Name: Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie Makrophagen-Aktivierungszustände schnell und kostengünstig analysiert. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung verschiedener Zustände durch spezifische Spektrenfingerabdrücke.

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Richard Ouedraogo wird durch ein Stipendium des Ministère de la Santé unterstützt (PHRC 2010). Wir danken Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops und Nicolas Amstrong für die technische Unterstützung.

Im vorliegenden Protokoll wird die Ganzzell-MALDI-TOF-Technik verwendet, um ein Massenspektrum zu erhalten, das als Fingerabdruck der Probe betrachtet wird. Eine bioinformatische Analyse ermöglichte den Vergleich und die Klassifizierung dieser Fingerabdrücke. Dieses Protokoll bestand aus drei Hauptteilen:
<ol>
	<li>Die Aufbereitung der biologischen Proben: Kontrollmakrophagen und Makrophagen, die mit verschiedenen Agonisten stimuliert wurden.</li>
	<li>Die Analyse jeder Art von Probe mit technischen Replikaten mittels Ganzzell-MALDI-TOF MS.</li>
	<li>Die bioinformatische Analyse von Rohdaten.</li>
</ol>
Bereiten Sie sterile Lösungen für die Zellisolierung und -kultur vor. Bereiten Sie alle Reagenzien vor und lagern Sie sie bei 4 °C
1. Präparation menschlicher Monozyten
<ol>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor. 55 ml Humanserum AB+ oder fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml der Antibiotikalösung (Penicillin in einer Dosis von 10.000 IE/ml und Streptomycin in einer Menge von 10.000 μg/ml; Endkonzentration von 100 IE/ml für Penicillin und 100 μg/ml für Streptomycin) zu RPMI 1640 Medium (500 ml) geben.
	<ol>
		<li>Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Leukopacks (Leukozytenkonzentraten).
		<ol>
			<li>Bereiten Sie 50 ml Röhrchen mit 15 ml Ficoll vor. Verdünnen Sie das Blut in Kochsalzlösung (vol/vol, 1/10). 30 ml verdünnte PBMC wie zuvor beschrieben auf Ficoll ablegen26.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie 20 min lang bei 700 x g. Rückgewinnung von PBMCs an der Grenzfläche zwischen Ficoll (Dichte von 1,077 g/ml) und verdünntem Plasma. PBMC in Kulturmedium verdünnen und 5 min bei 300 x g zentrifugieren.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie CD14+-Monozyten aus PBMCs mit magnetischen Beads her, die mit Anti-CD14-Antikörpern beschichtet sind. 
		Hinweis: Bewahren Sie Produkte und Zellen bei 4 °C auf, bis die Monozyten vorhanden sind.
		<ol>
			<li>Bereiten Sie einen Laufpuffer vor, der aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) besteht.</li>
			<li>Dissoziieren Sie pelletierte PBMCs (107 Zellen pro Assay) vorsichtig in 80 μl Laufpuffer.</li>
			<li>Geben Sie 20 μl CD14 MicroBeads zu PBMCs. PBMCs mischen und 15 min inkubieren. PBMCs mit 5 ml Laufpuffer waschen und bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Dissoziierte pelletierte PBMCs werden vorsichtig in 500 μl Laufpuffer für 108 PBMC dissoziiert. 
			Hinweis: 500 μl Laufpuffer für PBMC-Konzentrationen unter 108 PBMC verwenden.</li>
			<li>Fahren Sie mit der magnetischen Trennung fort. 
			Hinweis: Für weniger als 2 x 108 PBMCs ist die MS-Spalte zu verwenden. Für mehr als 2 x 108 PBMC und weniger als 2 x 109 PBMC ist die LS-Spalte zu verwenden.</li>
			<li>Spülen Sie die Vorsäule und die Säule mit laufendem Puffer (500 μl für die MS-Säule oder 3 ml für die LS-Säule). Fügen Sie PBMCs in die Vorspalte ein (warten Sie, bis unbeschriftete Zellen die Spalte durchlaufen haben). 3 Mal mit Laufpuffer spülen (500 μl für MS-Säule oder 3 ml für LS-Säule). Entfernen Sie die Vorsäule.</li>
			<li>Stellen Sie die Säule auf 15 ml Röhrchen. Geben Sie einen Laufpuffer (1 ml für die MS-Säule oder 5 ml für die LS-Säule) auf die Säule und eluieren Sie CD14+-Zellen, indem Sie einen Druck auf die Säule ausüben.</li>
			<li>Das Eluat bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. Das Monozytenpellet mit 10 ml Nährmedium waschen. 
			Hinweis: Analysieren Sie die Reinheit der Monozytenpräparation mit Anti-CD14-Antikörpern und Durchflusszytometrie (klassisch höher als 95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Differenzierung von Monozyten in Makrophagen.
	<ol>
		<li>Monozyten (10,6 Monozyten pro Vertiefung in 6-Well-Platten) werden in 3 ml Kulturmedium mit 10 % Humanserum AB+ bei 37 °C inkubiert. Ersetzen Sie nach 4 Tagen für weitere 3 Tage das Kulturmedium mit Humanserum durch 3 ml Kulturmedium mit 10 % FBS.</li>
		<li>Identifizieren Sie die erhaltene Zellpopulation als Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDMs) mittels Durchflusszytometrie (siehe Abbildung 1).
		<ol>
			<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium durch 3 ml PBS. Scrape MDMs mit einem Gummipolizisten und sammle MDM-Sperren. Bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Geben Sie PBS mit 2 % BSA zu pelletierten MDMs und rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf. Die Zellkonzentration (10,6 MDM in 200 ml PBS) wird angepasst und bei 4 °C inkubiert.</li>
			<li>10 ml Anti-CD14-Antikörper und 10 ml Anti-CD68-Antikörper in die MDM-Suspension geben und bei 4 °C für 20 min im Dunkeln inkubieren. 
			Hinweis: Diese Antikörper müssen mit zwei verschiedenen Fluorochromen markiert werden, die mit der Durchflusszytometrie-Analyse übereinstimmen. Zum Beispiel können Anti-CD14-Antikörper mit Phycoerythrin gekoppelt (für die Monozytenfärbung) und Anti-CD68-Antikörper mit Alexa Fluor 647 gekoppelt (für die Makrophagenfärbung) konjugiert werden.</li>
			<li>MDMs bei 400 x g für 5 min zentrifugieren. Überstände entfernen. Dissoziieren Sie das Zellpellet vorsichtig und inkubieren Sie MDMs in 250 ml 3 % Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie PFA-fixierte MDMs bei 400 x g für 5 min. MDMs mit 3 ml PBS waschen und MDMs bei 400 x g für 5 min zentrifugieren. Dissoziieren Sie MDM-Pellet vorsichtig in 400 ml PBS.</li>
			<li>Analysieren Sie die Differenzierung von Monozyten (die CD14, aber nicht CD68 exprimieren) in Monozyten (die CD68, aber nicht CD14 exprimieren). Hinweis: Klassischerweise sind mehr als 95% der Zellen MDM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>18 Stunden Stimulation von MDMs.
	<ol>
		<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium der adhärenten MDMs durch frisches 3-ml-Kulturmedium (mit 10 % FBS).</li>
		<li>Um eine M1- oder M2-Polarisation zu induzieren, verwenden Sie die folgenden humanen rekombinanten Zytokine: IFN-γ und TNF für die M1-Polarisation und IL-4 für die M2-Polarisation. M1-Makrophagen werden auch durch Stimulation mit LPS gewonnen. Es ist zu beachten, dass Stammlösungen von Zytokinen bei -80 °C und die Stammlösung von LPS bei -20 °C konserviert werden.
		<ol>
			<li>Die Stammlösung von IFN-gγ (1 mg/ml) bei 1/100 in Kulturmedium verdünnen, um eine Verdünnung von 10 ng/ml zu erhalten. 6 μl dieser IFN-γ Verdünnung zu MDMs hinzufügen, um eine endgültige IFN-γ Konzentration von 20 ng/ml zu erhalten.</li>
			<li>Die Stammlösung von TNF (1 mg/ml) bei 1/100 in Kulturmedium verdünnen, um eine Verdünnung von 10 ng/ml zu erhalten. 6 μl dieser TNF-Verdünnung zu MDMs hinzufügen, um eine TNF-Endkonzentration von 20 ng/ml zu erhalten.</li>
			<li>Die Stammlösung von IL-4 (1 mg/ml) bei 1/100 in Kulturmedium verdünnen, um eine Verdünnung von 10 ng/ml zu erhalten. 6 μl dieser IL-4-Verdünnung zu MDMs hinzufügen, um eine endgültige IL-4-Konzentration von 20 ng/ml zu erhalten.</li>
			<li>3 μl der LPS-Stammlösung (1 mg/ml) werden zu MDMs gegeben, um eine LPS-Endkonzentration von 1 μg/ml zu erhalten.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Um MDMs mit Bakterien zu stimulieren, verwenden Sie hitzeabgetötete Bakterien. Lebende Bakterien mit PBS waschen und 1 Stunde lang bei 95 °C erhitzen. Die Verwendung von Orientia tsutsugamushi (Stamm Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP Stamm 671203) und Coxiella burnetii (Nine Mile in Phase I) erfolgte, da diese Erreger dafür bekannt sind, Makrophagen zu infizieren. Bereiten Sie daher eine O. tsutsugamushi Suspension mit 109 Bakterien/ml vor. Fügen Sie MDMs 50 μl hinzu. Wiederholen Sie den gleichen Schritt für M. bovis und C. burnetii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aufbereitung von biologischen Proben für MALDI-TOF MS.
	<ol>
		<li>Waschstimulierte MDMs mit PBS ohne Ca2+ oder Mg2+ (Zellen können in Gegenwart von Ca2+ oder Mg2+ verklumpen). Scrape MDMs mit einem Gummipolizisten und sammle MDM-Sperren. MDMs zentrifugieren. MDMs erneut in PBS ohne Ca2+ oder Mg2+ bei 400 x g für 5 min waschen, um FBS-Kontamination zu verwerfen.</li>
		<li>Passen Sie die Zellkonzentration an (2 x 106 MDM pro Assay). MDMs bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und Überstände verwerfen. Sammeln Sie Zellpellets in 20 μl PBS ohne Ca2+ oder Mg2+.</li>
		<li>Analysieren Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie vor der Analyse bei -80 °C in PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analyse von Makrophagen mittels Ganzzell-Maldi-TOF-MS
<ol>
	<li>Vorbereitung der CHCA-Matrix.
	<ol>
		<li>Geben Sie 500 μl Acetonitril, 250 μl 10%ige Trifluoressigsäure und 250 μl Wasser für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in ein Fläschchen. 10 mg CHCA in dieser Lösung auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml verdünnen. Mischen und beschallen für mindestens 20 min. 
		Hinweis: Die Beschallung verbessert die Sättigung der Matrix, aber dieser Schritt ist nicht zwingend erforderlich.</li>
		<li>Bei 13.000 x g 5 min zentrifugieren. Das Pellet entsorgen und den Überstand aufbewahren. 
		Hinweis: Bereiten Sie die Matrixlösung kurz vor Gebrauch vor. Eine Matrixlösung, die Kristalle enthält, ermöglicht keine gute Ionisation der Probenmoleküle, was die Qualität der Spektren beeinträchtigen kann.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung des MALDI-Stahltargets.
	<ol>
		<li>Befeuchten Sie die Zielscheibe aus poliertem Stahl mit heißem Leitungswasser. Reiben Sie mit Präzisionswischpapier ab. 70% Ethanol hinzufügen und verreiben. Mit Wasser durch Reiben abspülen. Fügen Sie 70% Ethanol hinzu und reiben Sie mit Präzisionspapier ab.</li>
		<li>Tauchen Sie das Target in 70 % Ethanol und beschallen Sie es mindestens 15 Minuten lang. Bedecken Sie das Target mit 500 μl bis 1 ml Trifluoressigsäure bei 80 %. Reiben und wischen Sie mit Präzisionspapier ab. Mit HPLC-Wasser abspülen, ohne zu reiben. Trocknen Sie das Ziel bei Raumtemperatur. 
		Hinweis: Ein unsachgemäß gereinigtes Target kann die Qualität der Spektren beeinträchtigen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung von Einzahlungen.
	<ol>
		<li>Platzieren Sie das saubere Ziel auf einer horizontalen und ebenen Stütze, um gleichmäßige Ablagerungen zu erhalten.</li>
		<li>Tauen Sie MDM-Proben vorsichtig auf Eis auf. Hinweis: Schnelles und kräftiges Auftauen kann die Proben verändern und somit die Qualität der Spektren beeinträchtigen. Homogenisieren Sie MDMs (durch Hin- und Herpipettieren der Zellsuspension), bevor Sie 1 μl (mit ca. 1 x 105 Zellen) auf dem MALDI-Ziel abscheiden. Geben Sie 1 μl der MALDI-Matrixlösung auf die Probe. Vermeiden Sie es, Flecken mit der Pipette zu mischen. Das Mischen von Spots mit Pipetten verändert die Qualität der Spektren. Deponieren Sie 12-16 Proben/Assay (technische Replikate).</li>
		<li>Spontan bei Raumtemperatur verdampfen. Hinweis: Die Verdampfung erfolgt allmählich und führt zur Bildung von Matrix-/Probenkristallen. Die Ablagerungen können sofort analysiert oder vor der Analyse mehrere Tage im Dunkeln gelagert werden (bis zu 2 Wochen).</li>
		<li>Der Benutzer sollte darauf achten, dass die im Experiment verwendeten Zytokine oder hitzeabgetöteten Bakterien keine Peaks im Bereich der Spektren der stimulierten Makrophagen liefern. Hier haben wir überprüft, dass die Zytokine und die hitzeabgetöteten Bakterien allein innerhalb des untersuchten Bereichs (0-20 kDa) kein Signal lieferten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abstimmung und Datenerfassung von Massenspektrometern.
	<ol>
		<li>Setzen Sie das Stahltarget mit den Proben in das Massenspektrometer ein.</li>
		<li>Konfigurieren Sie das Massenspektrometer und führen Sie die Datenerfassung durch. Verwenden Sie die Standardkonfiguration für die automatische Erfassung der Daten.</li>
		<li>Hinweis: Eine detaillierte Übersicht über die Konfiguration der flexControl-Software finden Sie im Anhang/Tabelle 1. Dies kann je nach verwendetem Massenspektrometer und Software variieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bioinformatische Analyse
Hinweis: Die bioinformatische Analyse wurde mit der kostenlosen und quelloffenen statistischen Analysesoftware R durchgeführt, zusammen mit spezifischen Analysebibliotheken (MALDIquant). R kann kostenlos von seiner Website heruntergeladen werden <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/</a>. Eine detaillierte Beschreibung des Skripts wird als <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">ergänzendes Material bereitgestellt.</a>
<ol>
	<li>Laden und Vorbehandlung von Rohdaten.
	<ol>
		<li>Speichern Sie Rohdaten auf dem mit dem Massenspektrometer verbundenen Computer in mehreren Dateien und Ordnern. Rufen Sie den Stammordner des Experiments mit allen Unterordnern ab. Kopieren Sie den Stammordner zur Analyse auf den PC.</li>
		<li>Verwenden Sie readBrukerFlexData- und MALDIquant-Bibliotheken, um Rohdaten zu laden und zu analysieren. 
		Hinweis: readBrukerFlexData ermöglicht das Laden von Rohdaten aus dem Massenspektrometer in ein bestimmtes Objekt in R zur weiteren Analyse. Weitere Informationen finden Sie in der MALDIquant-Beschreibung 27.</li>
		<li>Analysierte generierte Spektren. 
		Hinweis: Jedes Spektrum besteht aus einer Liste von Peaks mit ihren jeweiligen Massen und Intensitäten (relative Abundanz). Verwenden Sie die Quadratwurzel der Intensitäten, um die grafische Visualisierung der Spektren zu verbessern. Korrigieren Sie den Hintergrund mit einem statistisch sensitiven, nichtlinearen Peak-Clipping-Algorithmus für die Baseline-Schätzung27. Verwenden Sie ein Signal-Rausch-Verhältnis von 6, um Spitzen zu erkennen. Beachten Sie, dass die detektierten Peaks in allen Spektren ähnlich sind, wenn die Masse-/Ladungswerte (m/z) innerhalb eines Fensters von 2.000 ppm liegen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definition und Berechnung der Punktzahl. Klassifizieren Sie die Spektren mit einem hierarchischen Clustering mit einem Ward-Algorithmus für Agglomeration und einer Unähnlichkeitsmatrix basierend auf der Jaccard-Distanz. 
	Hinweis: Der Jaccard-Index misst die Ähnlichkeit zwischen booleschen Sample-Sets (d. h. das Vorhandensein/Fehlen einer Liste von Peaks).</li>
	<li>Vergleich von Spektren und Betrachtung.
	<ol>
		<li>Analysieren Sie Rohspektrendiagramme. Hinweis: Die x-Achse stellt das m/z-Verhältnis (in Daltons) und die y-Achse die Intensität (relative Häufigkeit) dar.</li>
		<li>Bewerten Sie die Ähnlichkeit zwischen Spektren durch hierarchisches Clustering. Stellt Ähnlichkeit (oder Divergenz) als Dendrogramm dar.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Reproduzierbarkeit anhand der virtuellen Gel-View-Darstellung. Hinweis: Bei der virtuellen Gel-View-Darstellung handelt es sich um ein modifiziertes Heatmap-Diagramm, bei dem die relative Häufigkeit mit zunehmender Blauintensität farbcodiert ist.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären. RO, JLM und CC sind Erfinder des internationalen Patents WO 2011/154650 mit dem Namen "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von MALDI-TOF-MS an eukaryotischen ganzen Zellen. Hier veranschaulichen wir die Genauigkeit der Methode, indem wir die multiplen Aktivierungszustände von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung analysieren.
Der Erfolg des Protokolls hängt von wenigen kritischen Schritten ab. Erstens kann jede Lösungsverunreinigung die Spektren verändern. Zum Beispiel ist es wichtig, Zellen in PBS zu waschen, um Kulturmedium und Serumproteine zu entfernen, bevor...

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) ist eine beliebte Massenspektrometrie-Technik zur Untersuchung biologischer Proben. Die Verwendung eines Laserstrahls und einer energieabsorbierenden Matrix ermöglicht einen sanften Ionisationsprozess: die Verdampfung und Genese großer, meist einfach geladener Biomoleküle. Dieser Prozess wird als Desorption/Ionisation bezeichnet, was das Akronym MALDI rechtfertigt. Diese Ionen werden dann durch Anlegen von Spannung beschleunigt und gelangen in einen TOF-Analysator, der die Trennung dieser Ionen und die Quantifizierung ihrer jeweiligen Massen ermöglicht1.
MALDI-TOF MS wurde in Biologie, Chemie und Medizin ausgiebig eingesetzt, um Moleküle und Biomarker2-4 zu identifizieren oder posttranslationale Modifikationen auf proteine5,6. Kürzlich haben mehrere Gruppen MALDI-TOF MS zur Identifizierung von Mikroorganismen aus klinischen Proben eingesetzt7,8. Diese mikrobiologische Anwendung wird heute routinemäßig im klinischen Umfeld eingesetzt. Ganzzell-MALDI-TOF hat viele Vorteile im Vergleich zu klassischen Anwendungen von MALDI-TOF MS. Proben, die ganze Zellen enthalten, werden direkt verarbeitet, wodurch zeitaufwändige Schritte zur Fraktionierung oder Trennung großer Materialmengen vermieden werden. Darüber hinaus ist keine Charakterisierung der verschiedenen Peaks erforderlich: Das gesamte Spektrum wird als Fingerabdruck der Probe betrachtet, und Matching-Algorithmen vergleichen das getestete Spektrum mit einer Datenbank von Referenzspektren.
Wir und andere haben diese Ganzzellanalysetechnik auf eukaryotische Zellen angewendet. Viele Anwendungen können aus dieser Technik abgeleitet werden: (1) Identifizierung der wichtigsten Zelltypen aus einer gemischten Probe9-11; (2) die Lebensfähigkeit von Zellkulturen im Laufe der Zeit zu bewerten (einschließlich industrieller Anwendungen in der Qualitätskontrolle)12; (3) die Aktivierungszustände eines einzelnen Zelltyps13 überwachen; (4) die maligne Transformation einer klinischen Probe zu beurteilen14,15.
Hier beschreiben wir die Verwendung von Ganzzell-MALDI-TOF MS, um die verschiedenen Polarisationsphänotypen von Makrophagen als Reaktion auf Zytokine oder hitzeabgetötete Bakterien zu untersuchen. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Immunantwort auf mikrobielle Krankheitserreger. Sie weisen Infektionserreger im Gewebe über Mustererkennungsrezeptoren nach, die in der Lage sind, konservierte mikrobielle Muster wie Lipopolysaccharid (LPS) zu erkennen16. Makrophagen sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die mit T-Zellen interagieren, um die adaptive Immunantwort zu aktivieren. T-Zellen beeinflussen Makrophagen, indem sie Zytokine freisetzen, die die mikrobizide Aktivität von Makrophagen entweder verstärken oder regulieren. In Analogie zur Th1/Th2-Lymphozytenpolarisation wurden entzündliche, mikrobizide und tumorizide Makrophagen in M1-Makrophagen und immunregulatorische Makrophagen als M2-Makrophagen klassifiziert17-19. Der Begriff M1 bezieht sich auf die klassische Aktivierung von Makrophagen durch Typ-I-Zytokine wie Interferon (IFN)-γ und Tumornekrosefaktor (TNF) oder bakterielle Produkte wie LPS18,20-23, während Makrophagen, die über alternative Signalwege (Interleukin (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1) aktiviert werden, als M2-Makrophagen gelten19,24,25. Die hohe phänotypische und funktionelle Plastizität von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung macht diese Makrophagen nützlich, um subtile Veränderungen mit Hilfe eines MALDI-TOF MS-Ansatzes zu analysieren.

ganzzell maldi-tof-massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle methode, um verschiedene arten der makrophagen-aktivierung analysieren

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF ist eine extensiv genutzte Massenspektrometrie-Technik in der Chemie und Biochemie. Es wurde auch in der Medizin, um Moleküle und Biomarker zu identifizieren. Kürzlich wurde in der Mikrobiologie für die Routine Identifizierung von Bakterien aus klinischen Proben verwendet worden gewachsen, ohne Vorbereitung oder Fraktionierungsstufen. Wir und andere haben diese Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Technik erfolgreich in eukaryotischen Zellen angewendet. Aktuelle Anwendungen reichen von Zelltyp zu Identifikations Bewertung der Qualitätskontrolle von Zellkultur-und Diagnoseanwendungen. Hier beschreiben wir die Anwendung auf die verschiedenen Phänotypen Polarisierung von Makrophagen in Reaktion auf Cytokine oder Hitze abgetöteten Bakterien erforschen. Es erlaubt die Identifizierung von Makrophagen-spezifischen Fingerabdrücke, die repräsentativ für die Vielfalt der proteomischen Reaktionen von Makrophagen sind. Diese Anwendung stellt die Genauigkeit und Einfachheit des Verfahrens. Das Protokoll wir hier beschrieben kann sinnvoll sein, for das Studium der Immunantwort im Wirt pathologischen Bedingungen oder breitere diagnostische Anwendungen erweitert werden.

Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist es, die Genauigkeit der Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Beurteilung der Reaktionsfähigkeit von Makrophagen auf ihre Mikroumgebung zu demonstrieren.
Abbildung 1 beschreibt die Herstellung stimulierter Makrophagen aus Blutproben. Abbildung 2 zeigt die Analyse von Monozyten und MDMs mittels Durchflusszytometrie. Beachten Sie, dass Monozyten CD14, aber nicht CD68 exprimierten (Abbildung 1A). Umge...

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie an eukaryotischen Zellen. Hier veranschaulichen wir die Genauigkeit dieser Technik, indem wir die multiplen Aktivierungszustände von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung analysieren.

Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

Dieses Experiment verwendet die Ganzzell-Multi-Massenspektrometrie. Um die verschiedenen Aktivierungsstadien von Makrophagen genau analysieren zu können, leiten Sie die Makrophagen zunächst aus CD14-positiven Monozyten ab und stimulieren Sie die Zellen anschließend mit Agonisten wie Zytokinen und Bakterien. Analysieren Sie die Proben mittels Moly auf einem Stahlträger, wobei die Proteine getrennt werden und für jede Probe ein Spektrum erhalten wird.Ergebnisse spezifischer Fingerabdrücke können zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen einer einzelnen eukaryotischen Zelle, dem Makrophagen, basierend auf einer bioinformatischen Analyse der Spektren, die mittels Ganzzell-MALDI-Massenspektrometrie erhalten wurden, unterscheiden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Durchflusszytometrie liegt darin, dass sie schnell, einfach und nicht teuer ist. In diesem Experiment zeigen wir, dass von Makrophagen reproduzierbare Spektren erhalten wurden und dass verschiedene Aktivierungszustände mittels Ganzzell-MS unterschieden werden konnten.Wir erhalten außerdem Spektren von BBMC, die für die Diagnose der Wirtsantwort auf eine Infektion nützlich sein könnten. Diese Methode kann Einblicke in die Aktivierungszustände von Immunzellen liefern. Sie könnte auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf das Konzeptprofil, um beispielsweise die ex-extraze Analyse während einer Operation zu ersetzen, isolieren Sie die Zellen aus Opax in 50-Milliliter-Röhrchen.Fügen Sie 15 Milliliter FiCall hinzu, verdünnen Sie das Blut zehnfach in Kochsalzlösung. Anschließend trennen Sie 30 Milliliter des verdünnten Blutes auf der Ficoll-Gradienten. Nach dem Abtrennen des Rings mit den PBMCs bewahren Sie die Zellen auf Eis auf.Lösen Sie die pelletierten P BMCs vorsichtig in 80 Mikrolitern Laufpuffer auf. Geben Sie 20 Mikroliter magnetische Kügelchen, beschichtet mit Anti-CD-14-Antikörpern, hinzu. Mischen und inkubieren Sie 15 Minuten lang.Einmal mit fünf Milliliter Puffer waschen und fünf Minuten bei 300 G zentrifugieren. Die pelletierten Zellen vorsichtig in 500 Mikroliter Puffer suspendieren. Die geeignete Säule für die magnetische Trennung auswählen.Spülen Sie den Vorsäuleneinsatz und die Säule mit Puffer. Anschließend geben Sie die PBMCs auf den Vorsäuleneinsatz. Legen Sie ein Magnetfeld an und spülen Sie dreimal mit Puffer. Entfernen Sie den Vorkal und stellen Sie die Säule auf ein 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie Laufpuffer hinzu und eluieren Sie die CD14-positiven Zellen, indem Sie Druck auf die Säule ausüben. Anschließend zentrifugieren.Zentrifugieren Sie bei 300 ×g fünf Minuten lang. Entsorgen Sie das Überstand. Waschen Sie das Monocyten-Pellet mit 10 Milliliter Kulturmedium.Ein Aliquot des Mediums wird zur Bestimmung der Reinheit der Monozytenpräparation mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Anti-CD14-Antikörpern entnommen. Die Monozyten werden in drei Milliliter Kulturmedium, das 10 % humanes Serum AB-positiv enthält, für vier Tage ausgesät. Anschließend wird das Medium durch RPMI ergänzt mit 10 % FBS ersetzt. Die gewonnene Zellpopulation wird mittels Durchflusszytometrie als aus Monozyten abgeleitete Makrophagen identifiziert.Stimulieren Sie die Proben gemäß dem experimentellen Design. Nach dem Waschen der stimulierten MDMs mit PBS, schaben Sie die Zellen mit dem Gummispachtel ab und sammeln Sie die MDM-Suspensionen. Zentrifugieren Sie die Zellen zur Pellettierung und waschen Sie sie anschließend einmal mit PBS, um Reste von FBS zu entfernen.Zentrifugieren Sie die M dms, um sie zu pelletieren, und resuspendieren Sie die Pellets in 20 µL PBS. Analysieren Sie die Zellen unverzüglich oder lagern Sie sie vor der Analyse in PBS bei minus 80 °C. Um die CHCA-Matrix herzustellen, geben Sie 500 µL Acetonitril, 250 µL 10 %ige Trifluoressigsäure und 250 µL HPLC-Reinstwasser in ein Gefäß. Gegeben Sie anschließend 10 µL der CHCA-Mischung hinzu und beschallen Sie die Matrix mindestens 20 Minuten lang. Zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g fünf Minuten, sammeln Sie den Überstand und verwerfen Sie den Pellet. Danach befeuchten Sie das polierte Stahltarget mit heißem Leitungswasser und reiben es mit Präzisions-Weißpapier ab.Gebe 70 % Ethanol hinzu und reibe die RINs mit Wasser ab. Danach 70 % Ethanol hinzufügen und mit Präzisionspapier abreiben. Das Zielobjekt in 70 % Ethanol eintauchen und mindestens 15 Minuten lang beschallen.Bedecken Sie das Ziel mit 500 µL bis 1 mL 80 %iger trockener fluoroessiger Säure, reiben und wischen Sie mit Präzisionspapier ab. Anschließend mit wasserfreier HPLC-Grad-Wasser ohne Reiben abspülen. Das Ziel bei Raumtemperatur trocknen.Tauen Sie die MDM-Proben nun vorsichtig auf Eis auf. Mischen Sie die MDM-Zellsuspension durch Pipettieren und geben Sie einen Mikroliter auf das MALDI-Ziel. Geben Sie einen Mikroliter der MALDI-Matrixlösung zur Probe hinzu.Für technische Replikate. Geben Sie 12 bis 16 Proben pro Assay ein, die bei Raumtemperatur spontan verdunsten. Platzieren Sie nun das Stahltarget mit den Proben in das Massenspektrometer.Konfigurieren Sie das Massenspektrometer und führen Sie die Datenaufnahme durch. Jedes Spektrum besteht aus einer Liste von Peaks mit den jeweiligen Massen und Intensitäten, die die relative Häufigkeit angeben. Verwenden Sie die Quadratwurzel der Intensitäten, um die grafische Darstellung der Spektren zu verbessern.Danach korrigieren Sie den Hintergrund mithilfe eines statistisch empfindlichen nichtlinearen Peak-Abschneide-Algorithmus. Zur Baseline-Schätzung wenden Sie ein Signal-Rausch-Verhältnis von sechs an, um Peaks zu detektieren. Berücksichtigen Sie, dass die detektierten Peaks in den Spektren ähnlich sind, wenn die Masse-Ladung-Werte innerhalb eines Fensters von 2000 PM liegen.In diesem Experiment wurden stimulierte Makrophagen aus Blutproben gewonnen. Monocyten wurden entsprechend der Expression von CD 14, jedoch nicht von CD 68, selektiert. Umgekehrt wurden aus Monocyten stammende Makrophagen durch Expression von CD 68, jedoch nicht von CD 14, identifiziert.Diese Daten verdeutlichen die Rolle der Probenvorbereitung bei der Interpretation von MALDI-TOF-MS-Ergebnissen. Ein Spektrum guter Qualität enthält gewöhnlich eine Hauptspitze bei etwa fünf Kilodalton. Um gute Proben zu erhalten, ist eine Mindestzellkonzentration erforderlich, wie durch dieses Spektrum geringer Qualität, das mit einer niedrigen Zellkonzentration aufgenommen wurde, veranschaulicht wird.Ähnlich schlechte Ergebnisse werden erzielt, wenn die Probe vor der Auftragung auf die Targetplatte mit der Matrix vermischt wird. Hier werden Spektren verschiedener Proben als Heatmap dargestellt. Die relative Häufigkeit ist durch Intensitäten von Blau farblich kodiert.Diese virtuelle Gel-Darstellung veranschaulicht die Reproduzierbarkeit der Proben innerhalb jeder Klasse. Eine unbeaufsichtigte Analyse mittels hierarchischem Clustering wird als Diagramm zusammengefasst. Alle Proben gruppierten sich in drei verschiedene Gruppen. Nicht stimulierte MDMs, mit IFN-Gamma stimulierte oder mit IL-4 stimulierte MDMs. Bedeutsam ist, dass die MALDI-TOF-Analyse eine Unterscheidung von M1-Makrophagen, M2-Makrophagen und nicht stimulierten MDMs ermöglicht. Die Peak-Darstellung eines Referenzspektrums für IFN-Gamma, IL-4 oder nicht stimulierte MDMs zeigt spezifische Peaks für jede Klasse.Bestimmte Fingerabdrücke können durch mehrere Agonisten hervorgerufen werden, um die Genauigkeit des gesamten Zell-Maloff zu veranschaulichen. Tatsächlich waren die Spektren aller stimulierten Proben deutlich von denen unstimulierter Makrophagen getrennt. MDMs wiesen ebenfalls spezifische, durch hitzeabgetötete Bakterien induzierte Fingerabdrücke auf.Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass MALDI-TOF-MS zur Analyse zirkulierender Zellen verwendet werden kann, um die Wirtsantwort auf eine Infektion oder entzündliche Erkrankungen im klinischen Umfeld zu bewerten, sobald die Probe bereit ist. Diese Technik kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Aktivierungszustände von hämatopoetischen Zellen mittels Ganzzell-MALDI-Massenspektrometrie bewertet werden können.

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren (Video) | JoVE Journal

Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren

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