Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroben zu identifizieren, die durch sezernierte Verbindungen vermittelt werden und zu Veränderungen in der bakteriellen Genexpression führen. Dies wird durch die Kultivierung eines Bakterienstamms, der einen fluoreszierenden transkriptionellen Reporter enthält, mit Umweltmikroben als Kolonien auf Agar-Petriplatten erreicht. Die orangefarbenen Kreise stellen Kolonien der Umweltmikroben dar.

Während die blauen Kreise Kolonien des Reporters sind, ermöglicht das Wachstum auf festen Medien den Metaboliten, die diese Kolonien produzieren, durch den Agar zu diffundieren und die Genexpression in nahe gelegenen Reporterkolonien zu aktivieren. Die potentiellen Treffer, die hier mit Sternen angezeigt werden, sind jene Kolonien, die möglicherweise Verbindungen sezernieren, die die Genexpression im Reporter verändern. Diese Organismen werden aus den Co-Kultur-Siebplatten isoliert.

Diese potentiellen Induktoren werden in einem zweiten Screen erneut getestet, um zu bestätigen, dass es sich um die Organismen handelt, die Moleküle sezernieren, die die bakterielle Genexpression im Reporter verändern. Obwohl diese Methode einen Einblick in die biofilmbildenden Wechselwirkungen von Bacillus subtles mit Bodenorganismen bietet, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. mikrobielle Interaktionen, die die Virulenzexpression bei Staphylokokken- oder Pseudomona-Arten beeinflussen. In der Tat kann es theoretisch angewendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen zu identifizieren, die die Genexpression für jeden Reporter in jeder genetisch manipulierbaren Mikrobe verändern. Nachdem Sie fluoreszierende Reporterkonstrukte für Ihren Organismus Ihrer Wahl gemäß dem Textprotokoll erzeugt haben, sammeln Sie Erde, indem Sie die oberen 0,5 Zentimeter des freiliegenden Oberflächenbodens entfernen, bevor Sie einen Spatel verwenden, um Erde und konische Röhren zu sammeln. Fügen Sie 0,85 % sterile Kochsalzlösung in einem Verhältnis von 10 Millilitern pro Gramm Erde hinzu, um eine Bodenaufschlämmung herzustellen, und wirbeln Sie sie eine Minute lang ein, um die Bakterien aus den Bodenpartikeln zu entfernen.

Nachdem sich die Bodenaufschlämmung eine Minute lang abgesetzt hat, überführen Sie die obere wässrige Schicht in ein frisches Röhrchen, verdünnen Sie die Reporter- und Bodenproben gemäß dem Textprotokoll und geben Sie jeweils 50 Mikroliter auf die Mitte der Co-Kultur-Siebplatten unter Bedingungen, die das Reporterkonstrukt allein nicht aktivieren. Plattieren Sie auch eine Bodenprobe allein und einen Reporter allein als Kontrollen. Geben Sie etwa 23 Millimeter sterile Glasperlen auf jede Platte und verteilen Sie die Zellen, indem Sie die Platten auf der Tischplatte halten und hin und her schütteln.

Während du drehst, bis die Flüssigkeit absorbiert ist, drehe die Platten um und entsorge die Kügelchen in ein Becherglas mit Ethanol. Nachdem Sie die Co-Kulturplatten mit Fluoreszenz inkubiert haben und von der Oberseite der Platte aus beginnen, bewegen Sie die Platte langsam über das Sichtfeld hin und her zu hellen Flecken. Drehen Sie die Platte nach einem vollständigen Durchzug um 90 Grad und wiederholen Sie den Vorgang.

Wenn ein Fluoreszenzfleck erkannt wird, schalten Sie langsam die Hellfeldbeleuchtung ein und stellen Sie fest, ob die Fluoreszenz mit einer Bakterienkolonie verbunden ist. Zur Isolierung von mutmaßlich induzierenden Organismen, bei denen es sich um die nicht fluoreszierenden Kolonien proximal zu den fluoreszierenden Kolonien handelt. Positionieren Sie sie in der Mitte des Sichtfeldes und sind mit Ihrer dominanten Hand erreichbar, während Sie die Leuchtstofflampe eingeschaltet lassen.

Schalten Sie das Hellfeld langsam ein, um die fluoreszierende Kolonie und die umgebenden induzierenden Organismen anhand von Form und Position zu identifizieren. Nehmen Sie mit einem Glasstab eine sterile runde 200-Mikroliter-Gelladespitze auf und halten Sie sie wie einen Bleistift. Legen Sie Ihre äußere Handfläche gegen die Bühne, um sie auf der Arbeitsfläche zu stabilisieren. Legen Sie dann Ihre andere Hand auf die innere Daumenseite Ihrer Hand, um das Pickwerkzeug zu stabilisieren, und halten Sie die Pipettenspitze über der Plattenoberfläche.

Schiebe sie in das Sichtfeld und zentriere sie über der Kolonie, die du auswählen möchtest. Der Tipp wird unscharf sein. Schwenken Sie die Pipettenspitze mit der äußeren Kante Ihrer Hand langsam nach unten zu der Kolonie, die entnommen werden soll.

Berühren Sie es ganz leicht und versuchen Sie, die Anzahl der anderen Kolonien, die die Spitze berührt, zu minimieren, ohne das Pickwerkzeug zu drehen. Streichen Sie die Spitze auf einen Teil eines frischen Tellers. Nach der Entnahme der Kolonien sind die Platten gemäß den Assay-Richtlinien zu inkubieren.

Wenn Kolonien sichtbar sind, verwenden Sie ein Stereoskop, um festzustellen, ob einzelne oder mehrere Arten von Organismen auf der Platte wachsen. Streifen Sie jeden Morphotyp auf eine frische Platte und inkubieren Sie, bis er ausgewachsen ist. Um zu testen, ob mutmaßliche Induktoren echte Induktoren sind, bereiten Sie Rasenflächen des Reporters und der nicht fluoreszierenden Elternstämme vor. Nachdem die Platten getrocknet sind, verwenden Sie sterile Zahnstocher, um Zellen aus Testkolonien zu entnehmen.

Flicken Sie es auf eine leere Platte und dann auf die beiden Rasenplatten. Alternativ reanimation, suspendieren Sie die mutmaßlich induzierenden Organismen in einem Milliliter flüssigem Medium in einem sterilen plastischen Tierarzt und messen Sie die OD 600 der Suspensionen, nachdem Sie die OD jeder Suspension normalisiert haben, um zu einem OD 600 von 0,5 Spot zu gelangen, einen Mikroliter jeder Suspension auf jede der drei Platten. Nachdem Sie die Organismen wachsen ließen, verwenden Sie schließlich Fluoreszenz unter einem Präpariermikroskop, um mutmaßlich induzierende Organismen zu identifizieren, die den fluoreszierenden Reporterstamm aktivieren, aber nicht den elterlichen Kontrollstamm.

Der Screen wurde hier verwendet, um Bodenorganismen zu identifizieren, die Verbindungen sezernieren, die die Genexpression einer strukturellen Komponente der Biofilmmatrix in b-Feinstoffen mit Hilfe eines fluoreszierenden transkriptionellen Reporters verändern. Im Idealfall sollte jede Co-Kulturplatte ein Eins-zu-Eins-Verhältnis von Reporter- zu Bodenkolonien enthalten, bei denen es sich um eng beieinander liegende Einzelvölker handelt. Hier veranschaulichen wir, wie ein hohes Verhältnis von Reporterkolonien, die als blaue Kreise dargestellt sind, im Vergleich zu Bodenkolonien, die als braune Kreise dargestellt sind, das Vertrauen in die Lokalisierung des tatsächlich induzierenden Organismus aus Co-Kulturplatten erhöht.

Die induzierenden Bodenorganismen sezernieren Verbindungen, die den Reporter aktivieren. Mehrere Reporterkolonien werden auf der Platte induziert, wobei das höhere Reporter-Boden-Verhältnis die Identifizierung der wahren, rot dargestellten Induktoren von anderen mutmaßlichen Induktoren, die durch Sterne angezeigt werden, erleichtert. Der Nährstoffgehalt steuert das Ausmaß der Bildung von Wachstumskolonien, während die Verdünnung des Inokulums bestimmt, ob die entstehenden Völker angemessen verteilt werden.

Wie in dieser Co-Kultur zu sehen ist, produziert Bild B feinstofflich eine fluoreszierende Biofilmmatrix als Reaktion auf zahlreiche Mikroben aus dem Boden. Für die von uns untersuchten Böden hatten wir eine hohe Trefferquote für den Ptap A YFP-Matrixreporter. Dies steht im Gegensatz zu unseren unveröffentlichten Ergebnissen aus analogen Screenings.

Anhand der Sporulations- und Kompetenzreporter wurden nur wenige bis gar keine Treffer identifiziert. Daher sind die HI-Raten für verschiedene Zelltypen sehr variabel und können im Voraus schwer vorherzusagen sein. Hier sind zwei Beispiele für Co-Kultur-Screening-Platten vor und nach der Auswahl potenziell induzierender Kolonien zur Isolierung gezeigt.

Negative und positive Ergebnisse sowohl der Patch- als auch der Spot-Methode sind hier dargestellt, wobei etwa 50 % der in unserem Sekundärscreening untersuchten Völker richtig positiv waren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. die 16-s-SR-DNA-Sequenzierung zur Bestimmung der phylogenetischen Identität des induzierenden Organismus oder die Verwendung der HPLC-Massenspektrometrie in der NMR zur Bestimmung der chemischen Identität des Wirkstoffs.