Name: Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie Makrophagen-Aktivierungszustände schnell und kostengünstig analysiert. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung verschiedener Zustände durch spezifische Spektrenfingerabdrücke.

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Richard Ouedraogo wird durch ein Stipendium des Ministère de la Santé unterstützt (PHRC 2010). Wir danken Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops und Nicolas Amstrong für die technische Unterstützung.

Im vorliegenden Protokoll wird die Ganzzell-MALDI-TOF-Technik verwendet, um ein Massenspektrum zu erhalten, das als Fingerabdruck der Probe betrachtet wird. Eine bioinformatische Analyse ermöglichte den Vergleich und die Klassifizierung dieser Fingerabdrücke. Dieses Protokoll bestand aus drei Hauptteilen:
<ol>
	<li>Die Aufbereitung der biologischen Proben: Kontrollmakrophagen und Makrophagen, die mit verschiedenen Agonisten stimuliert wurden.</li>
	<li>Die Analyse jeder Art von Probe mit technischen Replikaten mittels Ganzzell-MALDI-TOF MS.</li>
	<li>Die bioinformatische Analyse von Rohdaten.</li>
</ol>
Bereiten Sie sterile Lösungen für die Zellisolierung und -kultur vor. Bereiten Sie alle Reagenzien vor und lagern Sie sie bei 4 °C
1. Präparation menschlicher Monozyten
<ol>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor. 55 ml Humanserum AB+ oder fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml der Antibiotikalösung (Penicillin in einer Dosis von 10.000 IE/ml und Streptomycin in einer Menge von 10.000 μg/ml; Endkonzentration von 100 IE/ml für Penicillin und 100 μg/ml für Streptomycin) zu RPMI 1640 Medium (500 ml) geben.
	<ol>
		<li>Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Leukopacks (Leukozytenkonzentraten).
		<ol>
			<li>Bereiten Sie 50 ml Röhrchen mit 15 ml Ficoll vor. Verdünnen Sie das Blut in Kochsalzlösung (vol/vol, 1/10). 30 ml verdünnte PBMC wie zuvor beschrieben auf Ficoll ablegen26.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie 20 min lang bei 700 x g. Rückgewinnung von PBMCs an der Grenzfläche zwischen Ficoll (Dichte von 1,077 g/ml) und verdünntem Plasma. PBMC in Kulturmedium verdünnen und 5 min bei 300 x g zentrifugieren.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie CD14+-Monozyten aus PBMCs mit magnetischen Beads her, die mit Anti-CD14-Antikörpern beschichtet sind. 
		Hinweis: Bewahren Sie Produkte und Zellen bei 4 °C auf, bis die Monozyten vorhanden sind.
		<ol>
			<li>Bereiten Sie einen Laufpuffer vor, der aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) besteht.</li>
			<li>Dissoziieren Sie pelletierte PBMCs (107 Zellen pro Assay) vorsichtig in 80 μl Laufpuffer.</li>
			<li>Geben Sie 20 μl CD14 MicroBeads zu PBMCs. PBMCs mischen und 15 min inkubieren. PBMCs mit 5 ml Laufpuffer waschen und bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Dissoziierte pelletierte PBMCs werden vorsichtig in 500 μl Laufpuffer für 108 PBMC dissoziiert. 
			Hinweis: 500 μl Laufpuffer für PBMC-Konzentrationen unter 108 PBMC verwenden.</li>
			<li>Fahren Sie mit der magnetischen Trennung fort. 
			Hinweis: Für weniger als 2 x 108 PBMCs ist die MS-Spalte zu verwenden. Für mehr als 2 x 108 PBMC und weniger als 2 x 109 PBMC ist die LS-Spalte zu verwenden.</li>
			<li>Spülen Sie die Vorsäule und die Säule mit laufendem Puffer (500 μl für die MS-Säule oder 3 ml für die LS-Säule). Fügen Sie PBMCs in die Vorspalte ein (warten Sie, bis unbeschriftete Zellen die Spalte durchlaufen haben). 3 Mal mit Laufpuffer spülen (500 μl für MS-Säule oder 3 ml für LS-Säule). Entfernen Sie die Vorsäule.</li>
			<li>Stellen Sie die Säule auf 15 ml Röhrchen. Geben Sie einen Laufpuffer (1 ml für die MS-Säule oder 5 ml für die LS-Säule) auf die Säule und eluieren Sie CD14+-Zellen, indem Sie einen Druck auf die Säule ausüben.</li>
			<li>Das Eluat bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. Das Monozytenpellet mit 10 ml Nährmedium waschen. 
			Hinweis: Analysieren Sie die Reinheit der Monozytenpräparation mit Anti-CD14-Antikörpern und Durchflusszytometrie (klassisch höher als 95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Differenzierung von Monozyten in Makrophagen.
	<ol>
		<li>Monozyten (10,6 Monozyten pro Vertiefung in 6-Well-Platten) werden in 3 ml Kulturmedium mit 10 % Humanserum AB+ bei 37 °C inkubiert. Ersetzen Sie nach 4 Tagen für weitere 3 Tage das Kulturmedium mit Humanserum durch 3 ml Kulturmedium mit 10 % FBS.</li>
		<li>Identifizieren Sie die erhaltene Zellpopulation als Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDMs) mittels Durchflusszytometrie (siehe Abbildung 1).
		<ol>
			<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium durch 3 ml PBS. Scrape MDMs mit einem Gummipolizisten und sammle MDM-Sperren. Bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Geben Sie PBS mit 2 % BSA zu pelletierten MDMs und rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf. Die Zellkonzentration (10,6 MDM in 200 ml PBS) wird angepasst und bei 4 °C inkubiert.</li>
			<li>10 ml Anti-CD14-Antikörper und 10 ml Anti-CD68-Antikörper in die MDM-Suspension geben und bei 4 °C für 20 min im Dunkeln inkubieren. 
			Hinweis: Diese Antikörper müssen mit zwei verschiedenen Fluorochromen markiert werden, die mit der Durchflusszytometrie-Analyse übereinstimmen. Zum Beispiel können Anti-CD14-Antikörper mit Phycoerythrin gekoppelt (für die Monozytenfärbung) und Anti-CD68-Antikörper mit Alexa Fluor 647 gekoppelt (für die Makrophagenfärbung) konjugiert werden.</li>
			<li>MDMs bei 400 x g für 5 min zentrifugieren. Überstände entfernen. Dissoziieren Sie das Zellpellet vorsichtig und inkubieren Sie MDMs in 250 ml 3 % Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie PFA-fixierte MDMs bei 400 x g für 5 min. MDMs mit 3 ml PBS waschen und MDMs bei 400 x g für 5 min zentrifugieren. Dissoziieren Sie MDM-Pellet vorsichtig in 400 ml PBS.</li>
			<li>Analysieren Sie die Differenzierung von Monozyten (die CD14, aber nicht CD68 exprimieren) in Monozyten (die CD68, aber nicht CD14 exprimieren). Hinweis: Klassischerweise sind mehr als 95% der Zellen MDM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>18 Stunden Stimulation von MDMs.
	<ol>
		<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium der adhärenten MDMs durch frisches 3-ml-Kulturmedium (mit 10 % FBS).</li>
		<li>Um eine M1- oder M2-Polarisation zu induzieren, verwenden Sie die folgenden humanen rekombinanten Zytokine: IFN-γ und TNF für die M1-Polarisation und IL-4 für die M2-Polarisation. M1-Makrophagen werden auch durch Stimulation mit LPS gewonnen. Es ist zu beachten, dass Stammlösungen von Zytokinen bei -80 °C und die Stammlösung von LPS bei -20 °C konserviert werden.
		<ol>
			<li>Die Stammlösung von IFN-gγ (1 mg/ml) bei 1/100 in Kulturmedium verdünnen, um eine Verdünnung von 10 ng/ml zu erhalten. 6 μl dieser IFN-γ Verdünnung zu MDMs hinzufügen, um eine endgültige IFN-γ Konzentration von 20 ng/ml zu erhalten.</li>
			<li>Die Stammlösung von TNF (1 mg/ml) bei 1/100 in Kulturmedium verdünnen, um eine Verdünnung von 10 ng/ml zu erhalten. 6 μl dieser TNF-Verdünnung zu MDMs hinzufügen, um eine TNF-Endkonzentration von 20 ng/ml zu erhalten.</li>
			<li>Die Stammlösung von IL-4 (1 mg/ml) bei 1/100 in Kulturmedium verdünnen, um eine Verdünnung von 10 ng/ml zu erhalten. 6 μl dieser IL-4-Verdünnung zu MDMs hinzufügen, um eine endgültige IL-4-Konzentration von 20 ng/ml zu erhalten.</li>
			<li>3 μl der LPS-Stammlösung (1 mg/ml) werden zu MDMs gegeben, um eine LPS-Endkonzentration von 1 μg/ml zu erhalten.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Um MDMs mit Bakterien zu stimulieren, verwenden Sie hitzeabgetötete Bakterien. Lebende Bakterien mit PBS waschen und 1 Stunde lang bei 95 °C erhitzen. Die Verwendung von Orientia tsutsugamushi (Stamm Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP Stamm 671203) und Coxiella burnetii (Nine Mile in Phase I) erfolgte, da diese Erreger dafür bekannt sind, Makrophagen zu infizieren. Bereiten Sie daher eine O. tsutsugamushi Suspension mit 109 Bakterien/ml vor. Fügen Sie MDMs 50 μl hinzu. Wiederholen Sie den gleichen Schritt für M. bovis und C. burnetii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aufbereitung von biologischen Proben für MALDI-TOF MS.
	<ol>
		<li>Waschstimulierte MDMs mit PBS ohne Ca2+ oder Mg2+ (Zellen können in Gegenwart von Ca2+ oder Mg2+ verklumpen). Scrape MDMs mit einem Gummipolizisten und sammle MDM-Sperren. MDMs zentrifugieren. MDMs erneut in PBS ohne Ca2+ oder Mg2+ bei 400 x g für 5 min waschen, um FBS-Kontamination zu verwerfen.</li>
		<li>Passen Sie die Zellkonzentration an (2 x 106 MDM pro Assay). MDMs bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und Überstände verwerfen. Sammeln Sie Zellpellets in 20 μl PBS ohne Ca2+ oder Mg2+.</li>
		<li>Analysieren Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie vor der Analyse bei -80 °C in PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analyse von Makrophagen mittels Ganzzell-Maldi-TOF-MS
<ol>
	<li>Vorbereitung der CHCA-Matrix.
	<ol>
		<li>Geben Sie 500 μl Acetonitril, 250 μl 10%ige Trifluoressigsäure und 250 μl Wasser für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in ein Fläschchen. 10 mg CHCA in dieser Lösung auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml verdünnen. Mischen und beschallen für mindestens 20 min. 
		Hinweis: Die Beschallung verbessert die Sättigung der Matrix, aber dieser Schritt ist nicht zwingend erforderlich.</li>
		<li>Bei 13.000 x g 5 min zentrifugieren. Das Pellet entsorgen und den Überstand aufbewahren. 
		Hinweis: Bereiten Sie die Matrixlösung kurz vor Gebrauch vor. Eine Matrixlösung, die Kristalle enthält, ermöglicht keine gute Ionisation der Probenmoleküle, was die Qualität der Spektren beeinträchtigen kann.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung des MALDI-Stahltargets.
	<ol>
		<li>Befeuchten Sie die Zielscheibe aus poliertem Stahl mit heißem Leitungswasser. Reiben Sie mit Präzisionswischpapier ab. 70% Ethanol hinzufügen und verreiben. Mit Wasser durch Reiben abspülen. Fügen Sie 70% Ethanol hinzu und reiben Sie mit Präzisionspapier ab.</li>
		<li>Tauchen Sie das Target in 70 % Ethanol und beschallen Sie es mindestens 15 Minuten lang. Bedecken Sie das Target mit 500 μl bis 1 ml Trifluoressigsäure bei 80 %. Reiben und wischen Sie mit Präzisionspapier ab. Mit HPLC-Wasser abspülen, ohne zu reiben. Trocknen Sie das Ziel bei Raumtemperatur. 
		Hinweis: Ein unsachgemäß gereinigtes Target kann die Qualität der Spektren beeinträchtigen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung von Einzahlungen.
	<ol>
		<li>Platzieren Sie das saubere Ziel auf einer horizontalen und ebenen Stütze, um gleichmäßige Ablagerungen zu erhalten.</li>
		<li>Tauen Sie MDM-Proben vorsichtig auf Eis auf. Hinweis: Schnelles und kräftiges Auftauen kann die Proben verändern und somit die Qualität der Spektren beeinträchtigen. Homogenisieren Sie MDMs (durch Hin- und Herpipettieren der Zellsuspension), bevor Sie 1 μl (mit ca. 1 x 105 Zellen) auf dem MALDI-Ziel abscheiden. Geben Sie 1 μl der MALDI-Matrixlösung auf die Probe. Vermeiden Sie es, Flecken mit der Pipette zu mischen. Das Mischen von Spots mit Pipetten verändert die Qualität der Spektren. Deponieren Sie 12-16 Proben/Assay (technische Replikate).</li>
		<li>Spontan bei Raumtemperatur verdampfen. Hinweis: Die Verdampfung erfolgt allmählich und führt zur Bildung von Matrix-/Probenkristallen. Die Ablagerungen können sofort analysiert oder vor der Analyse mehrere Tage im Dunkeln gelagert werden (bis zu 2 Wochen).</li>
		<li>Der Benutzer sollte darauf achten, dass die im Experiment verwendeten Zytokine oder hitzeabgetöteten Bakterien keine Peaks im Bereich der Spektren der stimulierten Makrophagen liefern. Hier haben wir überprüft, dass die Zytokine und die hitzeabgetöteten Bakterien allein innerhalb des untersuchten Bereichs (0-20 kDa) kein Signal lieferten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abstimmung und Datenerfassung von Massenspektrometern.
	<ol>
		<li>Setzen Sie das Stahltarget mit den Proben in das Massenspektrometer ein.</li>
		<li>Konfigurieren Sie das Massenspektrometer und führen Sie die Datenerfassung durch. Verwenden Sie die Standardkonfiguration für die automatische Erfassung der Daten.</li>
		<li>Hinweis: Eine detaillierte Übersicht über die Konfiguration der flexControl-Software finden Sie im Anhang/Tabelle 1. Dies kann je nach verwendetem Massenspektrometer und Software variieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bioinformatische Analyse
Hinweis: Die bioinformatische Analyse wurde mit der kostenlosen und quelloffenen statistischen Analysesoftware R durchgeführt, zusammen mit spezifischen Analysebibliotheken (MALDIquant). R kann kostenlos von seiner Website heruntergeladen werden <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/</a>. Eine detaillierte Beschreibung des Skripts wird als <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">ergänzendes Material bereitgestellt.</a>
<ol>
	<li>Laden und Vorbehandlung von Rohdaten.
	<ol>
		<li>Speichern Sie Rohdaten auf dem mit dem Massenspektrometer verbundenen Computer in mehreren Dateien und Ordnern. Rufen Sie den Stammordner des Experiments mit allen Unterordnern ab. Kopieren Sie den Stammordner zur Analyse auf den PC.</li>
		<li>Verwenden Sie readBrukerFlexData- und MALDIquant-Bibliotheken, um Rohdaten zu laden und zu analysieren. 
		Hinweis: readBrukerFlexData ermöglicht das Laden von Rohdaten aus dem Massenspektrometer in ein bestimmtes Objekt in R zur weiteren Analyse. Weitere Informationen finden Sie in der MALDIquant-Beschreibung 27.</li>
		<li>Analysierte generierte Spektren. 
		Hinweis: Jedes Spektrum besteht aus einer Liste von Peaks mit ihren jeweiligen Massen und Intensitäten (relative Abundanz). Verwenden Sie die Quadratwurzel der Intensitäten, um die grafische Visualisierung der Spektren zu verbessern. Korrigieren Sie den Hintergrund mit einem statistisch sensitiven, nichtlinearen Peak-Clipping-Algorithmus für die Baseline-Schätzung27. Verwenden Sie ein Signal-Rausch-Verhältnis von 6, um Spitzen zu erkennen. Beachten Sie, dass die detektierten Peaks in allen Spektren ähnlich sind, wenn die Masse-/Ladungswerte (m/z) innerhalb eines Fensters von 2.000 ppm liegen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definition und Berechnung der Punktzahl. Klassifizieren Sie die Spektren mit einem hierarchischen Clustering mit einem Ward-Algorithmus für Agglomeration und einer Unähnlichkeitsmatrix basierend auf der Jaccard-Distanz. 
	Hinweis: Der Jaccard-Index misst die Ähnlichkeit zwischen booleschen Sample-Sets (d. h. das Vorhandensein/Fehlen einer Liste von Peaks).</li>
	<li>Vergleich von Spektren und Betrachtung.
	<ol>
		<li>Analysieren Sie Rohspektrendiagramme. Hinweis: Die x-Achse stellt das m/z-Verhältnis (in Daltons) und die y-Achse die Intensität (relative Häufigkeit) dar.</li>
		<li>Bewerten Sie die Ähnlichkeit zwischen Spektren durch hierarchisches Clustering. Stellt Ähnlichkeit (oder Divergenz) als Dendrogramm dar.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Reproduzierbarkeit anhand der virtuellen Gel-View-Darstellung. Hinweis: Bei der virtuellen Gel-View-Darstellung handelt es sich um ein modifiziertes Heatmap-Diagramm, bei dem die relative Häufigkeit mit zunehmender Blauintensität farbcodiert ist.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mass Gross, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMass+Gross%2C+J+%22Spectrometry%3A+A+Textbook%22">Spectrometry: A Textbook</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Peptide+Profiling+by+Magnetic+Particle-Assisted%2C+Automated+Sample+Processing+and+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).</li>
<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+as+a+Diagnostic+and+a+Cancer+Biomarker+Discovery+Tool+Opportunities+and+Potential+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations.</a> Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+in+Screening+and+Diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic.</a> 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry and Protein Analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Carbonnelle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+two+MALDI-TOF+mass+spectrometry+systems+for+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.</a> J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).</li>
<li>Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization%E2%80%93Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+as+an+Alternative+to+16S+rRNA+Gene+Sequencing+for+Identification+of+Difficult-To-Identify+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).</li>
<li>Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+peptide+hormones+in+cultured+pancreatic+islet+alpha-+and+beta-cells+by+intact-cell+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).</li>
<li>Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+circulating+immune+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> PloS One. 5 (10), 13691 (2010).</li>
<li>Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+robust+and+automated+protein+analysis+of+cell+differentiation+and+of+primary+human+blood+cells+by+intact+cell+MALDI+mass+spectrometry+biotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).</li>
<li>Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+protein+productivity+and+production+stability+of+CHO+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+MS%3A+A+new+tool+to+assess+the+multifaceted+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages.</a> J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).</li>
<li>Amann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+profiling+of+proteins+in+lung+cancer+cells+from+fine-needle+aspirates+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).</li>
<li>Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+brush+biopsy+analysis+by+MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+early+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis.</a> Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).</li>
<li>Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+innate+immune+receptors+and+beyond%3A+making+sense+of+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).</li>
<li>Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+macrophage+function+during+tumor+progression%3A+regulation+by+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.</a> J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).</li>
<li>Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+World+J%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in health and disease.</a> Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+diverse+forms+of+macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.</a> Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).</li>
<li>Delaby, A., Gorvel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+monocyte+dynamics+in+Q+fever+granuloma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency.</a> J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).</li>
<li>Gibb, S., Strimmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDIquant%3A+a+versatile+R+package+for+the+analysis+of+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären. RO, JLM und CC sind Erfinder des internationalen Patents WO 2011/154650 mit dem Namen "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von MALDI-TOF-MS an eukaryotischen ganzen Zellen. Hier veranschaulichen wir die Genauigkeit der Methode, indem wir die multiplen Aktivierungszustände von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung analysieren.
Der Erfolg des Protokolls hängt von wenigen kritischen Schritten ab. Erstens kann jede Lösungsverunreinigung die Spektren verändern. Zum Beispiel ist es wichtig, Zellen in PBS zu waschen, um Kulturmedium und Serumproteine zu entfernen, bevor...

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) ist eine beliebte Massenspektrometrie-Technik zur Untersuchung biologischer Proben. Die Verwendung eines Laserstrahls und einer energieabsorbierenden Matrix ermöglicht einen sanften Ionisationsprozess: die Verdampfung und Genese großer, meist einfach geladener Biomoleküle. Dieser Prozess wird als Desorption/Ionisation bezeichnet, was das Akronym MALDI rechtfertigt. Diese Ionen werden dann durch Anlegen von Spannung beschleunigt und gelangen in einen TOF-Analysator, der die Trennung dieser Ionen und die Quantifizierung ihrer jeweiligen Massen ermöglicht1.
MALDI-TOF MS wurde in Biologie, Chemie und Medizin ausgiebig eingesetzt, um Moleküle und Biomarker2-4 zu identifizieren oder posttranslationale Modifikationen auf proteine5,6. Kürzlich haben mehrere Gruppen MALDI-TOF MS zur Identifizierung von Mikroorganismen aus klinischen Proben eingesetzt7,8. Diese mikrobiologische Anwendung wird heute routinemäßig im klinischen Umfeld eingesetzt. Ganzzell-MALDI-TOF hat viele Vorteile im Vergleich zu klassischen Anwendungen von MALDI-TOF MS. Proben, die ganze Zellen enthalten, werden direkt verarbeitet, wodurch zeitaufwändige Schritte zur Fraktionierung oder Trennung großer Materialmengen vermieden werden. Darüber hinaus ist keine Charakterisierung der verschiedenen Peaks erforderlich: Das gesamte Spektrum wird als Fingerabdruck der Probe betrachtet, und Matching-Algorithmen vergleichen das getestete Spektrum mit einer Datenbank von Referenzspektren.
Wir und andere haben diese Ganzzellanalysetechnik auf eukaryotische Zellen angewendet. Viele Anwendungen können aus dieser Technik abgeleitet werden: (1) Identifizierung der wichtigsten Zelltypen aus einer gemischten Probe9-11; (2) die Lebensfähigkeit von Zellkulturen im Laufe der Zeit zu bewerten (einschließlich industrieller Anwendungen in der Qualitätskontrolle)12; (3) die Aktivierungszustände eines einzelnen Zelltyps13 überwachen; (4) die maligne Transformation einer klinischen Probe zu beurteilen14,15.
Hier beschreiben wir die Verwendung von Ganzzell-MALDI-TOF MS, um die verschiedenen Polarisationsphänotypen von Makrophagen als Reaktion auf Zytokine oder hitzeabgetötete Bakterien zu untersuchen. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Immunantwort auf mikrobielle Krankheitserreger. Sie weisen Infektionserreger im Gewebe über Mustererkennungsrezeptoren nach, die in der Lage sind, konservierte mikrobielle Muster wie Lipopolysaccharid (LPS) zu erkennen16. Makrophagen sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die mit T-Zellen interagieren, um die adaptive Immunantwort zu aktivieren. T-Zellen beeinflussen Makrophagen, indem sie Zytokine freisetzen, die die mikrobizide Aktivität von Makrophagen entweder verstärken oder regulieren. In Analogie zur Th1/Th2-Lymphozytenpolarisation wurden entzündliche, mikrobizide und tumorizide Makrophagen in M1-Makrophagen und immunregulatorische Makrophagen als M2-Makrophagen klassifiziert17-19. Der Begriff M1 bezieht sich auf die klassische Aktivierung von Makrophagen durch Typ-I-Zytokine wie Interferon (IFN)-γ und Tumornekrosefaktor (TNF) oder bakterielle Produkte wie LPS18,20-23, während Makrophagen, die über alternative Signalwege (Interleukin (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1) aktiviert werden, als M2-Makrophagen gelten19,24,25. Die hohe phänotypische und funktionelle Plastizität von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung macht diese Makrophagen nützlich, um subtile Veränderungen mit Hilfe eines MALDI-TOF MS-Ansatzes zu analysieren.

ganzzell maldi-tof-massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle methode, um verschiedene arten der makrophagen-aktivierung analysieren

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF ist eine extensiv genutzte Massenspektrometrie-Technik in der Chemie und Biochemie. Es wurde auch in der Medizin, um Moleküle und Biomarker zu identifizieren. Kürzlich wurde in der Mikrobiologie für die Routine Identifizierung von Bakterien aus klinischen Proben verwendet worden gewachsen, ohne Vorbereitung oder Fraktionierungsstufen. Wir und andere haben diese Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Technik erfolgreich in eukaryotischen Zellen angewendet. Aktuelle Anwendungen reichen von Zelltyp zu Identifikations Bewertung der Qualitätskontrolle von Zellkultur-und Diagnoseanwendungen. Hier beschreiben wir die Anwendung auf die verschiedenen Phänotypen Polarisierung von Makrophagen in Reaktion auf Cytokine oder Hitze abgetöteten Bakterien erforschen. Es erlaubt die Identifizierung von Makrophagen-spezifischen Fingerabdrücke, die repräsentativ für die Vielfalt der proteomischen Reaktionen von Makrophagen sind. Diese Anwendung stellt die Genauigkeit und Einfachheit des Verfahrens. Das Protokoll wir hier beschrieben kann sinnvoll sein, for das Studium der Immunantwort im Wirt pathologischen Bedingungen oder breitere diagnostische Anwendungen erweitert werden.

Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist es, die Genauigkeit der Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Beurteilung der Reaktionsfähigkeit von Makrophagen auf ihre Mikroumgebung zu demonstrieren.
Abbildung 1 beschreibt die Herstellung stimulierter Makrophagen aus Blutproben. Abbildung 2 zeigt die Analyse von Monozyten und MDMs mittels Durchflusszytometrie. Beachten Sie, dass Monozyten CD14, aber nicht CD68 exprimierten (Abbildung 1A). Umge...

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie an eukaryotischen Zellen. Hier veranschaulichen wir die Genauigkeit dieser Technik, indem wir die multiplen Aktivierungszustände von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung analysieren.

Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

Dieses Experiment verwendet die Ganzzell-Multi-Massenspektrometrie. Um die verschiedenen Aktivierungsstadien von Makrophagen genau analysieren zu können, leiten Sie die Makrophagen zunächst aus CD14-positiven Monozyten ab und stimulieren Sie die Zellen anschließend mit Agonisten wie Zytokinen und Bakterien. Analysieren Sie die Proben mittels Moly auf einem Stahlträger, wobei die Proteine getrennt werden und für jede Probe ein Spektrum erhalten wird.Ergebnisse spezifischer Fingerabdrücke können zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen einer einzelnen eukaryotischen Zelle, dem Makrophagen, basierend auf einer bioinformatischen Analyse der Spektren, die mittels Ganzzell-MALDI-Massenspektrometrie erhalten wurden, unterscheiden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Durchflusszytometrie liegt darin, dass sie schnell, einfach und nicht teuer ist. In diesem Experiment zeigen wir, dass von Makrophagen reproduzierbare Spektren erhalten wurden und dass verschiedene Aktivierungszustände mittels Ganzzell-MS unterschieden werden konnten.Wir erhalten außerdem Spektren von BBMC, die für die Diagnose der Wirtsantwort auf eine Infektion nützlich sein könnt

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Makrophagen sind die Schlüsselzellen, die an der Pathogenität des Wirts beteiligt sind. Makrophagen weisen eine phänotypische und funktionelle Diversität auf, die durch Proteomanalyse analysiert und nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel wird beschrieben, wie eine 2D-Elektrophorese von Primärkulturen menschlicher Makrophagen durchgeführt wird, die in den M1- oder M2-Phänotyp differenziert sind.

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von microMS für die fluoreszenzgesteuerte Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie, die ein verbessertes molekulares Profiling von primären neuronalen Zellen der Ratte ermöglicht.

Fluoreszenzgesteuerte matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation mit laserinduzierter Postionisations-Massenspektrometrie einzelner Nervenzellen von Ratten

Dieses Protokoll beschreibt einen labelfreien optischen Beugungstomographie-basierten Workflow für Echtzeitbildgebung und quantitative Analyse der Makrophagenmorphodynamik. Die Methode ermöglicht eine kontinuierliche Verfolgung der Einzelzell-Morphologie und -Migration und liefert zeitaufgelöste Messungen der projizierten Fläche, des Umfangs und der durchschnittlichen Migrationsgeschwindigkeit während der Langzeitbildgebung von lebenden Zellen.

Echtzeit-Label-freie Bildgebung und quantitative Analyse der Makrophagenmorphodynamik mittels optischer Beugungstomographie

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Erfahren Sie, wie Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie Makrophagen-Aktivierungszustände schnell und kostengünstig analysiert. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung verschiedener Zustände durch spezifische Spektrenfingerabdrücke.

Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren (Video) | JoVE Journal

Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren

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