiert puncta (gemeinsam mit translationale Fusionen). Reporter-Gen-Auswahl Nach der Entscheidung, die Transkription als Auslese verwenden, muss der Reporter-Gen ausgewählt werden (zB LacZ, Fluoreszenz oder Luciferase). LacZ hat den Vorteil, benötigen mindestens die SonderIzed Ausrüstung, um zu erkennen, aber es gibt eine viel höhere Wahrscheinlichkeit von Fehlalarmen unter Umwelt Mikroben. In unseren Händen, der Hintergrundpegel von Lac + Organismen unter Bodenmikroben war unerschwinglich hoch (&gt;&gt; 10% der Bodenmikroben waren blau (Lac +) auf der X-Gal-Platten, Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass durch Titrieren der Konzentration von X-gal in dem Medium, das könnte optimiert werden, um die Verwendung einer X-Gal-Reporter ermöglichen, obwohl wir nicht versucht dieses. Luciferase eine hohe Nachweisempfindlichkeit und ist die orthogonale Reporter: Es gibt nahezu keine Chance Umweltmikroben inhärent Leucht. Allerdings fanden wir es schwierig, Instrumentierung an unserer Hochschule, die Lumineszenzdetektion erlaubt über die gesamte Petrischalen zu identifizieren, da die meisten wurden entwickelt, um nur lokalisierte Bereiche in Multi-Well-Platten zu scannen. Es könnte auch Komplikationen bei der Visualisierung Leucht Kolonien in einer Weise, die auch erlaubt die gleichzeitige körperliche ist seinBildung von Ol-Organismen zu induzieren. Bei der Verwendung von Treuhändern kann dies möglich gemacht haben, haben wir entschieden, statt Transkriptions fluoreszierenden Reporter, die bewiesen wurden in B. arbeiten, verwenden subtilis, sofern ausreichende Nachweisempfindlichkeit und niedrige False-Positive-Raten unter den Bodenorganismen und erlaubt, von leicht verfügbaren Instrumente sowohl für die Visualisierung und Isolierungsverfahren zu verwenden. Fluorophor-Auswahl Die spezifische Fluorophor ausgewählt werden auf Ihrem Bakterienarten ab, die Agar-Nährmedium Sie verwenden, und die insbesondere Fluoreszenzfilter setzt Sie zur Verfügung haben. Mit unserer Messtechnik, haben wir festgestellt, dass sowohl die B. subtilis Kolonien selbst und die sie auf Agar zeigten weniger Hintergrundfluoreszenz gewachsen, wenn YFP (gelb fluoreszierendes Protein)-Filter verwendet wurden, so dass Reporter überlegen GFP (green fluorescent protein) in unseren Händen. Die Codon-Verwendung von fluoreszierenden Proteinen sindhäufig für Eukaryoten optimiert, so dass es wichtig ist, eine Fluorophor entweder aus der Literatur bekannt, in Ihrem Bakterienarten zu arbeiten, oder sie explizit über einen konstitutiven Promotor testen auswählen. Eine große Anzahl von sich ständig weiterentwickelnden fluoreszierenden Protein-Varianten sind derzeit verfügbar 6, die in einer Reihe von Quellen, 7,8, von denen einige Leitlinien ausdrücklich vor, auf die Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzprotein für Ihr Experiment 9 wurde bewertet haben. Promoter Auswahl Die Auswahl eines Promotors wird weitgehend auf Zelltyp oder Phänotyp von Interesse ab. Für Organismen wie B. subtilis wurden einige Zelltyp-spezifische Reportergene in der Literatur etabliert. Für andere Bakterienstämme, werden untersucht Mikroarray-oder Transkriptions Daten erforderlich sein, Informationen darüber, welche Gene stark unter den Bedingungen hochreguliert werden bieten, wo Ihr Zelltyp von Interesse is manifestierten. Eine aktuelle Studie katalogisiert die Transkription von B. subtilis unter 104 verschiedenen Wachstumsbedingungen mit 10 Fliesen-Microarrays. Dieses Papier bietet umfassende Informationen darüber, welche Gene sind stark unter verschiedenen Bedingungen hochreguliert, die von unschätzbarem Wert für weniger gut charakterisierten Phänotypen ist. Anstatt genaue Kartierung Promotorregionen für jedes Gen von Interesse, wir verwenden in der Regel einfach die Sequenz 200-500 bp stromaufwärts des Gens als Promotor. Der genaue Ablauf Länge ist abhängig von der genomischen Kontext: kürzere Regionen verwendet werden, wenn notwendig, um zu vermeiden, einschließlich der vor-kodierenden Regionen aus Nachbar offene Leserahmen. Neutral Loci und Integration Wie pflegen Sie die Reporter Konstrukt in Ihrem Bakterienstamm wird die letzte Frage bei der Gestaltung eines fluoreszierenden Transkriptions-Reporter-Stamm. In Bakterien sind die Gene von Interesse häufig beibehaltenauf Plasmiden mit antibiotischer Selektion. Jedoch kann es nicht möglich sein, während der Co-Kultur ohne Antibiotika töten die Umweltmikroben verwendet werden. Wenn Plasmide stabil in Ihrer Bakterienarten gehalten, kann es möglich sein, das Wachstum Ihres Bakterien, die ein Plasmid-borne Reporter in Gegenwart von Antibiotika, um Ihre Reporter für das Screening vorbereiten und dann zu beseitigen Antibiotika während der Co-Kultur selbst, in der Hoffnung, dass das Plasmid wird ausreichend aufrechterhalten werden, um Fluoreszenz zu ermöglichen. Allerdings, wenn Plasmide sind leicht in Ihre Bakterium verloren, oder werden unter Stressbedingungen verloren, wird dies nicht eine sinnvolle Option sein. In vielen Fällen ist die beste Lösung, um das Reporterkonstrukt auf dem bakteriellen Chromosom, das die stabile Aufrechterhaltung des Reporter auch in Abwesenheit von Selektion ermöglicht integrieren. Um für die Integration, um die normale Expression oder Regulation des Gens von Interesse nicht zu stören, empfehlen wir, in einer Eileiter Website integrieren auf dem Chromosom, dass CAn als handeln &quot;neutralen Ort&quot;. In B. subtilis diese Integrationsstellen sind Gene, die - wenn sie mutiert sind - vermitteln einen Phänotyp in bestimmten Minimalmedien (so dass Integranten ohne Antibiotika-Selektion identifiziert werden kann), aber nicht Wachstum oder Sporenbildung Raten in Rich-Media verändern und umfassen solche Gene als amyE, lacA, thrC pyrD, gltA und sacA (Fördern der Fähigkeit, Stärke zu nutzen, β-Galactosidasen, Threonin, Uracil, Glutamat und Saccharose, jeweils) 11-13. Während die Integration in diesen Genen haben viele Jahre zuverlässig in B verwendet wurde subtilis (insbesondere bei amyE und lacA) können ähnliche Wissen nicht für Gene, die in vielen anderen Bakterienarten zur Verfügung. Der Einsatz von Phagen-Bindungsstellen sind gute Alternativen für neutrale chromosomalen Integrationsstellen: Viele Spezies-spezifische 14-16, sowie allgemeine Integrationsstellen wie dem Tn7 Befestigungsstelle (att Tn7) habenidentifiziert worden, und in vielen Bakterienarten 17,18 für die Gen-Insertionen verwendet. Umweltmikroben Wir verwenden Boden als direkte Quelle von Umweltmikroben für unsere Co-Kultur-Bildschirm. Der Boden enthält eine große Vielfalt an Mikroorganismen, und viele dieser Organismen sind reich an natürlichen Produkten. Durch die Verwendung von flüssigen Suspensionen von Boden direkt auf Platten mit unseren Transkriptions fluoreszierenden Reporter-Stamm (ohne vorherige Isolierung von Bakterien aus dem Boden) gelegt, wir vereinfachen den experimentellen Ansatz. Der Boden kann entweder unmittelbar nach der Ernte verwendet werden oder bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung eingefroren werden. Sofortige Anwendung hat den Vorteil, dass eine größere Vielfalt von Mikroben kann möglicherweise aufgewachsen werden, einschließlich derjenigen, die nicht überleben Einfrieren gut. Es hat den Nachteil, dass die Konzentration der Anbaubodenorganismen aus diesen Proben nicht bekannt ist, die Anzahl von Siebplatten, die verwendet werden müssen. Delayed Verwendung hat den Vorteil, dass die KBE / ml für jeden Boden Quelle kann im Voraus bestimmt werden, so dass eine optimierte Anzahl der Kolonien, die auf jeder Bildschirmplatte angebaut werden. Allerdings erfordert es, dass die Bodenorganismen überlebensfähig Gefrierpunkt. Beachten Sie, dass die Diversifizierung der Induktor Pool wird (dh den Bodenquellen) untersucht zu sein scheint, bei der Identifizierung neuer Inter Wechselwirkungen als eingehende Screening auf demselben Boden effektiver: mehr phylogenetischen Vielfalt wurde in den in unserer Matrix-Bildschirm, wie Induktions identifizierten Hits beobachtet zusätzlichen Bodenquellen wurden anstatt Screening der gleichen Erde Quellen gründlicher (EA Shank und R. Kolter, Harvard Medical School, unveröffentlichte Ergebnisse) untersucht. Überblick Der Ansatz, den wir hier beschreiben, ist einfach in seiner technischen Anforderungen. Es beinhaltet: 1) Konstruktion eines fluoreszierenden Reporter-Transkriptions in B. subtilis oderandere Bakterienspezies von Interesse, 2) Identifizieren Bedingungen, unter denen der Reporter nicht aktiviert ist, 3) Herstellung von Aliquots dieser Reporter-Stamm und Organismen gescreent werden (in diesem Fall Erde, aber andere Quellen könnten stattdessen verwendet werden), 4) Mischen derselben zwei Sätze von Mikroben auf festen Medien, 5) Identifizierung und Isolierung von mutmaßlichen Induktion Organismen, und 6), die bestätigt, dass diese Organismen tatsächlich diesen Phänotyp in einem sekundären Bildschirm zu aktivieren. Einmal identifiziert, diese Organismen und deren Stoffwechsel uns mit chemischen Methoden, um bakterielle Verhalten modulieren, um bakteriellen Physiologie und mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen und möglicherweise handeln als neue Gerüste für zukünftige therapeutische Verbindungen.

<table><tbody><tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td><td>Jedes Spektralphotomer, das OD600 Absorptionswerte messen kann.</td></tr><tr><td>Luria Brühe, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>Alternative Medienquellen können notwendig sein.</td></tr><tr><td>Glasperlen, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Gelladespitzen, rund</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Glasstäbe</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzpräparierstereoskop</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Der Autor verwendete ein Präparierstereoskop Zeiss Stemi SV6 mit einer EXFO X-cite 120 Leuchtstofflichtquelle, einem Langpass-YFP-Filterwürfel, einem achromatischen 0,63X-Objektiv, 10X-Okularen und einem Axio HRC HR Digitalkamera. Der größte Teil der Abschirmung wurde mit der Fokussierbajonette bei 2,0-3,2X durchgeführt. Jedes Präparierstereoskop mit Fluoreszenzfähigkeit ist in Ordnung, vorausgesetzt, Sie haben die richtigen Filter für den FP, den Sie verwenden. Am besten ist es, wenn es einen Shutter gibt, mit dem Sie einfach zwischen Hellfeld und Fluoreszenz wechseln können, sowie einen Tisch, der eine Beleuchtung von oben und unten ermöglicht. Wenn Sie Bilder aufnehmen möchten, ist auch eine angeschlossene Kamera erforderlich.</td></tr></tbody></table>

mit cokultur zur erkennung chemisch vermittelte interspezies-interaktionen

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In der Natur, Bakterien existieren selten isoliert, sondern werden durch eine Vielfalt von anderen Mikroorganismen, die die lokale Umwelt zu verändern durch Sekretion von Metaboliten umgeben. Diese Metaboliten haben das Potenzial, die Physiologie und die Differenzierung ihrer mikrobielle Nachbarn modulieren und sind wahrscheinlich wichtige Faktoren bei der Errichtung und Instandhaltung von komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Wir haben eine Fluoreszenz-basierten Kokultur Bildschirm, um solche chemisch vermittelte mikrobielle Wechselwirkungen identifizieren. Der Bildschirm beinhaltet die Kombination eines fluoreszierenden Reporterstamm mit Transkriptionsumwelt Mikroben auf festen Medien und so die Kolonien in Co-Kultur wachsen. Die Leuchtstofftranskriptions Reporter ist so konzipiert, dass die gewählte Bakterienstamm fluoresziert, wenn es einen bestimmten Phänotyp von Interesse exprimieren (dh die Biofilmbildung, Sporenbildung, Virulenzfaktor Produktion, etc.) Screening ist unter Wachstumsbedingungen durchgeführt wheWieder dieser Phänotyp nicht exprimiert wird (und damit der Reporter-Stamm ist in der Regel nicht fluoreszierend). Wenn ein Umwelt Mikrobe sondert ein Metabolit, der diesen Phänotyp aktiviert, diffundiert es durch den Agar und aktiviert die fluoreszierenden Reporter-Konstrukt. Dies ermöglicht die Induzierung Metaboliten produzierenden Mikroben nachzuweisenden: sie sind nicht-fluoreszierenden Kolonien meisten proximal zu den fluoreszierenden Kolonien. Somit ermöglicht dieser Bildschirm die Ermittlung von Umwelt Mikroben, die diffusionsfähige Metaboliten, die eine bestimmte physiologische Reaktion in einem Reporterstamm aktivieren produzieren. Diese Publikation beschreibt, wie: a) wählen Sie die entsprechende Co-Kultur Screeningbedingungen, b) bereiten die Reporter und Umwelt Mikroben für Screening, c) führen die Co-Kultur-Bildschirm, d) zu isolieren mutmaßlichen Induktion Organismen, und e) bestätigen ihre Tätigkeit in einem zweiten Bildschirm. Wir haben diese Methode, um für Bodenorganismen, die Biofilmmatrix-Produktion in Bacillus subtilis aktivieren Bildschirm </em&gt;, aber wir diskutieren auch Überlegungen für die Anwendung dieses Ansatzes auf andere genetisch manipulierbaren Bakterien.

Dieser Bildschirm wurde verwendet, um Bodenorganismen zu identifizieren sezer Verbindungen, die die Physiologie von B. ändern subtilis. Die hier beschriebenen Ergebnisse konzentrieren sich auf die Matrix-produzierenden Zelltyp von B. subtilis, die das Protein und Exopolysaccharid, die für robuste Biofilmbildung in diesem Bakterium benötigt werden produziert. Wir haben uns für den Promotor des Tapa-sipW Tasa-Operon für unsere fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (P Tapa-YFP).</...

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroben zu identifizieren, die durch sezernierte Verbindungen vermittelt werden und zu Veränderungen in der bakteriellen Genexpression führen. Dies wird durch die Kultivierung eines Bakterienstamms, der einen fluoreszierenden transkriptionellen Reporter enthält, mit Umweltmikroben als Kolonien auf Agar-Petriplatten erreicht. Die orangefarbenen Kreise stellen Kolonien der Umweltmikroben dar.Während die blauen Kreise Kolonien des Reporters sind, ermöglicht das Wachstum auf festen Medien den Metaboliten, die diese Kolonien produzieren, durch den Agar zu diffundieren und die Genexpression in nahe gelegenen Reporterkolonien zu aktivieren. Die potentiellen Treffer, die hier mit Sternen angezeigt werden, sind jene Kolonien, die möglicherweise Verbindungen sezernieren, die die Genexpression im Reporter verändern. Diese Organismen werden aus den Co-Kultur-Siebplatten isoliert.Diese potentiellen Induktoren werden in einem zweiten Screen erneut getestet, um zu bestätigen, dass es sich um die Organismen handelt, die Moleküle sezernieren, die die bakterielle Genexpression im Reporter verändern. Obw

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Biology

Biologie

Quelle: Speare, L., et al. Coinkubationsassay zur Quantifizierung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Vibrio fischeri Isolaten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt einen Co-Inkubations-Assay, mit dem untersucht wird, wie Bakterienstämme in einer gemeinsamen Umgebung konkurrieren. Es wird in der Mikrobiologie häufig eingesetzt, um Mechanismen wie die kontaktabhängige oder kontaktunabhängige Abtötung zu identifizieren, die diese Wechselwirkungen antreiben.

Coinkubationsassay zur Untersuchung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen

Quelle: Nathoo, N., et al. Ein hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse der molekularen Interaktionen und Signalwege von Pflanzen und Mikroben. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video zeigt ein hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur Untersuchung von Pflanzen-Bakterien-Interaktionen unter sterilen Bedingungen. Die Pflanzensämlinge werden in ein steriles, saures Wachstumsmedium überführt, inkubiert und auf Kontamination untersucht, bevor sie mit...

Ein Co-Kultivierungssystem zur Untersuchung der molekularen Reaktionen von pflanzlichen Wirten und interagierenden Bakterien

Quelle: Temkin, M. I. et al. Hochdurchsatz-Kokultur-Assays zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert einen in-vitro-Test zur Untersuchung mikrobieller Interaktionen zwischen Corynebacterium propinquum und Staphylococcus in einer Kokultur.

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung mikrobieller Interaktionen in Kokultur

Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

Das beschriebene hydroponische Kokultivierungssystem unterstützt intakte Pflanzen mit Metallgittersieb und kokultiviert sie mit Bakterien. Pflanzengewebe, Bakterien und sezernierte Moleküle können dann separat für nachgeschaltete Analysen geerntet werden, wobei gleichzeitig die molekularen Reaktionen sowohl der Pflanzenwirte als auch der interagierenden Mikroben oder Mikrobiome untersucht werden können.

Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Die in diesem Protokoll vorgestellten Co-Kultur-Interaktions-Assays sind kostengünstig, hochdurchstöbet und einfach. Diese Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in der Kokultur zu beobachten, Interaktionsmuster zu identifizieren und das hemmende Potenzial eines mikrobiellen Stammes von Interesse gegen menschliche und ökologische Krankheitserreger zu charakterisieren.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Richtlinie für den Aufbau und die quantitative Überwachung von Co-Kulturen, einschließlich photoautotropher zuckersezernierender Cyanobakterien und heterotropher Hefen.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Erfahren Sie, wie Sie mit Kokultur-Screens und fluoreszierenden Reporterstämmen von Bacillus subtilis chemisch vermittelte Interaktionen zwischen Mikroben erkennen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Genexpressionsänderungen durch sekretierte Verbindungen.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

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