Name: Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-07T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Analyse atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus. Diese Methode nutzt histochemische und immunhistochemische Techniken zur Charakterisierung von Läsionsgröße und -zusammensetzung.

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Diese Forschung wurde durch einen Betriebskostenzuschuss der Canadian Institutes of Health Sciences und der Canadian Diabetes Association finanziert. DEV wird durch ein Stipendium der Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chile) unterstützt.

Das Ethikgremium für Tierversuche der McMaster University hat alle hier beschriebenen Verfahren vorab genehmigt.
1. Entnahme von Herz und Aorta
<ol>
	<li>Betäuben Sie die Maus und öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle, um das Herz und die proximale Aorta freizulegen.
	<ol>
		<li>Entnehmen Sie der Maus das Blut durch direkte Punktion des rechten Ventrikels des Herzens. 
		Hinweis: Das Blut kann gespeichert und für die Analyse von Plasmalipiden und anderen durch Blut übertragenen Faktoren verwendet werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation.</li>
	<li>Spülen Sie das Gefäßsystem mit 5 ml Kochsalzlösung. 
	Hinweis: Dies wird durch Schwerkraftperfusion durch eine Nadelpunktion in den linken Ventrikel erreicht. Um die Drainage zu ermöglichen, wird ein kleiner Schnitt im rechten Vorhof gemacht. Nach dem Spülen des Gefäßsystems können Gewebeproben von Leber-, Muskel- und Fettgewebe entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ºC für zukünftige Analysen gelagert werden.</li>
	<li>Das Gefäßsystem wird durch Schwerkraftperfusion in den linken Ventrikel mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. 
	Hinweis: Sobald die Perfusion gestartet ist, wird der Fluss von 10% neutral gepuffertem Formalin auf einen langsamen Tropfen eingestellt, so dass der Prozess 1-2 Minuten dauert. Organe und Gewebe, die perfusionsfixiert wurden, können zur Untersuchung der Proteinexpression durch Immunfluoreszenz oder Histochemie verwendet werden, aber sie können im Allgemeinen nicht als Proben für Western Blotting oder zur Untersuchung der Genexpression verwendet werden.</li>
	<li>Das Herz und ca. 2 mm der proximalen Aorta werden vorsichtig aus dem Schlachtkörper entnommen. Andere Gewebe, einschließlich der absteigenden Aorta, können entnommen und für eine spätere Analyse gelagert werden. 
	Hinweis: Die absteigende Aorta (bis zur Beckenbifurkation) kann auch zur Untersuchung der Atherosklerose verwendet werden.</li>
	<li>Machen Sie mit einem Skalpell einen Querschnitt auf dem entnommenen Herzen, der senkrecht zur aufsteigenden Aorta verläuft. 
	Hinweis: Dies wird durch den Einsatz eines Präpariermikroskops erleichtert und kann effektiv durch Schneiden entlang einer geraden Linie erfolgen, die die unteren Spitzen des rechten und linken Vorhofs verbindet (Abbildung 1).</li>
	<li>Bewahren Sie den apikalen (oberen) Teil des Herzens in einer Einbettkassette auf und tauchen Sie ihn zur Verarbeitung in neutral gepuffertes Formalin.</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Aorta
<ol>
	<li>Legen Sie die Kassette mit dem präparierten Gewebe in den Gewebeprozessor.</li>
	<li>Gewebeproben verarbeiten. 
	Hinweis: Im Allgemeinen sind Gewebeverarbeiter so programmiert, dass sie aufgrund der Dauer des Eingriffs und der an diesem Prozess beteiligten Lösungen über Nacht arbeiten. Die Proben werden nach einem festgelegten Protokoll verarbeitet:
	<ol>
		<li>10% neutral gepuffertes Formalin für 1 Stunde bei 42 ºC.</li>
		<li>10% neutral gepuffertes Formalin für 1 Stunde bei 42 ºC.</li>
		<li>70% Ethanol für 30 min bei 40 ºC.</li>
		<li>85% Ethanol für 30 min bei 40 ºC.</li>
		<li>100% Ethanol für 45 min bei 40 ºC.</li>
		<li>100% Ethanol für 45 min bei 40 ºC.</li>
		<li>100% Ethanol für 45 min bei 40 ºC.</li>
		<li>Xylol für 1 Stunde bei 40 ºC.</li>
		<li>Xylol für 1 Stunde bei 40 ºC.</li>
		<li>Xylol für 1 Stunde bei 40 ºC.</li>
		<li>Paraffinwachs für 45 min bei 63 ºC.</li>
		<li>Paraffinwachs für 45 min bei 63 ºC.</li>
		<li>Paraffinwachs für 45 min bei 63 ºC.</li>
		<li>Paraffinwachs für 45 min bei 63 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schmelzen Sie das Paraffinwachs über Nacht bei 62 ºC (Abbildungen 1D-E). Schätzen Sie die Gesamtmenge an zu verwendendem Paraffinwachs auf der Grundlage der Gramm Paraffinwachs, die zum Füllen einer Histologieform benötigt werden, und der Anzahl der vorzubereitenden Blöcke. 
	Hinweis: Eine tiefe Histologieform wird einer flachen Form vorgezogen, da sie beim Schneiden einen größeren potenziellen Drehwinkel bietet. Für einen einzigen tiefen Histologieschimmel werden 11 g Paraffinwachs benötigt.</li>
	<li>Legen Sie jedes verarbeitete Gewebe in eine tiefe Histologieform und gießen Sie dann geschmolzenes Paraffinwachs ein, um die Form vollständig zu füllen (Abbildung 1F). Decken Sie die Form mit einer beschrifteten Kunststoffkassette ab (Abbildung 1G).</li>
	<li>Kühlen Sie die gefüllte Form auf Eis oder auf einer kalten Oberfläche ab (Abbildung 1H), um den festen Block zu erzeugen und den Block von der Form zu trennen (Bilder 1I-J). 
	Hinweis: Wenn Sie das präparierte Herz in die Form legen, stellen Sie sicher, dass die Innenseite des Herzens den Boden der Form berührt, und füllen Sie dann den Block mit geschmolzenem Paraffin. Eine beschriftete Kunststoffkassette bedeckt die Form, bevor sie erstarrt, um eine Basis für die Handhabung des Blocks zu schaffen. Nach dem Abkühlen wird die Form entfernt und die Paraffinblöcke können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
</ol>
3. Schnitt der Aorta
<ol>
	<li>Positionieren Sie den Block mit dem Herz in der Probenhalterung des Mikrotoms, so dass er von innen nach oben zum Herzen hin geschnitten werden kann (Abbildung 2)</li>
	<li>Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es eine Schnittdicke von 10 μm schneidet, und fahren Sie mit dem Schnitt des Herzens fort.</li>
	<li>Sammeln Sie Schnitte auf einem Objektträger und untersuchen Sie sie unter einem Lichtmikroskop, um Position und Ausrichtung zu bestimmen.</li>
	<li>Wenn 1 oder 2 Klappen der Aortenhöhle sichtbar werden, stellen Sie den Winkel des Blocks nach Bedarf ein (Abbildung 3A). 
	Hinweis: Der Sinus sollte als drei zweiteilige Klappenbasen mit angehängten Segeln erscheinen. Wenn nur ein oder zwei Klappensegel beobachtet werden, sollte der Schnittwinkel entsprechend angepasst werden.</li>
	<li>Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es bei 4-5 μm schneidet, und sammeln Sie die Schnitte auf beschichteten Glasobjektträgern. 
	Hinweis: Obwohl das Verfahren variiert werden kann, wird ein systematisches Vorgehen empfohlen, bei dem die ersten 10 Schnitte vom Aortensinus bis zur aufsteigenden Aorta auf den oberen Teil eines beschrifteten Objektträgers (Objektträger mit der Bezeichnung 1-10) gesammelt werden. Die folgenden Schnitte werden nach dem gleichen Muster gesammelt: #11-20, #21-30, #31-40, bis die atherosklerotischen Läsionen nicht mehr beobachtet werden (Abbildung 3B). Auf diese Weise können die atherosklerotischen Läsionen an präzisen Stellen entlang der aufsteigenden Aorta untersucht und charakterisiert werden. Folie 1 enthält beispielsweise die Abschnitte 1, 11, 21, 31, 41 und 51, die atherosklerotische Läsionen vom Aortensinus bis zur aufsteigenden Aorta darstellen. Zusätzliche Objektträger mit den Bezeichnungen 11-20 können eingefügt werden, wenn die Läsion groß ist, um mehr distale Schnitte nach dem gleichen Muster zu sammeln.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Entnahme von Schnitten fort, bis keine atherosklerotische Läsion mehr beobachtet wird. 
	Hinweis: Objektträger können vor der weiteren Analyse monatelang bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
</ol>
4. Färbung und Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen
Atherosklerotische Läsionen können auf viele verschiedene Arten mit einer Vielzahl von Techniken analysiert werden. Die grundlegendste Analyse umfasst die Bestimmung der Querschnittsfläche der Läsion. Um den Läsionsbereich genau vergleichen zu können, ist es wichtig, dass der Ausgangspunkt für die Läsionsmessung von Probe zu Probe gleich ist. Dies wird durch die Verwendung der Klappenflügel zur Orientierung erleichtert. Um die genaue Identifizierung und Quantifizierung des Läsionsbereichs zu erleichtern, werden ausgewählte Querschnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Dabei werden die Objektträger für eine bestimmte Zeit in eine Reihe von Lösungen getaucht, die das Gewebe entparaffinieren/verfärben.
Protokoll für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung:
<ol>
	<li>Legen Sie die Objektträger für 8 Minuten in den Lufttrockner und entparaffinieren Sie die Abschnitte, indem Sie 4× in Xylol waschen, 3 Minuten pro Waschgang.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger in 100% Ethanol 3× für jeweils 3 min.</li>
	<li>3 × in 70 % Ethanol für jeweils 3 min und dann 2 × in 50 % Ethanol für jeweils 3 min waschen.</li>
	<li>Mit destilliertem Wasser abspülen und anschließend 15 min in Mayer's Hämatoxylin tauchen.</li>
	<li>5 Minuten unter fließendem Leitungswasser waschen, dann 5 Minuten in destilliertem Wasser waschen.</li>
	<li>1-5 Min. in Eosin Y eintauchen.</li>
	<li>In destilliertem Wasser 3× für je 5 min waschen, in 50% Ethanol 2× für je 2 min waschen, dann 70% Ethanol 3× für jeweils 2 min.</li>
	<li>In 100% Ethanol 3× für je 2 min waschen, dann in Xylol 4× für jeweils 2 min waschen.</li>
	<li>Montieren Sie Schnitte mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis und nehmen Sie Bilder mit einer Digitalkamera auf, die an einem Lichtmikroskop montiert ist.</li>
	<li>Identifizieren und quantifizieren Sie den Läsionsbereich mit Hilfe von Bildgebungssoftware. 
	Hinweis: Die Läsionsfläche kann in bestimmten Abständen von 40-50 μm vom Aortensinus bestimmt werden (abhängig von der Dicke des jeweiligen Abschnitts). Ein Diagramm dieser Flächenmessungen über die Entfernung ergibt ein Profil der atherosklerotischen Läsion (Abbildung 4). Die Fläche unter der Kurve stellt eine Schätzung des Gesamtvolumens der atherosklerotischen Läsion dar. Eine zusätzliche Charakterisierung der Läsion kann die Bestimmung des nekrotischen Bereichs umfassen. Der nekrotische Kern (nc) einer fortgeschrittenen Läsion wird aus apoptotischen Schaumzellen gebildet. In der Praxis kann dies durch Untersuchung der azellulären Regionen der Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Schnitte festgestellt werden (Abbildung 4A). Frühe Läsionen neigen dazu, sehr wenig Nekrose zu haben, während fortgeschrittenere Läsionen vermehrte nekrotische Bereiche aufweisen, die zur Plaqueinstabilität beitragen können. Serielle Schnitte derselben Aorta sollten untersucht werden, um das Vorhandensein einer nekrotischen Region zu bestätigen.</li>
</ol>
5. Weitere Charakterisierung der atherosklerotischen Läsion
Spezifische Details bezüglich des Stadiums der atherosklerotischen Entwicklung können durch Färben mit Antikörpern bestimmt werden, die gegen bestimmte Zelltypen oder Marker gerichtet sind. Die Immunhistochemie an Paraffinschnitten ist eine Standardtechnik, die verwendet wird, um bestimmte Zelltypen oder Marker im Kontext des umgebenden ungefärbten Gewebes zu identifizieren. Der Antigennachweis wird in der Regel unter Verwendung eines Meerrettichperoxidase-Substrats erreicht.
Immunfluoreszenzfärbung beinhaltet die Verwendung von Fluorophor-konjugierten Antikörpern und erfordert ein Fluoreszenzmikroskop und geeignete Filter zum Nachweis. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Färbung von zwei (oder mehr) Antigenen.
Allgemeines Protokoll für die immunhistochemische Färbung:
<ol>
	<li>Legen Sie die Dias für 8 Minuten in den Lufttrockner.</li>
	<li>Entparaffinieren Sie Abschnitte in 4 Änderungen von Xylol, 3 min jeweils.</li>
	<li>In 100% Ethanol 3× jeweils 3 min waschen, um Xylol zu entfernen.</li>
	<li>3 × in 70 % Ethanol für jeweils 3 min waschen, dann 2 × in 50 % Ethanol für jeweils 3 min.</li>
	<li>Jeweils 5 Minuten in destilliertem Wasser waschen, dann 3 × in PBS für jeweils 5 Minuten waschen.</li>
	<li>Führen Sie eine Antigen-Entnahme durch. Dies kann mit der HIER-Methode (Heat-Induced Epitope Retrieval) in einem Mikrowellen-Schnellkochtopf und einer Antigen-Retrieval-Lösung (10 mM Citratpuffer, pH 6,0) erreicht werden. 
	Hinweis: Der Prozess der Formalinfixierung kann die interessierenden Antigene maskieren. Unserer Erfahrung nach verbessert der HIER die Leistung einiger Antikörper erheblich, ist aber für andere nicht erforderlich. Darüber hinaus gibt es weitere verfügbare Alternativen zur HIER-Methode der Antigen-Retrieval.</li>
	<li>Wenn der Schnellkochtopf abgekühlt ist, legen Sie die Objektträger für 15 Minuten in PBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie Schnitte 30 Minuten lang in normalem Serum (von derselben Spezies, von der der Sekundärantikörper abgeleitet wurde). OBJEKTTRÄGER NICHT WASCHEN - SERUM ABTROPFEN LASSEN.</li>
	<li>Mit einem in normalem Blockierungsserum verdünnten Primärantikörper 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Mit PBS 3× jeweils 5 min waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schnitte mit dem biotinylierten Sekundärantikörper, der 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS verdünnt wurde.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit Meerrettichperoxidase Streptavidin und waschen Sie sie dann jeweils 5 Minuten lang mit PBS 3×.</li>
	<li>Chromogene Reaktion - Inkubieren Sie die Objektträger in frischem DAB (3,3'-Diaminobenzidin) für 5-30 min. Diese Reaktion sollte mit einem Mikroskop überwacht werden. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Leitungswasser waschen.</li>
	<li>Den Fleck 1 Minute lang mit Hämatoxylin kontern. 5 Minuten mit Leitungswasser waschen, dann 3× in destilliertem Wasser für jeweils 5 Minuten waschen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.9 für die Montage von Objektträgern.</li>
</ol>
6. Allgemeines Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung
Ein ähnliches Protokoll mit geringfügigen Änderungen kann für die Immunfluoreszenzfärbung befolgt werden.
<ol>
	<li>Legen Sie die Objektträger für 8 Minuten in den Lufttrockner und entparaffinieren Sie die Abschnitte in 4 Xylol-Wechseln à 3 Minuten.</li>
	<li>In 100% Ethanol 3× jeweils 3 min waschen, um Xylol zu entfernen.</li>
	<li>3 × in 70 % Ethanol für jeweils 3 min waschen, dann 2 × in 50 % Ethanol für jeweils 3 min.</li>
	<li>In destilliertem Wasser jeweils 5 Minuten waschen, dann in PBS 3× jeweils 5 Minuten waschen.</li>
	<li>Führen Sie eine Antigen-Entnahme durch. Dies kann mit der HIER-Methode (Heat-Induced Epitope Retrieval) in einem Mikrowellen-Schnellkochtopf und einer Antigen-Retrieval-Lösung (10 mM Citratpuffer, pH 6,0) erreicht werden. 
	Hinweis: Der Prozess der Formalinfixierung kann die interessierenden Antigene maskieren. Unserer Erfahrung nach verbessert der HIER die Leistung einiger Antikörper erheblich, ist aber für andere nicht erforderlich. Darüber hinaus gibt es weitere verfügbare Alternativen zur HIER-Methode der Antigen-Retrieval.</li>
	<li>Wenn der Schnellkochtopf abgekühlt ist, legen Sie die Objektträger für 15 Minuten in PBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie Schnitte 30 Minuten lang in normalem Serum (von derselben Spezies, von der der Sekundärantikörper abgeleitet wurde). OBJEKTTRÄGER NICHT WASCHEN - SERUM ABTROPFEN LASSEN.</li>
	<li>Mit einem in normalem Blockierungsserum verdünnten Primärantikörper 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Mit PBS 3× jeweils 5 min waschen.</li>
	<li>Fügen Sie einen sekundären Fluorophor-konjugierten Antikörper hinzu, der in normalem Blockierungsserum (oder PBS) verdünnt ist. 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Mit PBS 3× jeweils 5 min waschen.</li>
	<li>Gegenbeize mit DAPI.</li>
	<li>In PBS 3× jeweils 5 min waschen.</li>
	<li>Bringen Sie ein Deckglas mit Antifading-Eindeckmittel an.</li>
</ol>

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<li>Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+atherosclerotic+lesions+in+the+innominate+artery+of+the+ApoE+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).</li>
<li>McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+3Dreconstruction+of+atherosclerotic+plaque+components+in+apolipoprotein+E+knockout+mice+using+ex+vivo+high-resolution+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).</li>
<li>Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine%3A+Microscopiccomputedtomography-based+virtual+histology+for+visualization+and+morphometry+of+atherosclerosis+in+diabetic+apolipoprotein+e+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice.</a> Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Atherosklerose ist eine komplexe chronische Erkrankung der großen Muskelarterien, die eine der Hauptursachen für Myokardinfarkt und Schlaganfall ist. Das Fortschreiten der Krankheit beinhaltet das Zusammenspiel vieler verschiedener Zelltypen innerhalb der Arterienwand, mit zirkulierenden Blutzellen, Lipoproteinpartikeln und anderen durch Blut übertragenen Faktoren, die wir gerade erst zu verstehen beginnen. Ein Großteil unseres derzeitigen Wissens über die Entstehung und das Fortschreiten der Atherosklerose stammt aus St...

In den letzten zwei Jahrzehnten haben die Entwicklung und Verwendung von Atherosklerose-anfälligen Mausmodellen durch diätetische und/oder genetische Manipulation unser Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen, die an der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen beteiligt sind, erheblich erweitert1-3. Ein großer Teil unseres Wissens und Verständnisses der Atherogenese stammt aus Studien, die an Mäusen durchgeführt wurden, bei denen sich atherosklerotische Läsionen spontan entwickeln und bei denen Lipoproteinrezeptoren (LDLR) mit niedrigem Dichte><><Mangel auftreten>5 Mäuse, bei denen Atherosklerose diätinduziert ist. Ein wichtiger Vorteil dieser Modelle besteht darin, dass sie die Untersuchung einer relativ großen Anzahl genetisch definierter Tiere unter kontrollierten Ernährungs- und Umweltbedingungen ermöglichen. Darüber hinaus scheinen die fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen, die sich bei einigen dieser Mausstämme entwickeln, denen beim Menschen sehr ähnlich zu sein und lipidgefüllte nekrotische Kerne und fibröse Kappen zu enthalten. Atherosklerose entwickelt sich in diesen Mausmodellen schnell, so dass es sehr gut möglich ist, die Entwicklung von Läsionen, vom Fettstreifen bis hin zu fortgeschrittenen Plaques, über wenige Wochen zu untersuchen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass bekannte Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen, darunter Diabetes6, Dyslipidämie7, Fettleibigkeit8, Bluthochdruck9, Zigarettenrauch10 und eine sitzende Umgebung11, die Entwicklung von Läsionen weiter beschleunigen.
In den meisten, wenn nicht sogar allen Atherosklerose-anfälligen Mausmodellen kann die Entwicklung von Läsionen zuerst an der Aortenhöhle nachgewiesen werden. Der Zeitpunkt des Auftretens hängt vom Mausstamm und der Ernährung ab. Wenn die Läsionen an Größe zunehmen, neigen sie dazu, die aufsteigende Aorta hinaufzuwachsen. Bei ApoE-/- und LDLR-/- Mäusen kann die anschließende Läsionsentwicklung an Aortenbifurkationen im Aortenbogen, in der absteigenden Aorta und in anderen größeren Arterien12-14 nachgewiesen werden. Dr. Beverly Paigen und Kollegen haben nicht nur einige der frühesten Modelle der ernährungsinduzierten Atherosklerose entwickelt, sondern auch einen Assay zur Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen an der Aortenhöhle etabliert, der zum Standard für die Läsionsmessung in Mausmodellen geworden ist15. Im Laufe der Jahre wurde diese Technik verfeinert und detailliert beschrieben16. Hier stellen wir eine modifizierte Version der "Paigen-Methode" zur Quantifizierung und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen bei einer Maus vor. Die Analyse von seriellen Aortenquerschnitten aus einer bestimmten Gefäßregion und in einer definierten und festen Ausrichtung ermöglicht eine präzise Datenerfassung und ermöglicht die genaue Erkennung von Variationen in der Läsionsentwicklung in verschiedenen Behandlungsgruppen. Die hier vorgestellten Methoden bauen auf den bisherigen Techniken auf. Konkret beschreiben wir, wie die Charakterisierung von Läsionen in Bezug auf Fläche, Volumen, nekrotischen und zellulären Gehalt durch die Untersuchung von Serienschnitten mit einer Kombination aus Histochemie und Immunhistochemie möglich ist.

<table><tbody><tr><td>LDLR-defiziente Mäuse&nbsp;( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Lager #002207</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Histology Molds Ted</td><td>Pella Inc</td><td>27195</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Paramat</td><td>19286-10</td><td></td></tr><tr><td>Beschichtete Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lösungsmittelbehälter</td><td>Tissue Tek II</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM22S5</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR</td><td>80086-982</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>www.rsbweb.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Prozessor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP6-A1</td><td></td></tr><tr><td>Verarbeitung Kassetten</td><td>VWR</td><td>18000-134</td><td></td></tr><tr><td>Druckgarer</td><td>Nordic Ware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomklinge</td><td>Thermo Scientific</td><td>30-518-35</td><td></td></tr><tr><td>Antifade-Eindeckmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-4680</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Eindeckmaß mittel&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Aquous Eindeckmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1161</td><td></td></tr><tr><td>Mac-3 anbody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553322</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab6640</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Aktin Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-32251</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo; s Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3'-Diaminobenzidin)</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyse und charakterisierung atherosklerotischer läsionen im murinen aortensinus

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosklerose ist eine Erkrankung der großen Arterien und eine der Hauptursachen für Myokardinfarkt und Schlaganfall. Es wurden verschiedene Mausmodelle entwickelt, um die Untersuchung der molekularen und zellulären Pathophysiologie dieser Krankheit zu erleichtern. In diesem Manuskript beschreiben wir spezifische Techniken zur Quantifizierung und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen in der murinen Aortenhöhle und der aufsteigenden Aorta. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es eine genaue Messung der Querschnittsfläche und des Gesamtvolumens der Läsion ermöglicht, die zum Vergleich des atherosklerotischen Verlaufs über verschiedene Behandlungsgruppen hinweg verwendet werden kann. Möglich wird dies durch die Verwendung der Klappensegel als anatomischer Orientierungspunkt, zusammen mit einer sorgfältigen Einstellung des Schnittwinkels. Wir beschreiben auch grundlegende Färbemethoden, mit denen begonnen werden kann, die atherosklerotische Progression zu charakterisieren. Diese können weiter modifiziert werden, um Antigene zu untersuchen, die für den Forscher von besonderem Interesse sind. Die beschriebenen Techniken sind allgemein auf eine Vielzahl bestehender und neu erstellter diätetischer und genetisch induzierter Modelle der Atherogenese anwendbar.

Fünf Wochen alte LDLR-/--Mäuse erhielten zehn Wochen lang eine Standarddiät oder eine fettreiche Diät. Die Mäuse wurden getötet und wie oben beschrieben mit Formalin perfundiert. Querschnitte des Aortensinus wurden angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um die Läsionsfläche und das Läsionsvolumen zu bestimmen (Abbildung 4). Bei Fütterung mit einer Standarddiät ist die atherosklerotische Entwicklung sehr begrenzt und möglicherweise im Alter von 15 Wochen nicht nachweisbar. Eine fettreiche Diät...

Wir beschreiben Verfahren zur Quantifizierung und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen in Mausmodellen durch Präzisionsschnitte der Aortenhöhle und der aufsteigenden Aorta in Kombination mit histochemischer und immunhistochemischer Analyse.

Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, atherosklerotische Läsionen im Aortensinus des Herzens zu charakterisieren und zu quantifizieren. Dazu wird zunächst ein entnommenes Herz präpariert, um den apikalen Bereich zu isolieren und den Aortensinus zu lokalisieren. Anschließend werden Paraffinblöcke mit dem aufgearbeiteten apikalen Herzbereich hergestellt.Dann wird der Aortensinus geschnitten und auf Objektträger aufgebracht. Schließlich werden die Gewebeschnitte gefärbt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die mithilfe histochhemischer und immunhistochemischer Analysen unterschiedliche Größen und Zusammensetzungen atherosklerotischer Läsionen zeigen.Den Versuch wird Daniel Venga penal, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Die Animal Research Ethics Board der McMaster University hat alle hierin beschriebenen Verfahren vorab genehmigt, nachdem ein LDLR-doppelnegatives Mausmodell anästhesiert, das Blut entnommen, das Tier euthanasiert und fixiert wurde. Danach wird das Herz gemäß dem beschriebenen Protokoll isoliert; verwenden Sie ein Skalpell, um einen Querschnitt durch das Herz senkrecht zur aufsteigenden Aorta anzulegen. Legen Sie den apikalen oder oberen Teil des Herzens in ein Einbettungskassette und tauchen Sie ihn in Formin ein.Legen Sie dann die Kassette in einen Gewebeprozessor und bearbeiten Sie sie über Nacht. Schmelzen Sie mithilfe des im Textprotokoll beschriebenen Programms für die Histologieformen Paraffinwachs über Nacht bei 62 Grad Celsius. Geben Sie jedes behandelte Gewebe in eine tiefe Histologieform, wobei die Schnittfläche des Herzens die Basis der Form berühren muss, und füllen Sie die Form anschließend vollständig mit geschmolzenem Paraffinwachs.Verwenden Sie eine beschriftete Kunststoffkassette, um die Form abzudecken. Nach dem Abkühlen der Formen auf Eis oder einer kalten Oberfläche trennen Sie den Block von der Form, um die Aorta zu schneiden. Positionieren Sie den Block im Probenträger des Mikrotoms, sodass er von innen in Richtung Herzspitze geschnitten werden kann.Stellen Sie den Mikrotom auf 10 Mikrometer ein und schneiden Sie das Herz. Sammeln Sie die Schnitte auf einem Objektträger und untersuchen Sie sie unter einem Lichtmikroskop, um Lage und Orientierung zu bestimmen. Der Sinus sollte als drei zweiteilige Ventilbasen mit angehefteten Segeln erscheinen.Wenn ein oder zwei Taschenklappen des Aortensinus sichtbar werden, stellen Sie den Blockwinkel entsprechend ein. Sobald die Klappen erreicht sind, stellen Sie das Mikrotom so ein, dass Schnitte von vier bis fünf Mikrometern Dicke angefertigt werden. Bringen Sie die ersten 10 Schnitte jeweils an der oberen Position einzelner Objektträger an und platzieren Sie anschließend jede weitere Gruppe von 10 Schnitten auf der jeweils nächsten Position.Auf die Objektträger. Setzen Sie das Sammeln von Schnitten fort, bis keine atherosklerotischen Läsionen mehr beobachtet werden. Um die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin zu färben und die Läsionen sichtbar zu machen, legen Sie die Objektträger acht Minuten lang in einen Lufttrockner.Dann die Schnitte durch viermaliges Waschen mit Xylol jeweils drei Minuten lang deparaffinieren. Die Objektträger dreimal jeweils drei Minuten lang mit 100 % Ethanol waschen. Anschließend mit 70 % Ethanol und 50 % Ethanol.Dreimal für jeweils drei Minuten. Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser und tauchen Sie sie dann 15 Minuten lang in MA's Hämatin ein.Waschen und Spülen. Leitungswasser für fünf Minuten. Anschließend waschen und destilliertes Wasser für fünf Minuten nach dem Eintauchen in Eosin Y für ein bis fünf Minuten.Zweimal mit 50 % Ethanol je zwei Minuten lang waschen. Dann dreimal mit 70 % Ethanol je zwei Minuten lang waschen und mit 100 % Ethanol. Außerdem dreimal je fünf Minuten mit destilliertem Wasser waschen.Dreimal je zwei Minuten. Anschließend waschen und viermal je zwei Minuten mit Xylol. Die Schnitte mit einem Xylol-basierten Eindeckmedium eindecken und Bilder unter einem Lichtmikroskop aufnehmen.Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Läsionen zu identifizieren und zu quantifizieren, die in bestimmten Abständen vom Aortensinus in Intervallen von 40 bis 50 Mikrometern bestimmt werden können, abhängig von der Dicke der Schnitte; verweisen Sie auf das Textprotokoll für immunhistochemische und immunfluoreszenzfarbliche Färbungen. Fünf Wochen alte LDLR-positive Mäuse erhielten entweder eine Standarddiät oder eine fettreiche Diät über einen Zeitraum von 10 Wochen, bevor ihre Herzen fixiert, isoliert und wie hier gezeigt geschnitten wurden.Wenn Mäuse mit einer Standard-Nahrung ernährt werden, ist die Entwicklung von Atherosklerose sehr begrenzt und möglicherweise im Alter von 15 Wochen nicht nachweisbar. Eine fettreiche Ernährung beschleunigt in diesem Modell die Atherogenese erheblich und induziert die Bildung großer, fortgeschrittener Läsionen mit nekrotischen, akzellulären Kernen und fibrösen Kappen. Atherosklerotische Läsionen können weiter charakterisiert werden, indem sie auf das Vorhandensein spezifischer Zelltypen und Faktoren gefärbt werden, die die Entwicklungsstadien der Läsionen definieren.Die Infiltration von Monozyten in die Intima stellt eines der frühesten Ereignisse der Atherogenese dar. Die Monozyten differenzieren sich in Makrophagen, die zellulären Abfall und Lipide aufnehmen. Lipidreich gefüllte Makrophagen, sogenannte Schaumzellen, bilden eine fettige Streifenbildung in der Arterienwand, wie hier dargestellt. Man kann Makrophagen-Schaumzellen in allen Stadien der Läsionsentwicklung durch Färbung mit Antikörpern gegen spezifische Makrophagen-Marker wie F vier 80 und MAC drei nachweisen. Vaskuläre glatte Muskelzellen oder v SMCs sind auf die mediale Schicht einer gesunden Arterie beschränkt. Während der Entwicklung einer fortgeschrittenen Läsion werden v SMCs zur Migration und Proliferation in der Intima angeregt.Wie in diesem Panel zu sehen ist, können vaskuläre glatte Muskelzellen (V SMCs) durch Färbung mit einem Antikörper gegen Alpha-Aktin nach ihrer Entwicklung identifiziert werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Erkrankungen den Weg, um die Entwicklung und Progression atherosklerotischer Läsionen bei Nagern zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quantitative Analyse und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen im Aortenbogen der Maus

Die Ex-vivo-Analyse von arteriellen Läsionen aus Tiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen stützt sich klassischerweise auf histologische und immunhistochemische Techniken. Diese ermöglichen 2-dimensionale Messungen in 3-dimensionalen Läsionen. Dieses Manuskript beschreibt die Erzeugung von arteriellen Läsionen für die quantitative Analyse in 3-Dimensionen mittels optischer Projektionstomographie.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

Dieses Video zeigt zwei Modelle der Intima Plaqueentwicklung in murinen Arterien und betont die Unterschiede in myointimale Hyperplasie und Atherosklerose.

Induktion Myointimale Hyperplasie Versus Atherosklerose in Mäuse: Eine Einführung von zwei gültigen Modelle

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode mit einem röntgendichten bleihaltigen Silikon-Kautschuk zu das murine Gefäßsystem zur Quantifizierung der Aorta Durchmesser in einem Mausmodell der Aortenaneurysma und Dissektion durchspülen.

Quantitative Micro-CT-Analyse der Aortopathy in einem Mausmodell der β-Aminopropionitrile-induzierte Aortenaneurysma und Dissektion

Wir beschreiben ein Protokoll zur Atherosklerose in die Aortenwurzel von ApoE- / - Mäusen gefüttert mit einem atherogenen Diät durch eine kontinuierliche Freisetzung von Aldosteron zu induzieren. Methoden zur Charakterisierung von Plaque Zusammensetzung werden ebenfalls beschrieben.

Induktion von atherosklerotischen Plaques durch Aktivierung von Mineralocorticoid-Rezeptoren im Apolipoprotein E-defizienten Mäusen

Wir schlagen ein standardisiertes Protokoll zur Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung der Spätphase murinen atherosklerotische Läsionen einschließlich systematische Methoden der tierischen Dissektion, Gewebe einbetten, schneiden, Färbung und Analyse der Brachiocephalic Arterien Atheroprone glatten Muskulatur Zelle Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse.

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

Murine Modelle der Arteriosklerose sind nützliche Werkzeuge, um pathogene Pfade auf molekularer Ebene zu untersuchen, erfordern aber eine standardisierte Quantifizierung der Läsionsentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Bestimmung der Läsionsgröße in den hauptartiellen Gefäßen, einschließlich der Aortenwurzel, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterie.

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse der atherosklerotischen Belastung bei Mäusen. Ermittler können dieses Protokoll verwenden, um die Häufigkeit, den Ort und die Größe von atherosklerotischen Läsionen bei verschiedenen Tieren zu vergleichen.

Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell

In dieser Arbeit stellen wir optimierte Gewebe-Clearing-Protokolle vor, um die murine Aorta in drei Dimensionen (3D) abzubilden. Wir beschreiben modernste Verfahren zur Immunfärbung, optischen Klärung und Bildgebung mit dem Ziel, die anatomische Nähe des peripheren Nervensystems zu atherosklerotischen Plaques und die Adventitia bei Atherosklerose zu definieren.

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Methodik für die quantitative Analyse von atherosklerotischen Plaques, um eine tiefergehende Erforschung der Mechanismen und des Fortschreitens der Atherosklerose zu ermöglichen.

Isolierung und Analyse von Aortenbogen- und Wurzelläsionen in einem atherosklerotischen Mausmodell

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf...

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Erfahren Sie die quantitative Analyse atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus. Diese Methode nutzt histochemische und immunhistochemische Techniken zur Charakterisierung von Läsionsgröße und -zusammensetzung.

Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus

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