Name: In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung der MexAB-Effluxpumpe von Pseudomonas aeruginosa mittels Liposomen-Rekonstitution. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung eines reversiblen Protonengradienten zur Analyse der Membranproteinaktivität.

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Diese Studie wurde von der Agence Nationale de la Recherche (ANR Projekt-2010-BLAN-1535) und durch einen Zuschuss von Region Ile-de-France (DIM-Malinf 110058) unterstützt.

1. Produktion von rekombinanten Proteinen <ol><li> Mexa, MexB aus Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Transformieren Sie die Plasmide, die MEXA und MexB Gene in einem E. coli-Produktionsstamm (zB C43 DE3). Platte auf LB-Agar-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. Wählen Sie eine einzelne Kolonie, um eine O / N Vorkultur zu impfen. Am nächsten Morgen, impfen die Vorkultur in 1 l LB und wachsen bei 37 ° C unter Rühren (240 UpM). </li><li> Sobald die Zellen die exponentielle Phase erreicht (OD 600 = 0,6-0,8) induziert mit 1 mM IPTG. Führen Induktions für 2-3 Stunden bei 30 ° C unter Rühren. </li><li> Zentrifugenzellen (9.000 × g für 20 min) und Resuspension in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. </li><li> Stören Zellen mit einer Französisch Presse (10.000 psi, 4 Pass). Entsorgen ungebrochen Zellen und Einschlusskörper durch Zentrifugation bei 9.000 g für 20 min. </li><li> Pellet-Membranen 1 h bei 100.000 xg und resuspend jedes Pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% Glycerin (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl. </li><li> Bestimmung der Gesamtmembranproteinkonzentration unter Verwendung des BCA-kolorimetrischen Assay und Solubilisierung der Membranen O / N bei 2% Dodecylmaltosid (DDM) in einem Endvolumen bestimmt, so daß Reinigungsmittel: Protein 1:1,5 (w / w). </li><li> Ultrazentrifuge bei 100.000 g für 1 Stunde an nicht gelösten und aggregiertes Material verwerfen. </li><li> Inkubieren der Überstand für 2 Stunden bei 4 ° C mit einer Nickel-Harz (Mexa Reinigung) oder einer Kobalt-Harz (MexB Reinigung) mit Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% Glycerin äquilibriert (w / v), 10 mM Imidazol, NaCl 500 mM, DDM 0,2%. </li><li> Gießen Sie den Harz in einer leeren Spalte. Sammeln Sie die Flow-Through. </li><li> Waschen des Harzes mit 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% Glycerin (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, DDM 0,2%, dann mit 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, Glycerin 5% (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. </li><li> Eluiere das protein mit 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% Glycerin (w / v), 300 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. </li><li> Konzentrieren des Proteins mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung auf 3 ml und Belastung einer Entsalzungssäule mit einem Imidazol-freiem Puffer äquilibriert. Kurz vor der Rekonstitution (siehe unten), Ultrazentrifugation der solubilisierten Proteine ​​(100.000 × g für 20 min), um von Lipiden und Proteinen unsolubilisierte loszuwerden. Dann konzentrieren, die das Protein wieder in 0,3 ml. </li></ol></li><li> Bakteriorhodopsin aus Halobacter salinarium <ol><li> Wachsen Halobacter salinarium Zellen unter Beleuchtung bei 37 ° C für 10 Tage in einem flüssigen Wachstumsmedium, das 4 M NaCl, 150 mM MgSO 4, 10 mM Citrat, 30 mM KCl, Hefeextrakt 5 g / l Pepton 5 g / L. </li><li> Stören Zellen durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser. </li><li> Reinige den Purpurmembran auf einem 30-40% (w / v) Saccharosegradienten (100.000 × g für 17 h). </li><li> Solubilisierung des Membransuspension mit 2% octylglucoside für 24 h bei 37 ° C (Volumen für die Solubilisierung, um die Membran bei einer 2:1 (w / w) Waschmittel resuspendieren: Protein-Verhältnis). Schätzen Sie die Konzentration der gelösten BR mit ε (570 nm) = 54000 M -1 cm -1. Kurz vor der Rekonstitution (siehe unten), Ultrazentrifugation des solubilisierten BR (100.000 × g für 20 min), um von Lipiden und Proteinen unsolubilisierte loszuwerden. Hinweis: Die nativen Membranen sind natürlich in BR angereichert, so dass keine weitere Reinigung erforderlich ist. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Proteo <ol><li> Liposomenbildung: Setzen 400 ul DOPC in Chloroform (25 mg / ml), gelöst in einem Becherglas und füge 1,5 mg Cholesterin als Pulver gelagert. Trocknet sie kurz vor Manipulation unter einer Stickstoff-oder Dampfdruck von mindestens 1 Stunde in einem Becherglas. Die DOPC-Cholesterin-Stoffmengenverhältnis 3,3:1. <ol><li> Nachdem sie getrocknet wurden, hydratisieren die Lipide mit 1 ml 25 mM HEPES pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM Pyranin. Die Suspension sollte in diesem Stadium trüb erscheinen. </li><li> Die Lösung wird für 10 min bei 37 ° C. Beschallen für 10 min bei 40 W mit 30 sec Puls, 30 s Pause Zyklen bei RT. Die Suspension sollte in dieser Phase klar erscheinen. </li><li> Um eine monodisperse Population von Liposomen zu erhalten, führen Sie zwei Zyklen der Extrusion und für jeden Zyklus, vorbei an der Liposomensuspension durch den Filter mindestens 11x. Für den ersten Zyklus, verwenden eine Membranporengröße von 200 nm und für den zweiten Zyklus, verwenden eine Membranporengröße von 100 nm auf. Dynamische Lichtstreuungsmessungen kann bei diesem Schritt durchgeführt, um die Homogenität der Suspension zu überprüfen. </li></ol></li><li> Protein-Aufnahme Prinzip: Membranproteine ​​können in Liposomen dank der machende Wirkung von Reinigungsmitteln aufgelöst werden. Detergens-solubilisierten Liposome mit dem Detergens-solubilisierten Membranproteins und die Bildung der p inkubiertroteoliposomes wird durch schnelle Beseitigung der Reinigungsmittel mit Polystyrol-Kügelchen 9 ausgelöst. <ol><li> In 28 mg Triton X-100 (0,56% endg.) und Inkubation O / N bei 4 ° C (der Solubilisierung Temperatur auf das Protein untersucht, angepasst werden). </li><li> Hinzufügen des Detergens-solubilisierten Protein (BR, MexB und Mexa) mit den Liposomen solubilisiert und Inkubation 15 min bei 4 ° C. Hinzufügen der Proteine ​​an solubilisierten Liposomensuspension in den folgenden Verhältnissen (w / w): Lipide / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5 und Lipide / BR = 30. </li><li> In Polystyrol-Kügelchen auf einen 30:1-Perlen: Reinigungsmittel-Verhältnis (w / w, wenn man bedenkt, das Gesamtgewicht des Reinigungsmittels, einschließlich Reinigungsmittel mit den gereinigten Proteinen aufgenommen) und Inkubation 5 Stunden, in der Dunkelheit (wegen der BR) bei RT unter leichtem Rühren. Vor dieser Prozedur, aktivieren Sie die BioBeads mit Methanol und Ethanol Inkubation und ausgiebig mit Wasser zu waschen. </li><li> Reinige den Proteo Protein und freien Substraten unter Verwendung einer PD-10Entsalzungssäule mit 25 mM HEPES pH 7, K 2 SO 4 äquilibriert, 100 mM MgCl 2 und 2 mM. </li><li> Bewahren Sie die Proteo bei 18 ° C in der Dunkelheit für bis zu 2-3 Wochen. </li></ol></li><li> Bewertung der Wirksamkeit der Rekonstitution auf Saccharosegradienten. Um zu überprüfen, dass sowohl die MexB und der BR in Liposomen rekonstituiert wurde, reinigen das Proteoliposom Suspension auf einem diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten. <ol><li> Die Proteo Sanft setzen sich auf einem Fünf-Schicht-Gradienten von Saccharose (60%, 20%, 10%, 5% und 2,5%, w / v). </li><li> Ultrazentrifuge für 17 h bei 100.000 xg (mit minimalen Beschleunigungs-und Verzögerungsraten). </li><li> Sorgfältig sammeln die verschiedenen Gradientenfraktionen (insbesondere die Schnittstellen zwischen jeder Schicht von Saccharose) und unter Verwendung von Coomassie-Färbung oder Western-Blot analysiert werden auf SDS-PAGE (10%). Aggregierten Proteine ​​werden an der Unterseite des Rohres festgestellt, während nonincorporated, Waschmittel-solubilisierten Proteine ​​werden an der Spitze gefundendas Rohr. Proteo und Liposomen werden in Saccharose-Schnittstellen, die ihre Eigendichte entsprechen gefunden. Leere Liposomen werden weiter oben in der Steigung als die Proteo erholt. </li></ol></li></ol> 3. Fluoreszenzmessung <ol><li> Fluoreszenzmessungen durchzuführen bei 25,0 ° C mit einem Spektrofluorometer, so dass für Dual-Wellenlängen-Messungen (Xe-Lampe, 150 W). Alternative Beleuchtungsperioden (BR mit Anregungs / Emissionswellenlängen von 550 nm / 550 nm zu aktivieren) und Fluoreszenzmessungen mit Anregungs / Emissionswellenlängen von 455 nm / 509 nm für 2 Sekunden, um die Fluoreszenz zu messen Pyranin. Einstellen der Anregungs-und Emissionsbandbreiten bis 5 nm aufweist. Führen die Messungen in der Anwesenheit von 50 nM Valinomycin, um die Bildung einer umgekehrten Membranpotential ΔΨ zu verhindern. Anmerkung: In der Tat, da der BR Protonen-Pumpen gibt es mehr positive Ladungen innerhalb der Liposomen als außerhalb. Diese GebührGradienten können mit Valinomycin verworfen werden, was eine selektive K +-Ionophor ist. Sobald auf die Liposomen-Suspension zugesetzt Valinomycin, ein hydrophobes Molekül, in die Liposomenmembran einzusetzen, passiv transportiert K +, und somit das Membranpotential abzuleiten ΔΨ. </li></ol>

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<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li>
</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bestimmung der Rekonstitution Membranproteintransport konzipiert. Einmal eingerichtet, führt das Protein Rekonstitution Messungen, die sehr reproduzierbar sind. Allerdings werden die genauen Bedingungen für die Rekonstitution des Proteins aus einem Protein zum anderen variieren. Viel Sorgfalt muss bei der Optimierung die folgenden Parameter beachtet werden: i) Qualität der Reinigung (Reinheit und Abwesenheit von aggregierten Material), ii) die Effizienz der Reinigungsmittel Solubilisierungsschritt (wenn möglich, niedrige cmc Reinigungsmittel bevorzugt werden, weil sie leichter zu bekommen der) zu befreien; iii) Desorption des Waschmittels (es ist beispielsweise möglich, die Verwendung von Polystyrolkügelchen mit einem Dialyseschritt zu kombinieren, aber dies kann die Geschwindigkeit der Desorption, ein kritischer Parameter für die anschließende Aktivität des Proteins beeinflussen, siehe Lit. [ 9]), iv) Wieder Lipid (die chemische Natur des Lipids, das Lipid zu Protein-Verhältnis, in Gegenwart einer zusätzlichen amphiphiles sind kritische Parameter, die verändert werden müssen und optimiert). Neben Temperatur und Inkubationszeit wirken sich auf alle diese Fragen. Die Qualitätskontrolle ist bei jedem Schritt der Rekonstitution so Ur. Von diesem Standpunkt aus gesehen, ist die Lichtstreuung eine sehr geeignete Technik, da sie eine schnelle, zerstörungsfreie und erfordert nur 20 ul der Probe bei einer Konzentration im mikromolaren Bereich. Sobald die Proteo gebildet werden, ist Saccharose-Gradienten auch eine große Hilfe, weil es den Weg in Richtung einer systematischen Überprüfung der Rekonstitution: qualitative (wird das Protein tatsächlich in der Liposomenmembran eingebettet) als auch quantitative (wie viele Protein in ein Liposom). Letzteres wäre durch die genaue Messung der Protein-und Lipidkonzentrationen behandelt werden. Unser Test nicht auf die Titration des Substrats selbst vertrauen und dies vermeidet unruhig Überlegungen zu möglichen Artefakt passive Diffusion von<html> das Molekül durch hydrophobe Partitionierung in den Membranen. Der Test nutzt Eigenschaften der Pyranin als zuverlässiger und quantitative Sonde zur Überwachung von pH-Änderungen. Unsere Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen mit einem anderen Verfahren, bei dem Protonengradienten Bildung wurde mit Valinomycin 10 erhalten, aber es ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Farbverlauf 11. Darüber hinaus kann die Protonengradienten genau abgestimmt werden, einfach durch Variieren der Konzentration des Puffers (für weitere Einzelheiten siehe Verchere et al. 12). In dem Verfahren wird eine Kontrollmessung zunächst in Abwesenheit des Substrats durchgeführt (dies ermöglicht den Zugang zu dem passiven Aktivität des Proteins). Die tatsächliche Membranprotein-Transporteraktivität wird gemessen, nachdem das Substrat in die gleiche Küvette hinzugefügt. Das ist wirklich ein Vorteil, weil das Experiment kann als eine echte, nicht mehrdeutig, Substrat-induzierte Ergebnis berücksichtigt werden. ent &quot;&gt; Das Protokoll könnte zu Hochdurchsatz-Medium (zum Beispiel 96-Mulden-Messungen) Automatisierung angepasst werden, da Beleuchtung der Probe löst die Reaktion. Automatisierung und Parallelisierung wäre in der Vorbereitung einen großen Stapel von Proteoliposom bestehen, und bei der Abgabe von Teilmengen in einer 96 Vertiefungen Platte. Substrate (und auch Inhibitoren) dann zugesetzt werden und nach der Inkubation in der Dunkelheit für 45 min wird die Platte, den Beleuchtungs / Pyranin Fluoreszenzmesszyklen auf einem Mikroplattenlesegerät unterzogen werden. Für weitere Informationen zu dem Protokoll werden die Leser aufgefordert, Verchere et al lesen. 12,13

Integrale Membranproteine ​​machen bis zu 30% der Gene in eukaryotischen Genomen codiert. Sie teilen zentrale Rollen wie gate keeping (Rezeptoren), Transportieren Nährstoffe, Ionen oder schädliche Verbindungen (Transporter) oder die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit über die Membran-Doppelschichten (Kanäle) unter allen lebenden Zellen ein. Efflux-Pumpen haben eine zentrale Rolle bei der Resistenz gegen Antibiotika-Therapie zwei. Die an der Gram-negativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa, die von einer äußeren Membran geschützt ist, werden Effluxtransporter als dreiseitige Systeme, bei denen MexB die Abflusspumpe in der inneren Membran befindet, arbeitet in Verbindung mit Mexa, einem periplasmatischen Protein und OprM, eine organisierte Außenmembran-Kanal. Die cytoplasmatische inneren Membranprotein wirkt als energieabhängige Pumpe mit breiter Substratspezifität. Das äußere Membranprotein fungiert als Porin während die dritte ist in den periplasmatischen Raum und ist gedacht, um den Komplex zu stabilisieren, <sbis&gt; 3. Im folgenden konzentrieren wir uns auf die Gestaltung eines funktionellen Assay für die Mexa MexB Anordnung. Strukturelle Informationen über die letzten 5 Jahre dank der X-ray Bestimmung der homologen Protein aus Escherichia coli AcrB 4-7 angesammelt. Zwar ist es zweifellos wichtig zu koppeln diese Informationen mit dynamischen und kinetischen Daten, die Gestaltung eines funktionellen Assays für dieses Transporters ist eine echte Herausforderung 8. In der Tat muss die Membranproteine ​​in einer membranartigen Umgebung gehalten werden, und ein geschlossenes Fach ist eine vektorielle Transport des Substrats erreicht werden beibehalten werden. Rekonstitution von Membranproteinen in Proteo wurde ausführlich vorgestellt und bewertet (siehe Rigaud und Levy 9). Solche Protokolle ermöglichen die Überwachung von Membranproteinen Aktivität, beispielsweise durch die folgenden Substrate durch die Liposomenmembran. In diesem Fall Einschränkungen ergeben sich aus der einV erfügbarkeit titrierbare Substrate (fluoreszierend, radioaktiv, etc.) und aus der Tatsache, dass sehr oft diese Substrate sind hydrophob und haben eine Tendenz, Membranen unabhängig von der Anwesenheit des Transporters zu überqueren. Als Alternative kann man die spektroskopische Variationen eines Berichts Farbstoff empfindlich auf chemische Veränderungen, die infolge des Transports auftreten, zu folgen. Wie oben angegeben, Protonen Energie Transport über MexB. Daher ist eine entsprechende Option, um die spektroskopischen Variationen eines pH-sensitiven Farbstoff Berichts pH-Schwankungen durch Protonen-Substrat-Transport angetrieben folgen überwachen. Die Auswahl eines fluoreszierenden Farbstoffes vermeidet Artefaktwirkungen aufgrund der hydrophoben Natur des Substrats. Eine weitere Schwierigkeit ist die Erzeugung eines Protonengradienten. Mehrere Protokolle können in der Literatur gefunden werden. Unter diesen ist die Verwendung von Valinomycin Technik weit verbreitet, aber wir haben gezeigt, dass es mühsam, 10-11 auszuführen. Darüber hinaus ist esnicht reproduzierbar und ist nicht reversibel. Wir haben uns auf die Verwendung von Bakteriorhodopsin (BR), einem lichtaktivierten Protonenpumpe von Halobacter salinarium, einem halophilen marinen Gram-negative obligat aerobe Archaeons gegriffen. Dieses Protein wird in Liposomen mit MexB coreconstituted und bei Beleuchtung, BR-Pumpen Protonen im Inneren der Liposomen und damit schafft die ApH (sauer innen) durch das Protein benötigt, um das Substrat 12-13 transportieren.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Invitrogen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>Pyranin (8- Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure)</td><td>Invitrogen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranosid)</td><td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Extruder-Kit (Extruder, gasdichte Hamilton-Spritzen)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbentien</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Chromatographie leere Säule</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Entsalzungssäulen</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>Dynamisches Lichtstreugerät</td><td>Wyatt Technology</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-untersuchung der mexab effluxpumpe von pseudomonas aeruginosa

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Es ist eine neue wissenschaftliche Notwendigkeit für zuverlässige Werkzeuge für die Überwachung von Membranproteintransport. Wir präsentieren eine Methode, die zur Wiederherstellung der Austausch-Pumpen aus dem Gram-negativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa in einer biomimetischen Umgebung, die für eine genaue Untersuchung ihrer Aktivität von Transport ermöglicht. Drei Voraussetzungen erfüllt sind: Kompartimentierung in einer Lipidumgebung, die Verwendung eines entsprechenden Index für den Transport, und die Erzeugung eines Protonengradienten. Die Membranproteintransporter in Liposomen mit Bakteriorhodopsin eines lichtaktivierten Protonenpumpe, die einen Protonengradienten, die sowohl robust als auch reversibel und abstimmbar ist erzeugt rekonstituiert. Die Aktivität des Proteins wird von den pH-Schwankungen im Liposom auftretenden abgeleitet, mit Pyranin, eine pH-abhängige Fluoreszenzsonde. Wir beschreiben eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, bei dem Membranproteinreinigung, Liposomenbildung, Protein-Rekonstitution und Transport einnalyse angesprochen. Obwohl sie speziell für ein RND-Transporter entwickelt, könnten die beschriebenen Verfahren möglicherweise für die Verwendung mit einem anderen Membranprotein-Transporter von einem Protonengradienten erregt angepasst werden.

Der Test besteht aus der Überwachung Pyraninmarkiertes Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit während eine Protonengradienten erzeugt. Zu diesem Zweck werden Proben alternativ Beleuchtungs (daher Protonenpumpen vom BR ausgelöst wird) unterzogen und dann einer Messung der Fluoreszenz unter Verwendung von Anregungs-und Emissionswellenlängen von Pyranin (λ ex = 455 nm und λ em = 509 nm). Figur 1 zeigt ein repräsentatives Steuer mit dem Assay erhaltenen, in Abwesenheit von Mexa / MexB, Verifizieren, dass das Protonengradienten durch die BR erzeugt ist reversibel. Nach einem Zyklus von Versauerung, sind Proteo im Dunkeln für 45 min, damit der BR gehalten zu stoppen Pumpen Protonen (Protonen nach ihrem Konzentrationsgefälle diffundieren langsam und passiv durch Lipiddoppelschichten). Nach dieser Erholungszeit ist die Aktivierung von BR möglich, einfach durch die Beleuchtung die gleiche Suspension wieder. Figur 2entspricht einer tatsächlichen Verkehrsmessung. Eine negative Kontrolle mit Protein-freien Liposomen zeigt, dass, wie erwartet, bei konstanter Beleuchtung (Fig. 2A und 2B, orange Kreise) ist der pH-Wert. Jedoch Proteo enthaltenden BR in ihren Membranen keine Protonenpumpe, wodurch der pH-Wert im Inneren der Liposomen ab, und ein stabiler Gradient aufgebaut ist (Fig. 2A und 2B, lila Quadrate). Graue Dreiecke und roten Diamanten (2A) darstellen pH Innenseite Proteo BR und MexB enthält, in Gegenwart oder in Abwesenheit von Hoechst 33342, auf. Wir beobachten eine Substrat-unabhängige Aktivität, wo der Protonen-Gradient wird nur teilweise durch MexB Gegenverkehr abgebaut. Wir führen diese Beobachtung auf eine basale Aktivität MexB. Um die Wirkung der Mexa auf die Aktivität MexB testen, Mexa wurde der Rekonstitution zuerst in Abwesenheit von Substrat (hinzugefügt, <strong&gt; 2B, blaue Diamanten). Wiederum wird die Protonengradienten durch die BR erzeugt nur teilweise abgebaut. Der eigentliche Transport Messung basiert auf der gleichen Probe realisiert. Zuvor muss der Protonengradienten neu initialisiert werden, und das Substrat muss in der Suspension, um seine Bindungsstelle im Protein erreicht zugesetzt werden. Zu diesem Zweck wird die Suspension in der Dunkelheit in Gegenwart des Substrats für 45 Min. inkubiert. Beim nachfolgenden Beleuchtungs, kann man sehen, dass die Protonengradienten durch die BR erzeugt wird nun vollständig durch MexAB (2B, grüne Dreiecke) abgeführt wird, als Folge der durch die Substrattransportpumpe. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Abbildung 1 Reversibilität der Protonengradienten durch BR-Beleuchtung gebaut: Pyranin fluorescence BR Proteoliposomen, gemessen als eine Funktion der Zeit. Von 0-15 min, BR-Pumpen Protonen als Folge der Lichtaktivierung. Von 15 bis 60 min, sind Proteo im Dunkeln inkubiert, während dieser Zeit, Protonen passiv aus den Liposomen bewegen, bis der pH-Wert und intravesikulären extravesikulären pH-Wert gleich sind. Von 60 bis 75 min, BR ist noch funktionsfähig und Pumpen Protonen bei Beleuchtung. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figur 2 Transport-Assay: Pyraninmarkiertes Fluoreszenz, in das entsprechende pH-Schwankungen als Funktion der Zeit A) pH-Wert innerhalb der Kontrollliposomen (orange Kreise), pH-Wert innerhalb von Proteo BR in der Membran (lila Quadrate) enthält, pH innen. von Proteo enthalten BR und MexB in der Membran ohne Hoechst 33342 (rot diamonds), pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten, BR und MexB in der Membran mit Hoechst 33342 (graue Dreiecke) B) pH-Wert innerhalb des Steuer Liposomen (orange Kreise);. pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten BR in der Membran (lila Quadrate), pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten BR, MexB und Mexa in der Membran ohne Hoechst 33342 (blaue Diamanten), pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten, BR, MexB und Mexa in der Membran mit Hoechst 33342 (grüne Dreiecke).

Wir stellen ein Protokoll für die in vitro Untersuchung der Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines robusten, reversibel und abstimmbare Protonengradienten in der Liposomenmembran und daher sollte anpassungsfähig an jede Membranprotein vom protomotive Kraft erregt werden.

In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den FLX pump me AB aus Pseudomonas aosa mit Hilfe eines Funktionstests zu untersuchen, der auf der Rekonstitution von Membranproteinen basiert. In Liposomen. Dies wird erreicht, indem zunächst Membranproteine überexprimiert und gereinigt werden, dann gemischtes B und bakterielles Rodin in Bakterienmembranproteinen aus den Membranen extrahiert und durch Affinitätschromatographie rein gereinigt werden.Der zweite Schritt besteht darin, Liposomen herzustellen, indem ein getrockneter Lipidfilm mit einem purinhaltigen Puffer kombiniert wird, was zur Bildung von Multilam-Vesikeln führt. Nach der Beschallung werden die Liposomen extrudiert, um eine homogene Population von Liposomen zu erhalten. Als nächstes werden Detergenzienmembranproteine und dann Polystyrolkügelchen zur Liposomenlösung hinzugefügt.Die hydrophoben Schwänze des Waschmittels absorbieren die Polystyrolkügelchen, so dass die Membranproteine dann das Waschmittelband lösen und in die Liposomenmembran eindringen können. Der letzte Schritt ist die Entfernung von nicht verkapseltem Purin. Indem die Protea-Liposomen auf einer Entsalzungssäule laufen, erreichen große Prot-Liposomen den Boden der Säule viel schneller als nicht verkapseltes Purin, das am oberen Ende der Säule festgeschnallt bleibt. Letztendlich werden protale Liposomen gesammelt und ihre Fluoreszenz verwendet, um die Mex AB-Aktivität durch die Änderung des pH-Werts zu untersuchen, die bei der Beleuchtung von bakteriellem Opsin entsteht.Rodin-Effekt-Pumpen sind Transporter, die die Antibiotikaresistenz fördern. Aufgrund der Erkennung und des Transports einer breiten Palette von Substraten aus allen Antibiotikafamilien besteht ein dringender Bedarf an neuen und zuverlässigen In-vitro-Aktivitätstests für Membranproteineffekte. Transporter. In der Tat würden solche Assays neue Einblicke in die molekularen Mechanismen des Transports bieten und das pharmakologische Screening neuer potenzieller Inhibitorkandidaten unterstützen. Wir konzentrieren uns auf den Mix a Mix, B-O-P-R-M, eFlex Perm von Pseudomona Gin.Wir präsentieren technische Ratschläge und Methoden, die erforderlich sind, um drei Anforderungen für die Entwicklung eines effizienten In-vitro-Funktionstests für das Mischen einer B-ffl-Pumpe zu erfüllen, einschließlich der Konstitution des Proteins in einer Membran, der Verwendung eines geschlossenen Kompartiments, das für den vektoriellen Transport des Substrats erforderlich ist, einer feinen Darstellung von Rauchabzügen und Matrize, die künstliche Effekte aufgrund der adro-Beschaffenheit des Substrats und der Erzeugung eines Proteingradienten vermeidet, der für die Mischung AB erforderlich ist Funktion. Die Stärke unseres Assays liegt in der Art und Weise, wie wir einen reproduzierbaren T-fähigen und reversiblen Pro-Gradienten erzeugen, um einen Delta-pH-Wert zu erzeugen, den wir nstitute Bacteria oder VR nennen, mit Mix AB in einer Liposomenmembran. BR ist ein Membranprotein, das aus der violetten Membran von aob salinium allic Marin gramnegative, obligat aerobe aans gereinigt wird.Bei Beleuchtung pumpt dieses Protein aktiv Proteine. Wenn BR also zusammen mit dem Protein im Liposom konstituiert wird, erzeugt die Eliminierung des Liposoms aufgrund des br, das Proteine in die Liposomen pumpt, einen Delta-pH-Wert. Die Herstellung von reinem und stabilem Proteinmaterial ist von größter Bedeutung.Das Reinigungsverfahren für Membranproteine macht B wurde in einer früheren Filmveröffentlichung von J ovy schön beschrieben, sowie in dem Textprotokoll, das dieses Video begleitet, in dem auch eine Beschreibung der Reinigung eines Membranproteinmixes A zu finden ist. Zur Herstellung von bakteriellem Rodin aus Halabach Salinium züchten Sie Halabach Saliniumzellen unter Beleuchtung bei 37 Grad Celsius für 10 Tage. Zerstören Sie die Zellen in einem flüssigen Wachstumsmedium, indem Sie gegen deionisiertes Wasser dialysieren. Reinigen Sie die violette Membran auf einem Saccharosegradienten von 30 bis 40 %.Als nächstes lösen Sie die Membransuspension mit 2%igem Oktalglukozid. Waren 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Schützen Sie die Röhre vor Licht, indem Sie sie in Alufolie einwickeln.Schätzen Sie die Konzentration von löslichen Bakterien oder Dosin unter Verwendung des im Textprotokoll aufgeführten Extinktionskoeffizienten kurz vor der Rekonstitution. Ultrazentrifugieren Sie das solubilizierte bakterielle Opsin, um Lipide loszuwerden und Proteine zu lösen. Um die Liposomen in einem Glaslautsprecher zuzubereiten, wiegen Sie 1,5 Milligramm Cholesterin ab, das als Pulver gelagert ist, und fügen Sie 400 Mikroliter Diol, Phosphatidylcholin oder DOPC, gelöst in Chloroform, in einem Glasbecherglas gelöst, und trocknen Sie sie mindestens eine Stunde lang unter Vakuum in einem Glasbecherglas, kurz bevor Sie sie manipulieren.Das resultierende molare Verhältnis von DOPC zu Cholesterin beträgt 3,3 zu eins. Nachdem sie die Lipide mit einem Milliliter Hebespuffer getrocknet haben, sollte die Suspension turid erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Lösung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erhitzt, 10 Minuten lang bei 40 Watt mit abwechselnden 32. Impuls- und 32. Pausenzyklen bei Raumtemperatur beschallt, die Suspension sollte klar erscheinen.In diesem Stadium besteht der kritischste Aspekt des Verfahrens darin, eine feste und monodispergierte Suspension von Liposomen zu erhalten. Um dies zu erreichen, legen wir bei der Einrichtung des zusätzlichen Rings äußerste Sorgfalt walten lassen, damit keine Leckage auftritt. Außerdem reinigen wir das Gerät nach jedem Gebrauch sehr sorgfältig.Um eine monodisperse Population von Liposomen zu erhalten, führen Sie für jeden Zyklus zwei Extrusionszyklen durch. Lassen Sie die Liposomensuspension mindestens 11 Mal durch den Filter. Verwenden Sie für den ersten Zyklus eine Membranporengröße von 200 Nanometern und für den zweiten Zyklus eine Membranporengröße von 100 Nanometern.An dieser Stelle können dynamische Lichtstreuungsmessungen durchgeführt werden, um die Homogenität der Suspension zu überprüfen. Hier sehen Sie ein typisches Ergebnis dieses Schritts. Membranproteine können in Liposomen aufgrund der löslichen Wirkung von Detergenzien rekonstituiert werden.Solubilisierte Liposomen werden mit dem Detergens solubilisiertes Membranprotein inkubiert und bilden die Protea. Liposomen werden durch eine schnelle Eliminierung des Reinigungsmittels mit Polystyrolkügelchen ausgelöst. Um Protein einzubauen, fügen Sie 28 Milligramm Tritton X 100 hinzu und inkubieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius.Geben Sie das lösliche Protein des Detergens, einschließlich der Bakterien Opsin Mex B und Mex A, zu den löslichen Liposomen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Fügen Sie zuvor aktivierte Styroporkügelchen hinzu. Fügen Sie ein Verhältnis von 30 zu eins zwischen Bienen und Waschmittel hinzu und inkubieren Sie fünf Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.Unter sanftem Rühren werden die Protia-Liposomen, das Protein und die freien Substrate mit einer PD 10-Entsalzungssäule gereinigt, die mit dem Hess-Puffer äquilibriert ist. Um zu überprüfen, ob sowohl das Mex B als auch das Bakterium Opsin in Liposomen rekonstituiert wurden, reinigen Sie die Protea-Liposomensuspension auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten. Setzen Sie das Proteosom vorsichtig auf einem fünflagigen Gradienten aus Saccharose ab.Nach der Ultra-Zentrifugation wird eine 17-stündige Ultrazentrifuge bei hunderttausend G durchgeführt, wobei sich aggregierte Proteine am Boden des Röhrchens befinden, während sich am oberen Rand des Röhrchens nicht eingebaute Detergenz-Solubilizenproteine befinden. Protea, Liposomen und Liposomen befinden sich an Saccharose-Grenzflächen, die ihrer intrinsischen Dichte entsprechen. Leere Liposomen werden weiter oben im Gradienten zurückgewonnen als die Prot-Liposomen.Sammeln Sie die verschiedenen Gradientenfraktionen sorgfältig, bevor Sie sie mit Natrium-Dylsulfat analysieren. Polyacrylamid-Gelelektrophorese mittels Kumasi-Färbung oder Western Blotting. Führen Sie Fluoreszenzmessungen bei 25 Grad Celsius mit einem spektralen Fluorimeter durch, das Messungen mit zwei Wellenlängen ermöglicht.Wechseln Sie die Beleuchtungsperioden zur Aktivierung von bakteriellem Rodin, das durch Anregungs- und Emissionswellenlängen von 550 Nanometern gekennzeichnet ist, mit Messungen der Purinfluoreszenz ab, die durch eine Anregungswellenlänge von 455 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 509 Nanometern für zwei Sekunden gekennzeichnet sind. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionsbandbreiten auf fünf Nanometer ein. Führen Sie die Messungen in Gegenwart von 50 nanomolaren Liny durch, um die Bildung eines umgekehrten Membranpotentials zu verhindern.Der hier gezeigte Delta-Seufzer ist eine repräsentative Kontrolle, die mit dem Assay in Abwesenheit von Mex a, Mex B erhalten wurde und bestätigt, dass der durch das bakterielle Stäbchen-Opsin erzeugte Protonengradient reversibel ist. Nach einem Ansäuerungszyklus werden Oreo-Liposomen 45 Minuten lang im Dunkeln gehalten, damit das Bakterium Opsin aufhört, Protonen zu pumpen. Nach dieser Erholungszeit ist die Aktivierung des Bakteriums Opsin einfach durch Beleuchten derselben Suspension möglich.Auch hier zeigt eine tatsächliche Transportmessung, dass eine Negativkontrolle mit proteinfreien Liposomen bei Beleuchtung erwartungsgemäß einen konstanten pH-Wert aufweist. Protea-Liposomen, die Bakterien oder Opsin in ihren Membranen enthalten, pumpen jedoch Protonen. Dadurch sinkt der pH-Wert im Inneren der Liposomen und es entsteht ein stabiler Gradient.Graue Dreiecke stellen den pH-Wert im Inneren von Protea-Liposomen dar, die Bakterien oder Opsin und Mex B in Gegenwart von Hoax. 3, 3, 3, 4, 2 Farbstoff enthalten. Während die roten Diamanten den pH-Wert in Abwesenheit des Farbstoffs darstellen, wird eine substratunabhängige Aktivität beobachtet, bei der ein Protonengradient nur teilweise durch den Mex B-Gegentransport abgebaut wird, was auf eine basale Aktivität von Mex zurückgeführt wird, B.In um die Wirkung von Mex A auf die Aktivität von Mex b zu testen, wurde Mex A zuerst zur Rekonstitution hinzugefügt.In Abwesenheit jeglichen Substrats wird der durch das bakterielle Opsin erzeugte Protonengradient wiederum nur teilweise abgebaut. Die eigentliche Transportmessung wird an derselben Probe durchgeführt, das Proton wird initialisiert und das Substrat wird in die Suspension gegeben, um seine Bindungsstelle im Protein zu erreichen. Bei der anschließenden Beleuchtung kann man sehen, dass der durch das bakterielle Opsin erzeugte Protonengradient nun von Mex AB als Folge des Substrattransports durch die Pumpe vollständig dissipiert wird. Es ist wichtig zu bedenken, dass die genauen Bedingungen, die für die Anpassung dieses Protokolls an ein anderes Protein erforderlich sind, von dem hier beschriebenen abweichen können.Bei der Optimierung der folgenden Parameter muss darauf geachtet werden: Qualität der Reinigung, Effizienz des Waschmittels, Desorption des Solubilisierungsschritts des Waschmittels, Lipidzusammensetzung und Lipid-Protein-Verhältnis. Darüber hinaus können Temperatur und Inkubationszeiten all diese Parameter beeinflussen. Unser Protokoll ebnet den Weg zu einem besseren Verständnis der Aktivität des r and d flix Pump Mix B. Nichtsdestotrotz, wenn es speziell für r und d Transporter verkauft wurde, könnte diese Methode an jeden PMF aktivierten FFL Spam Transporter angepasst werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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