Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung von Zell-Matrix-Interaktionen auf die Neuausrichtung von Fasern und die Umbauprozesse der Matrix in einem Fibrin-Gel-System zu beobachten und zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein dreidimensionales Fibrin-Gel, das Mikroperlen enthält, auf einer Deckglasoberfläche innerhalb eines umweltkontrollierten Bioreaktors polymerisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine hochkonzentrierte Zellsuspension herzustellen, mit deren Hilfe Fibroblastencluster oder X-Explantate in geometrischen Mustern auf der Oberfläche des Gels positioniert werden.

Anschließend wird die Probe im Verlauf von 48 Stunden alle 15 Minuten mittels Differentialinterferenzkontrastmikroskopie abgebildet. Der letzte Schritt besteht darin, das Ausmaß der Fibrin-Umorganisation und des Remodelings in Form von Dehnung aus verschiedenen Bereichen des Gels mithilfe der digitalen Bildkorrelation zu messen. Letztendlich ermöglicht dieses Explantatsystem, die Zellen in einfache geometrische Muster anzuordnen, was die Visualisierung und Untersuchung der Mechanismen zugrunde liegender, zellvermittelter Matrixumgestaltung und Faserneuausrichtung erleichtert.

Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der mechanischen Biologie beantworten, beispielsweise welche Auswirkungen räumlich und zeitlich präzise mechanische Reize auf das Zellverhalten und die daraus resultierenden Veränderungen in der umgebenden Gewebematrix haben. Gezeigt wird in diesem Verfahren Arabic de Jesus, eine Doktorandin aus meinem Labor. Lösen Sie Fibrinogen vorsichtig über Nacht bei 37 Grad Celsius in vorgewärmter Kochsalzlösung auf, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 33,3 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Bereiten Sie eine Schablone auf Perfil vor, um die Position jedes x-Explantats gemäß der gewünschten geometrischen Anordnung festzulegen.

Jeder Punkt etwa ein bis zwei Millimeter voneinander entfernt. Dieser Abstand entspricht einem idealen Abstand für die Erzeugung einer Faseranordnung zwischen Explantaten. Als Nächstes sämtliche Bestandteile des Bioreaktors mit 70 % Ethanol gründlich reinigen und die gereinigten Bestandteile vor der Inkubation zwei bis drei Stunden lang unter die UV-Strahlung einer Zellkulturhaube stellen.

Nachdem die Bestandteile des Bioreaktors sterilisiert wurden, befestigen Sie die Schablone mithilfe von Klebeband unterhalb des Bereichs der 60 Millimeter durchmessenden Deckglaskreisfläche, an der die Probe präpariert wird. Bereiten Sie anschließend die Mikroperlen-Suspension sowie Fibrinogen und Thrombin vor. Für die Stammlösungen werden 0,017 Milliliter der Mikroperlen-Stammlösung und 0,149 Milliliter DMEM in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert, um eine Konzentration von 10 Millionen Perlen pro Milliliter zu erreichen.

Anschließend die Suspension 10 Minuten lang beschallen, um die Perlen zu dispergieren und die Lösung zu homogenisieren. Geben Sie 0,22 Milliliter der Fibrinogen-Standardlösung zu 0,44 Milliliter 20 Millimolarer HEPES-Pufferlösung und 0,1667 Milliliter der Mikroperlenlösung in ein 15-Milliliter-Zentrifagenröhrchen. Die Komponenten vorsichtig mischen und das Röhrchen dann in ein separates 15-Milliliter-Zentrifagenröhrchen auf Eis stellen.

Gemischt. 32,8 µL Thrombin, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung mit 25 Einheiten pro Milliliter. 131 µL 20 mM HEPES-Puffer und 2,46 µL zweimolare Calciumchloridlösung.

Mischen Sie anschließend vorsichtig die vorbereiteten Thrombin- und Fibrinogenlösungen durch fünf bis zehnmaliges Auf- und Abpipettieren, bis die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Versuchen Sie, die Bildung von Blasen in der Mischung zu minimieren, indem Sie die Pipette beim Mischen nicht vollständig entleeren. Geben Sie die gemischte Lösung so schnell wie möglich in quadratische PDMS-Formen mit acht Millimetern Kantenlänge auf Deckgläsern und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur polymerisieren.

Die Zugabe von Thrombin bewirkt, dass die Lösung innerhalb von etwa 30 Sekunden nach der Polymerisation schnell verklebt. Verschließen Sie den Bioreaktor und bereiten Sie die Zell-Explantate vor, indem Sie 70 bis 90 % konfluente humane Dermalfibroblasten aus einem T-75-Fläschchen mit Trypsin lösen und fünf Minuten lang bei 200 × g zentrifugieren. Überführen Sie den Bioreaktor in einen Sicherheitswerkbank und entfernen Sie vorsichtig den Deckel unter aseptischen Bedingungen. Anschließend das Medium abpipettieren und das Zellpellet in DMEM mit 10 % FBS auf eine Endkonzentration von 20 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendieren.

Als Nächstes erzeugen Sie Explantate, indem Sie Zellen in eine Mikropipette laden und 0,3 µL der Zellsuspension in das polymerisierte Fibrin-Gel injizieren. Gemäß dem Muster auf der Schablone sollte jedes Explantat etwa 6.000 Zellen enthalten. Sobald die Explantate auf dem Gel positioniert sind, verschließen Sie den Bioreaktor.

Als Nächstes die Heizblöcke einsetzen und die Thermoelemente mit dem Temperaturregler verbinden. Den Temperaturregler auf 37 Grad Celsius einstellen und die Gele eine Stunde lang inkubieren, damit sich die Zellen absetzen und an der Fibrinmatrix anheften können. Anschließend etwa fünf Milliliter DMEM, das zwei bis drei Stunden lang mit 5 % Kohlendioxid konditioniert und mit 10 % fetalem Kälberserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 0,1 % Amphotericin B und 10 Mikrogramm pro Milliliter Aprotinin ergänzt wurde, direkt in die Bioreaktorkammer geben.

Danach den Bioreaktor erneut verschließen. Mit einer Spritze weitere fünf Milliliter mit Kohlendioxid konditioniertes Medium über die Anschlussöffnung am Einlassport zuführen, um den Bioreaktor vollständig zu füllen, und sorgfältig entstehende Blasen entfernen. Eine Spritzenpumpe mit einer 10-Milliliter- oder 30-Milliliter-Spritze, die mit zusätzlichem, mit 5 % Kohlendioxid konditioniertem Medium gefüllt ist, bereitstellen. Die Spritze direkt mit dem Einlassport am Bioreaktordeckel über steriles Schlauchmaterial mit Luer-Lock-Verbindung anschließen.

Stellen Sie die Perfusionsrate der Spritzenpumpe auf 0,01 Milliliter pro Minute ein. Anschließend verbinden Sie modifizierte Tubing-Stücke mit beiden Auslassanschlüssen und führen die Enden in einen 100-Milliliter-Becher. Um Abfall zu sammeln, verwenden Sie einen Laborkreuztisch, um die Höhen der Einlass- und Auslassleitungen so einzustellen, dass sich kein Druckunterschied im Bioreaktor-Zulauf bildet.

Frisches, mit 5 % Kohlendioxid konditioniertes Medium kontinuierlich während des gesamten Experiments dem Bioreaktor zuführen. Um den pH-Wert zu stabilisieren, Nährstoffe bereitzustellen und Abfallprodukte zu entfernen, wird eine mit Medium gefüllte 10-Milliliter-Spritze etwa 16 Stunden lang ausreichen. Positionieren Sie das 20-XDIC-Objektiv unter der Sichtöffnung des Mikroskops und vergewissern Sie sich, dass Polarisator, Analysator und Prisma alle korrekt eingesetzt sind.

Öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware. Fokussieren Sie das Objektiv auf den Bereich zwischen den drei x explan und speichern Sie die X-, Y- und Z-Koordinaten dieses Ortes in der Bildgebungssoftware. Um den gesamten Bereich zwischen und um die x explan herum abzubilden, wählen Sie die Option zur Aufnahme eines großen Bildes und geben Sie die Größe des Bereichs an.

Dadurch wird die Aufnahme mehrerer Bilder um den angegebenen Bereich ermöglicht und ein großes, zusammengesetztes Bild erstellt. Stellen Sie die Lichtintensität und Belichtungszeit auf die niedrigsten möglichen Werte ein. Dies hilft, Zelltod durch Phototoxizität zu vermeiden, während weiterhin eine ausreichende Auflösung gegeben ist, um zwischen Zellen, Mikroperlen und Fibrinfasern unterscheiden zu können. Beachten Sie, dass in diesem speziellen Experiment die Fibrinfasern aufgrund der hohen Dichte an lichtstreuenden Perlen im Gel nicht sichtbar sind. Verringern Sie die Perlenkonzentration oder die Gelstärke, um Fibrinfasern beobachten zu können.

Als Nächstes beginnen Sie mit der Dehnungsverfolgung. Erstellen oder laden Sie zunächst benutzerdefinierten MATLAB-Code herunter und registrieren Sie anschließend die Bilder unter Verwendung von Mikroperlen im gesamten Gel als Referenzpunkte. Die Registrierung der Bilder stellt sicher, dass die Aufnahmen jedes Mal am exakt gleichen Ort erfolgen.

Die Faserneuausrichtung zwischen Explanten wurde beobachtet, indem alle 15 Minuten gekachelte Bilder aufgenommen wurden. Über einen Zeitraum von 48 Stunden wurden einzelne Bereiche aus den gekachelten Bildern extrahiert und mit dem Dehnungsverfolgungsalgorithmus analysiert. Um lokale Dehnungen anhand der Verschiebung von Mikroperlen zu messen, zeigen Konturplots die Verteilung der maximalen Hauptdehnung in dem Bereich der Faserneuausrichtung, der dem Strap entspricht.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa drei bis vier Stunden abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die fluoreszente Markierung von Kollagen und zytoskelettalen Proteinen sowie die Quantifizierung der Zellmigration durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche mechanobiologischen Signalwege an der Gewebeumgestaltung beteiligt sind und wie diese Prozesse durch verschiedene biochemische Substanzen moduliert werden.