Name: Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Erfahren Sie die subretinale Transplantation von MACS-gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Zellintegration durch Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Wir danken Anand Swaroop für die Bereitstellung von Nrl-GFP-Mäusen, Jochen Haas für technische Unterstützung und Sindy Böhme und Emely Lessmann für die Tierhaltung.	
	Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Zentrum für Regenerative Therapien Dresden, dem CRTD Seed Grant Program, dem SFB 655 und dem ProRetina e.V. unterstützt. Stiftung, das DIGS-BB Graduate Program Dresden und die Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Ethische Nutzung und Pflege von Tieren Aussage:
Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Gesetzen der Europäischen Union und der Deutschen (Tierschutzgesetz) durchgeführt und hielten sich an die ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der TU Dresden und der Landesdirektion Dresden genehmigt (Zulassungsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Vor dem Starten der Zelldissoziation und Zellsortierung
<ol><li>Etikettieren Sie drei 15 ml Reaktionsröhrchen mit: Waschen (W), Positiver Bruch (+) und Negativfraktion (-).</li>
</ol>2. Netzhautdissoziation
<ol><li>Enthaupten Sie die PN 4 Welpen mit einer Schere.</li>
	<li>Spülen Sie den Kopf der Welpen kurz in 70% Ethanol gefolgt von Waschen in PBS.</li>
	<li>Übertragen Sie den Kopf auf kalte HBSS und enukleate das Auge (wiederholen Sie diesen Schritt für alle Köpfe). Um zu enukleieren, öffnen Sie die Augenlider und fixieren Sie das Auge mit gekrümmten Zangen an der Sehnervenregion. Ziehen Sie dann das Auge vorsichtig aus dem Orbit.</li>
	<li>Nachdem Sie alle Augen eingeschlossen haben, isolieren Sie die Netzhaut: führen Sie eine geschlossene Schere in den Sehnerv ein und öffnen Sie die Klingen. Peal die RPE / chorid aus. Entfernen Sie die Linsen und Blutgefäße mit gebogenen Zangen.</li>
	<li>Übertragen Sie die isolierten Netzhaut in ein 1,5 ml Reaktionsrohr, das die Papainlösung enthält (bereitgestellt durch das Papain-Dissoziationskit).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Netzhaut in der Papainlösung für 30-60 min in einem Wasserbad oder Shaker (400 Rpm) bei 37 °C.<ol>
<li>Während Die Netzhaut in der Papainlösung brütet, pipette 1 ml Ovomucoidlösung zu einem 15 ml Reaktionsröhrchen (Label "1").</li>
			<li>Fügen Sie 60 l DNase I (10 mg/ml) + 60 l Ovomucoid-Lösung (vom Kit bereitgestellt) + 520 l EBSS in ein 15 ml Reaktionsröhrchen (Label "2" ) ein.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Nach der Papain-Inkubation die Papainlösung mit den teilweise verdauten Netzhaut in die Reaktionsröhre "2" übertragen.</li>
	<li>Mit einer feuerpolierten Pipette, führen Sie mechanische Dissoziation (10x nach oben und unten).</li>
	<li>Pipette die einzellige Suspension zu Reaktionsrohr "1". Versuchen Sie, 2 Schichten zu erzeugen, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig auf die Ovomucoid-Lösung schichten.</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 300 x g (ca. 1.300 U/min).</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 500 l MACS-Puffer wieder aus.</li>
</ol>3. Zellsortierung mit magnetisch zugeordneter Zellsortierung (MACS)
<ol><li>Fügen Sie den Anti-CD73-Antikörper von X l Ratte zu den 500 l hinzu, um eine Endkonzentration von 10 g/ml zu erreichen.</li>
	<li>5 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Füllen Sie das 15 ml Reaktionsröhrchen mit MACS-Puffer auf 10 ml und zentrifugieren Sie es 5 min bei einer Geschwindigkeit von 300 x g.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in 480 l MACS-Puffer wieder auf und fügen Sie 120 l Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Mikroperlen hinzu.</li>
	<li>15 min auf Eis inkubieren; nicht rühren, schütteln oder mischen.</li>
	<li>Füllen Sie das 15 ml Reaktionsröhrchen mit MACS-Puffer auf 5 ml und zentrifugieren Sie es 5 min bei 300 x g.</li>
	<li>Da das Reaktionsrohr zentrifugiert ist:<ol>
<li>Stellen Sie eine LS-Säule in den magnetischen Ständer ein.</li>
			<li>Setzen Sie den Vortrennfilter auf die LS-Säule.</li>
			<li>Hydratisieren Sie den Vortrennfilter und die LS-Säule mit 3 ml MACS-Puffer und sammeln Sie den MACS-Puffer in das Waschrohr (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet im 500-l-MACS-Puffer wieder auf.</li>
	<li>Laden Sie die 500-l-Zellsuspension in den Filter, fügen Sie dem Filter 1 ml MACS-Puffer hinzu und sammeln Sie den negativen Bruch in das negative Bruch (-) Reaktionsrohr.</li>
	<li>Fügen Sie als Nächstes 3 x 3 ml MACS-Puffer zur Spalte hinzu, um die Zellen abzuwaschen, die nicht an die Spalte gebunden sind.</li>
	<li>Sobald diese 9 ml durch die LS-Säule sind, entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Ständer und installieren Sie sie auf dem positiven Bruch (+) Reaktionsrohr.</li>
	<li>Laden Sie schnell 5 ml MACS-Puffer in die LS-Säule und legen Sie den Kolben in die LS-Säule und drücken Sie ihn nach unten, bis der gesamte Puffer durch die Spalte ist.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Reaktionsrohr, das die positive Fraktion für 5 min bei 300 x g enthält.</li>
	<li>Den Überstand entfernen, in 500 l MACS-Puffer wieder aufhängen und bei 4 °C halten.</li>
	<li>Zählen Sie die Gesamtanzahl der Zellen mit einem gemeinsamen Zellzählgerät.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Zellsuspension aus der positiv sortierten Fraktion vor, die 2 x 105 Zellen/l im MACS-Puffer enthält, und halten Sie sie bei 4 °C</li>
</ol>4. Transplantation von MAC-sortierten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die Maus-Retina
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle folgenden Lösungen bereit sind: 1 ml sterile PBS oder HBSS, 10 l DNAse I, 1-2 ml steril deionisiert H2O, Aliquots der Zellsuspensionsfraktionen bei 4 °C.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie die erwachsene Maus(d. h. 2-4 Monate alt) mit einer intraperitonealen Injektion von Medetomidinhydrochlorid (0,01 mg/10 g Körpergewicht), Ketamin (0,75 mg/10 g Körpergewicht). Dann eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht) zur Schmerzlinderung.</li>
	<li>Delate Schüler mit einem Rückgang von Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.</li>
	<li>Fix Maus in Mauskopfhalter und unter Stereomikroskop platzieren.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen Visidisches Gel auf, um eine Trocknung des Auges zu verhindern.</li>
	<li>Machen Sie ein kleines Loch an der Grenze zwischen Sklera und Hornhaut (bzw. ora serrata) mit einer sterilen 30 G 1/2 in der Nadel.</li>
	<li>Schneiden Sie eine gemeinsame Abdeckung gleiten in kleine (ca. 5 mm x 5 mm) Stücke mit einem Diamant-Stift, legen Sie eines dieser Stücke auf die Hornhaut, so dass eine direkte Visualisierung der Netzhaut.</li>
	<li>Spülen Sie die vorsterilisierte Mikroliterspritze mehrmals mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Die Mikroliterspritze mit 1 l Zellsuspension beladen, die Nadel tangential durch die Bindehaut und Sklera leiten und unter visueller Kontrolle in die Nasenhälfte der Netzhaut stellen.</li>
	<li>Punch sanft ein Loch in die Netzhaut, bis er den subretinalen Raum erreicht, injizieren Sie die Zellsuspension in den subretinalen Raum.</li>
	<li>Beobachten Sie die bullöse Ablösung der Netzhaut, die einheitlich sein sollte und etwa 1/4 des Netzhautraums ohne Blutungen abdeckt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Spritze sanft zurück, das Netzhautloch versiegelt automatisch.</li>
	<li>Spülen Sie die Mikroliterspritze mehrmals mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Lösen Sie die Maus vom Kopfhalter.</li>
	<li>Wecken Sie die Maus durch Injektion von Atipamozolhydrochlorid zur Umkehrung des Medetomidin-Hydrochlorideffekts.</li>
	<li>Die Maus für die Aufwachzeit in eine warme dunkle Kammer (ca. 25 °C) stellen.</li>
	<li>Die nächsten 2 Tage nach der Transplantation sollte Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht) morgens und nachmittags zur Schmerzlinderung subkutan verabreicht werden.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die subretinale Transplantation von Photorezeptor-Vorläuferzellen stellt ein zuverlässiges Werkzeug dar, um die Integration dieser lichtempfindlichen Zellen in die Wirtsnetzhaut in signifikanten Zahlen1,2zu erreichen. Dies könnte die Etablierung einer Zelltherapie zur Behandlung von netzretinalen degenerativen Erkrankungen in Zukunft ermöglichen6. Die Spenderpopulation von Zellen, die derzeit aus PN 4-Retinas isoliert ist, ist eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen, aus der sich nach subretinaler Injektion nur die Ph...

Vision ist einer der wichtigsten Sinne des Menschen. Beeinträchtigung dieses Sinns und Blindheit sind einer der Hauptgründe für Behinderungen in Industrieländern. Die vorherrschende Ursache für Sehbehinderung oder Erblindung ist die Netzhautdegeneration, die durch Photorezeptorzellverlust gekennzeichnet ist, da sie bei Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Kegelstabdystrophie und anderen Bedingungen beobachtet werden kann. Bis heute ist eine wirksame Therapie zur Wiederherstellung des verlorenen Sehvermögens nicht verfügbar. In den Jahren 2006 und 2008 berichteten zwei verschiedene Labore unabhängig voneinander über eine erfolgreiche Transplantation von Rod-Photorezeptor-Vorläuferzellen in adulte Wildtyp-Mäuse-Retinas1,2. So entsteht die Möglichkeit der Photorezeptor-Vorläuferzelltransplantation auch in eine degenerierte Netzhaut, um degenerierte Photorezeptoren zu ersetzen und das Sehvermögen wiederherzustellen. Tatsächlich wurde in jüngster Zeit gezeigt, dass solche transplantierten Photorezeptor-Vorläuferzellen morphologische Kriterien von reifen Wildtyp-Photorezeptoren entlocken, wie z. B. richtig entwickelte äußere Segmente3, synaptische Klemmen in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen und einem runden Zellkörper in der äußeren Kernschicht2-4, sowie die Fähigkeit, sich funktional in die neuronale Schaltanlage des Wirts zu integrieren5-7. Eines der Hauptprinzipien dieser Strategie ist die Verwendung von postnatalen Tag 4 (PN 4, PN0 ist definiert als Tag der Geburt) junge Mäuse Netzhaut, was zu einer Mischung von verschiedenen Zelltypen für die Transplantation. Vor dem Hintergrund einer zukünftigen therapeutischen Anwendung muss diese Mischung für Photorezeptor-Vorläuferzellen gereinigt werden. CD73 wurde als erster Zelloberflächenmarker speziell für junge Photorezeptoren in der Netzhaut8-10beschrieben. Hier zeigen wir eine Photorezeptor-Vorläuferzellreinigungsmethode auf Basis dieses Zelloberflächenmarkers und unter Verwendung der magnetisch-assoziierten Zellsortierungstechnik (MACS). MACS könnte aufgrund der schnellen Sortierzeiten und der einfacheren Anpassung an GMP-Bedingungen Vorteile gegenüber fluoreszierend aktivierten Zellsortiertechniken haben. Wir könnten eine Anreicherung von 90 % und eine bis zu dreifach höhere Integrationsrate nachweisen, wenn wir die angereicherte Population in den subretinalen Raum in erwachsenen Wild-Retinas transplantieren. So sind MACS-basierte Photorezeptor-Vorläuferzellanreicherung und subretinale Transplantation zuverlässige und vielversprechende Techniken für die Entwicklung einer regenerativen therapeutischen Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration.

<table><tbody><tr><td>Papain-Dissoziationssystem</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>geliefert DNase I wird nicht in der Methode</td></tr><tr><td>verwendet Gereinigte Ratte Anti-Maus CD73, Klon TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>Stammkonzentration 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratte IgG MikroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>Gesamtvolumen von 2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Zur Zählung der Gesamtzahl der Zellen</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>Zur Dissoziation der Netzhaut</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>Zur Zählung der Gesamtzahl der Zellen</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 10%</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%</td><td>Universitätskliniken Dresden Apotheke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidefilter</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Feuerpolierglas Pasteur-Pipette</td><td>Marke</td><td>74777 20</td><td>Die Pipette Die Spitzen müssen feuerpoliert und autoklaviert werden.</td></tr><tr><td>MACS 15 ml Röhrchengestell</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>Zellzahlkammer</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Röhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD Leica M651 MSD</td><td></td><td></td><td>kann anstelle von Olympus SZX10 verwendet werden</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>kann anstelle von Leica M651 MSD</td></tr> <tr><td>verwendet werdenOlympus inverses Stereomikroskop CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturhaube Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Reaktionsröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Reaktionsröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>Mauskopfhalter</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Mikroliter Spritze 5 & Mikro; l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>wird ohne Nadeln geliefert</td></tr><tr><td>Hamilton RN Spezialnadel 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>Blunt, 12 mm Länge</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen Federschere - 5 mm Klingen Gerade</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzette - Titanium Biologie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Pen</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm Deckgläser</td><td>Sparks</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

subretinale transplantation von macs gereinigten photorezeptor-vorläuferzellen in die adulte maus-retina

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Sehstörungen und Erblindung durch den Verlust der lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut, d.h. Photorezeptoren, stellen den Hauptgrund für behinderungen in Industrieländern dar. Der Ersatz degenerierter Photorezeptoren durch Zelltransplantation stellt eine mögliche Behandlungsoption in zukünftigen klinischen Anwendungen dar. Tatsächlich haben jüngste präklinische Studien gezeigt, dass unreife Photorezeptoren, die am 4. Tag der Neugeborenen mausisoliert wurden, das Potenzial haben, sich nach subretinaler Transplantation in die netzretinale Netzhaut der erwachsenen Maus zu integrieren. Spenderzellen erzeugten eine ausgereifte Photorezeptormorphologie mit inneren und äußeren Segmenten, einem runden Zellkörper an der äußeren Kernschicht und synaptischen Terminals in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen. Tatsächlich haben jüngste Berichte gezeigt, dass Spenderphotorezeptoren sich funktionell in die neuronalen Schaltkreise von Wirtsmäusen integrieren. Für eine zukünftige klinische Anwendung eines solchen Zellersatzansatzes müssen gereinigte Suspensionen der Zellen der Wahl erzeugt und an die richtige Position für eine ordnungsgemäße Integration in das Auge gebracht werden. Für die Anreicherung von Photorezeptor-Vorläufern sollte die Sortierung auf bestimmten Zelloberflächenantigenen basieren, um eine genetische Reporterveränderung von Spenderzellen zu vermeiden. Hier zeigen wir magnetisch-assoziierte Zellsortierung (MACS) - Anreicherung von transplantierbaren Stabphotorezeptor-Vorläufern, die aus der neonatalen Netzhaut von photorezeptorspezifischen Reportermäusen auf Basis des Zelloberflächenmarkers CD73 isoliert sind. Die Inkubation mit Anti-CD73-Antikörpern gefolgt von mikro-bead-konjugierten sekundären Antikörpern ermöglichte die Anreicherung von Rod-Photorezeptor-Vorläufern durch MACS auf ca. 90%. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil, dass es einfacher auf GMP-Standards angewendet werden kann und dass große Mengen an Zellen in relativ kurzen Zeiträumen sortiert werden können. Die Injektion angereicherter Zellsuspensionen in den subretinalen Raum erwachsener Wildtypmäuse führte zu einer 3-fach höheren Integrationsrate im Vergleich zu unsortierten Zellsuspensionen.

Um die Fähigkeit von Stabphotorezeptoren zur Integration in die Mausnetzhaut zu beurteilen, wurde eine Mausreporterlinie verwendet, in der GFP vom neuronalen Retina-Leucin-Reißverschluss (Nrl, Nrl-GFP) Promotor11angetrieben wird. Nrl ist der früheste Marker von Stabphotorezeptoren, die seine Expression bei E12.5 während des gesamten Erwachsenenalters beginnen, was eine spezifische Kennzeichnung von Spenderstab-Photorezeptorzellen ermöglicht.
PN 4 Nrl-GFP Welpen wurden enthauptet und...

Die Zelltransplantation stellt eine Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration dar, die durch Photorezeptorverlust gekennzeichnet ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinaler Transplantation in erwachsene Mäuse.

Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, angereicherte Photorezeptor-Vorläuferzellen in eine Empfänger-Mausretina zu transplantieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Augenretina junger Spendertiere isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die postnatalen Photorezeptor-Vorläuferzellen mittels magnetisch basierter, CD73-abhängiger Zellsortierung aus der retinalen Zellpopulation isoliert.Anschließend werden die Photorezeptorvorläuferzellen in den subretinalen Raum von Empfängertieren transplantiert, um deren Integration in die Netzhaut des Empfängers zu ermöglichen. Letztendlich kann das Integrationspotenzial und das Verhalten der transplantierten Photorezeptorvorläuferzellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Netzhautregeneration zu beantworten, beispielsweise welches Potenzial transplantierte Photorezeptoren besitzen, sich in die neuronale Verschaltung des Wirts einzulagern, um die Sehfunktion wiederherzustellen.Die Implikationen dieser Technik reichen über die Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen hinaus. Sobald die Einbringung und Anreicherung von Photorezeptorvorläufern mittels max leicht an GMP-Bedingungen angepasst werden kann, ist die visuelle Demonstration dieser Methode entscheidend, da die Transplantationsschritte schwer zu erlernen sind und die schonende Handhabung sowie Platzierung der Nadel im subretinalen Raum entscheidend für einen maximalen Erfolg und eine hohe Reproduzierbarkeit ist. Um die Netzhäute zu dissociieren, spülen Sie zunächst kurz die Köpfe von vier Tage alten Nachkommen in 70 %igem Ethanol, gefolgt von einer PBS-Spülung.Überführen Sie dann die Köpfe in kaltes HBSS, um die Augen für jedes Auge zu isolieren. Öffnen Sie zuerst das Augenlid. Verwenden Sie dann ein Paar gebogener Pinzetten.Fassen Sie das Organ im Bereich des Sehnervs an und ziehen Sie das Auge vorsichtig aus der Augenhöhle heraus. Um als Nächstes die Netzhaut zu isolieren, führen Sie die Spitze eines geschlossenen Scherenpaares in den Sehnerv ein und öffnen die Klingen. Lösen Sie das retinale Pigmentepithel und die Aderhaut ab und entfernen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Linse und die Gefäßfäden.Die isolierten Netzhäute in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Papain-Lösung für 30 bis 60 Minuten in einem Schüttler bei 400 U/min und 37 Grad Celsius inkubieren. Während die Netzhäute inkubieren, eine Milliliter OVO-Moid-Lösung in ein 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen geben, beschriftet mit eins, danach in ein 2-Milliliter-Reaktionsröhrchen, beschriftet mit zwei, 60 Mikroliter DNAs, 60 Mikroliter OVO-Moid-Lösung und 520 Mikroliter EBSS. Nach der Inkubation die Papain-Lösung, die die teilweise verdauten Netzhäute enthält, in das Reaktionsröhrchen zwei überführen und anschließend die Netzhäute 10-mal mit einer feuerpolierten Pipette auf- und abpipettieren.Geben Sie die Einzelzell-Suspension vorsichtig auf die OVO MOID-Lösung in Reaktionsgefäß eins und zentrifugieren Sie die Zelllösung fünf Minuten bei 300 × g und Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 µL Max-Puffer. Um nach Max zu sortieren, inkubieren Sie die Zellen zunächst mit 10 µg/mL Ratten-Anti-CD73-Antikörper auf Eis.Nach fünf Minuten waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter Max-Puffer. Resuspendieren Sie dann das Pellet in 480 Mikroliter Max-Puffer und inkubieren Sie die Zellen in 120 Mikroliter GO anti RET IgG-Mikroperlen auf Eis, ohne zu rühren, schütteln oder mischen. Nach 15 Minuten waschen Sie die Zellen in fünf Milliliter Max-Puffer; während der Wäsche bringen Sie eine LS-Säule an einem Max-Magneten an und setzen einen Prä- Separationsfilter auf die Säule.Als Nächstes hydratisieren Sie den Filter und die Säule mit drei Millilitern Max-Puffer. Sammeln Sie den Puffer in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das mit W für Wash (Waschen) beschriftet ist. Wenn die Zellen fertig zentrifugiert sind, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Max-Puffer und geben Sie die Zellen in den Filter. Gebe ein Milliliter Max-Puffer auf die Zellen und sammle anschließend die negative Fraktion in einem 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen, das mit „minus“ für negativ gekennzeichnet ist. Gib danach dreimal nacheinander jeweils drei Milliliter Max-Puffer auf die Säule, um sie zu waschen. Entferne nun die Säule vom Magnethalter.Befestigen Sie sie auf einem 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen, das mit „plus“ für positiv gekennzeichnet ist. Geben Sie schnell 5 Milliliter Max-Puffer in die Säule. Drücken Sie den gesamten Puffer durch die Säule und resuspendieren Sie danach das Pellet nach dem Zentrifugieren der positiven Fraktion in 500 Mikroliter Max-Puffer.Stellen Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und zählen Sie sie. Anschließend stellen Sie die Konzentration auf zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Mikroliter in Max-Puffer ein, wobei die Zellen bei vier Grad Celsius gehalten werden. Für die Transplantation der isolierten Photorezeptor-Vorläuferzellen weiten Sie die Pupillen einer sedierten erwachsenen Maus mit einem Tropfen Phenylephrin-tropischer Lösung, während die Pupillen dilatieren. Verwenden Sie einen Diamantschneider, um eine Deckglasplatte in etwa fünf mal fünf Millimeter große Stücke zu zerschneiden.Platzieren Sie die Maus unter einem Stereomikroskop, fixieren Sie das Tier in einer Maus-Kopfhalterung und geben Sie dann einen Tropfen ICIC-Gel auf jedes Auge, um Austrocknung zu verhindern. Verwenden Sie nun eine halb Zoll lange Nadel mit 30 Gauge, um ein kleines Loch an der Grenze zwischen Sklera und Kornea zu erzeugen. Legen Sie danach eines der fünf mal fünf Millimeter großen Deckgläschen auf die Kornea, um eine direkte Visualisierung der Netzhaut zu ermöglichen.Als Nächstes spülen Sie eine vosterilisierte Mikroliterspritze mehrmals mit steriler, deionisierter Wasser durch und füllen Sie anschließend mit einer der sortierten Zellsuspensionen. Führen Sie die Nadel diagonal durch die Bindehaut und die Sklera, sodass sie im nasalen Bereich der Netzhaut positioniert ist. Stich dann vorsichtig ein Loch durch die Netzhaut in den subretinalen Raum und injizieren die Zellen.Bestätigen Sie die blasenförmige, gleichmäßige Ablösung der Netzhaut, die ungefähr ein Viertel der Netzhautfläche abdecken sollte, ohne jegliche Blutung. Ziehen Sie dann die Spritze vorsichtig zurück und spülen Sie sie mehrmals erneut mit ionisiertem Wasser aus. Schließlich befreien Sie die Maus aus dem Fixiergerät.Spritzen Sie dem Tier Aamaz-Öl-Hydrochlorid, um die Wirkung der Anästhesie umzukehren, und lassen Sie es zur Beurteilung der Fähigkeit von Stäbchenphotorezeptoren, sich in die Mausretina einzulagern, in einer dunklen Kammer bei 25 Grad Celsius erholen. Es wurde eine Maus-Reporterlinie verwendet, bei der die Expression von GFP durch den Neural Retina Leucine Zipper oder NRL-Promotor gesteuert wird, wie in diesen Histogrammen dargestellt. Die anfängliche retinale Zellsuspension enthielt 30,4 % GFP-positive Stäbchenphotorezeptoren.Nach der CD73-basierten Max-Sortierung und Anreicherung wurde im CD73-positiven Anteil eine Anreicherung von bis zu 86,9 % der GFP-positiven Photorezeptorvorläuferzellen beobachtet, während im CD73-negativen Anteil lediglich 9,9 % der Zellen GFP-positiv waren. Ebenso wurde eine Anreicherung der N-R-L-G-F-P-positiven Zellen nach der CD73-basierten Max-Sortierung beobachtet.Nach der In-vitro-Aussaat verbleiben die Donorzellen an der Injektionsstelle, die durch die bullöse abgelöste Wirtshaut definiert ist, und integrieren sich in die äußere nukleäre Schicht der Wirtshaut, wobei sie die Morphologie ausgereifter Photorezeptoren annehmen. Die magnetische Assoziationszellseparation kann innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, sofern korrekt ausgeführt. Dieses Verfahren kann ebenfalls zur Anreicherung von aus Stammzellen abgeleiteten Photorezeptoren oder sogar anderer retinaler Stammzellen angepasst werden.Angesichts der Verfügbarkeit spezifischer Antikörper, um weitere Fragen hinsichtlich der Wiederherstellung oder des Rettungsprozesses durch Zelltransmutation für die Netzhaut zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man photo-max-anreiche Photorezeptorvorläuferzellen in den subretinalen Raum von Empfängermäusen transplantiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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