Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, atherosklerotische Läsionen im MI-Aortensinus zu charakterisieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein extrahiertes Herz präpariert wird, um den apikalen Teil zu trennen und den Aortensinus zu lokalisieren. Als nächstes werden Paraffinblöcke mit dem verarbeiteten apikalen Teil des Herzens hergestellt.

Dann wird der Aortensinus durchtrennt und auf Objektträger montiert. Abschließend werden die Gewebeschnitte angefärbt. Letztendlich können durch histochemische und immunhistochemische Analysen Ergebnisse erzielt werden, die unterschiedliche Größen und Zusammensetzungen von atherosklerotischen Läsionen zeigen.

Das Verfahren wird von Daniel Venga Penal, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Das Ethikgremium für Tierversuche der McMaster University hat alle hierin beschriebenen Verfahren vorab genehmigt, nachdem eine doppelt negative LDLR-Maus anästhesiert und das Blut extrahiert, eingeschläfert und fixiert wurde, bevor das Herz gemäß dem Textprotokoll isoliert wurde, ein Skalpell verwendet wurde, um einen queren Schnitt am Herzen senkrecht zur aufsteigenden Aorta zu machen. Legen Sie den apikalen oder oberen Teil des Herzens in eine Einbettkassette und tauchen Sie sie in Formin.

Legen Sie die Kassette dann in einen Taschentuchprozessor und verarbeiten Sie sie über Nacht. Mit dem im Textprotokoll für die Histologie beschriebenen Programm schmelzen die Formen Paraffinwachs über Nacht bei 62 Grad Celsius. Legen Sie jedes Prozessgewebe in eine tiefe Histologieform, stellen Sie sicher, dass die Grenzfläche des Herzens den Boden der Form berührt, und gießen Sie dann geschmolzenes Paraffinwachs ein, um die Form vollständig zu füllen.

Verwenden Sie eine beschriftete Plastikkassette, um die Form abzudecken. Nachdem Sie die Formen auf Eis oder einer kalten Oberfläche abgekühlt haben, trennen Sie den Block von der Form, um die Aorta zu durchtrennen. Positionieren Sie den Block so im Probenhalter des Mikrotoms, dass er von innen zum oberen Teil des Herzens hin geschnitten werden kann.

Stellen Sie das Mikrotom auf 10 Mikrometer ein und schneiden Sie das Herz. Sammeln Sie Schnitte auf einem Objektträger und untersuchen Sie sie unter einem Lichtmikroskop, um Position und Ausrichtung zu bestimmen. Der Sinus sollte als drei zweiteilige Klappenbasen mit angehängten Segeln erscheinen.

Wenn eine oder zwei Klappen der Aortenhöhle sichtbar werden, passen Sie den Winkel des Blocks nach Bedarf an. Wenn die Ventile erreicht sind, stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es um vier bis fünf Mikrometer geschnitten wird. Montieren Sie die ersten 10 Abschnitte jeweils an der Oberseite einzelner Glasobjektträger und montieren Sie dann jede nachfolgende Gruppe von 10 Abschnitten an der nächsten Position.

Auf den Folien. Fahren Sie mit der Entnahme von Schnitten fort, bis keine atherosklerotische Läsion mehr beobachtet wird. Um Schnitte mit Hämatin und Eoin zu färben, um Läsionen sichtbar zu machen, legen Sie die Objektträger acht Minuten lang in einen Lufttrockner.

Dann die Abschnitte entschärfen, indem Sie sie mit Xylol viermal für jeweils drei Minuten waschen. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils drei Minuten in 100%igem Ethanol. Dann 70% Ethanol und 50% Ethanol.

Dreimal für jeweils drei Minuten. Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab und tauchen Sie sie dann hinein. MAs Hämatin für 15 Minuten.

Waschen und Laufen. Leitungswasser für fünf Minuten. Waschen Sie dann das destillierte Wasser fünf Minuten lang, nachdem Sie es ein bis fünf Minuten lang in Eoin Y getaucht haben.

Waschen und destilliertes Wasser dreimal für jeweils fünf Minuten. 50% Ethanol zweimal für jeweils zwei Minuten. Dann dreimal 70 % Ethanol für jeweils zwei Minuten und 100 % Ethanol.

Dreimal für jeweils zwei Minuten. Dann waschen und viermal für jeweils zwei Minuten xylolen. Verwenden Sie ein Eindeckmedium auf Xylolbasis, um die Schnitte zu montieren und Bilder unter einem Lichtmikroskop aufzunehmen.

Verwenden Sie eine Bildgebungssoftware, um Läsionen zu identifizieren und zu quantifizieren, die in bestimmten Abständen von 40 bis 50 Mikrometern in Abständen von 40 bis 50 Mikrometern bestimmt werden können, siehe das Textprotokoll für immunhistochemische und Immunfluoreszenzfärbung. Fünf Wochen altes LDLR. Positive Mäuse erhielten 10 Wochen lang eine Standarddiät oder eine fettreiche Diät, bevor ihre Herzen fixiert, isoliert und geschnitten wurden, wie hier gezeigt.

Wenn Mäuse mit einer Standardnahrung gefüttert werden, ist die atherosklerotische Entwicklung sehr begrenzt und möglicherweise nach 15 Wochen nicht mehr nachweisbar. Eine fettreiche Ernährung beschleunigt die Atherogenese in diesem Modell signifikant und induziert die Bildung großer fortgeschrittener Läsionen, die chronische azelluläre Kerne und fibröse Kappen enthalten. Atherosklerotische Läsionen können weiter charakterisiert werden, indem auf das Vorhandensein spezifischer Zelltypen und Faktoren gefärbt wird, die die Stadien der Läsionsentwicklung definieren.

Die Infiltration der Monozyten in die Intima stellt eines der frühesten Ereignisse der Atherogenese der Intima dar. Monozyten differenzieren sich zu Makrophagen, die Zelltrümmer und Lipide verschlingen. Mit Lipiden vollgestopfte Makrophagen, die als Schaumzellen bekannt sind, erzeugen einen Fettstreifen in der Arterienwand, der hier zu sehen ist.

Makrophagen-Schaumzellen können in allen Stadien der Läsionsentwicklung nachgewiesen werden, indem mit Antikörpern gegen spezifische Makrophagenmarker wie F vier 80 und MAC drei gefärbt wird. Vaskuläre glatte Muskelzellen oder v SMCs sind auf die mediale Schicht einer gesunden Arterie beschränkt. VSCs werden während der Entwicklung einer fortgeschrittenen Läsion dazu angeregt, in der Intima zu migrieren und zu prolifern.

Wie in diesem Panel zu sehen ist, können V-SMCs durch Färbung mit einem Antikörper gegen Alpha-Aktin nach seiner Entwicklung identifiziert werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Erkrankungen den Weg, um die Entwicklung und das Fortschreiten atherosklerotischer Läsionen in Stäbchen zu erforschen.