Name: In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Lernen Sie die in-situ-TEM-Bildgebung biologischer Baugruppen in Flüssigkeit mit Nanometerauflösung. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung dynamischer Verhaltensweisen von Rotavirus-Partikeln in Echtzeit.

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Die Autoren würdigen Dr. Michael J. Friedlander, Direktor des Virginia Tech Carilion Research Institute für die Förderung unserer Forschungsbemühungen. Dieses Projekt wurde durch Entwicklungsgelder an S.M.M und D.F.K. und teilweise durch die Nano-Bio-Initiative des Institute for Critical Technology and Applied Science bei Virginia Tech unterstützt.

1. Vorbereiten von Affinity Capture-Geräten16
<ol><li>Reinigen Sie die Siliziumnitrid-E-Chips, indem Sie sie in 15 ml Aceton für 2 min, gefolgt von 15 ml Methanol für 2 min(Abbildung 1A). Lassen Sie Diesunter laminarem Luftstrom trocknen.</li>
	<li>Die getrockneten Späne auf einer erhitzten Rührplatte (ohne Rühren) 1,5 Stunden bei 150 °C inkubieren und vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.</li>
	<li>Verwenden Sie Hamilton-Spritzen, um Lipidmischungen in kleinen Glasröhren zu komponieren, die 25% Chloroform, 55% DLPC (1,2-Dilauroyl-Phosphocholin) in Chloroform (1 mg/ml) und 20% Ni-NTA-Lipid (1,2-Dioleoyl-Iminodiessigsäure-Succinyl-Nickel-Salz) in Chloroform (1 mg/ml) für ein Gesamtvolumen von 40 l enthalten.</li>
	<li>Tragen Sie einen 1 l Aliquot des Gemischs über jeden 15-l-Tropfen Milli-Q-Wasser auf ein Stück Parafilm in einer feuchten Petrischale auf (Abbildung 1B). Proben mindestens 60 min auf Eis inkubieren.</li>
</ol>2. Erfassen von Makromolekülen17
<ol><li>Legen Sie einen E-Chip mit einem 150 nm integrierten Abstandsraum auf eine Monolayer-Probe und inkubieren Sie 1 min(Abbildung 1C).</li>
	<li>Heben Sie den Chip vorsichtig von der Probe ab und fügen Sie ein 3-l-Aliquot von Seinem mit Tags versehenen Protein A hinzu. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur(Abbildung 1D).</li>
	<li>Den überschüssigen Tropfen mit Whatman #1 Filterpapier wegblasen und sofort eine 3-l-Aliquot-Antikörperlösung hinzufügen. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einer Hamilton-Spritze und fügen Sie sofort eine 1 l Aliquot von Rotavirus-DLPs (0,1 mg/ml) in Pufferlösung mit 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 mM CaCl2hinzu. Mindestens 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Vorbereitung von DLPs wurde bereits beschrieben18.
</li>
</ol>3. Montieren Sie die Mikrofluidische Kammer und laden Sie den In-situ-Probenhalter
<ol><li>Laden Sie den nassen E-Chip mit der Virusprobe in die Spitze des mikrofluidischen Probenhalters. Glühen-Entladung eines zweiten flachen E-Chips für 1 min und dann auf den Abstandschip geladen(Abbildung 2, Panels 1-5).</li>
	<li>Alternativ kann der Kontrast biologischer Makromoleküle erhöht werden, schwermetallstain(z.B. 0,2% Uranylformat) zu nassen Proben hinzugefügt werden, bevor der zweite E-Chip auf die nasse Probe gesetzt wird. Der E-Chip, der die Probe enthält, muss jedoch vor zugabe des Kontrastreagenzes mit Milli-Q-Wasser gewaschen werden.</li>
	<li>Die gesamte Baugruppe zu einem versiegelten Gehäuse verschließen, das mechanisch innerhalb des Halters durch 3 Messingschrauben gehalten wird(Abbildung 2,Platten 6-8).</li>
	<li>Nach der Montage wird die Spitze des Halters mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf 10-6 Torr gepumpt, bevor der Halter im TEM platziert wird.</li>
</ol>4. Bildgebung in Flüssigkeit mit einem Transmissionselektronenmikroskop
<ol><li>Laden Sie den In-situ-Probenhalter in ein Transmission Electron Microscope (FEI Company), das mit einem LaB6-Filament ausgestattet ist und mit 120 kV arbeitet.</li>
	<li>Schalten Sie das TEM-Filament ein und passen Sie die euzentrische Höhe der Mikroskopstufe in Bezug auf die Probe an, indem Sie die Wobblerfunktion verwenden, um die Probe in der Säule von -15° bis +15° hin und her zu neigen. Dieses Verfahren passt die Stufe in z-Richtung an, um die richtige Dicke der Flüssigkeitskammer zu berücksichtigen. Dieser Schritt stellt auch sicher, dass eine genaue Vergrößerung bei der Aufnahme von Bildern verwendet wird.</li>
	<li>Zeichnen Sie zuerst Bilder entlang der Ränder und in den Eckbereichen der mikrofluidischen Kammer auf. Diese Bereiche enthalten in der Regel die dünnste Lösung. Zeichnen Sie Bilder von Proben unter niedrig dosierten Bedingungen(1-3 Elektronen/2 ) mit einer CCD-Kamera auf. Verwenden Sie nenne Vergrößerungen von 6.000X - 30.000X.</li>
	<li>Bestimmen Sie den richtigen Defokuswert, indem Sie sich am Rand der Fluidkammer fokussieren. Verwenden Sie einen Wert von -1,5 m, um Bilder mit einer Vergrößerung von 30.000 X aufzuzeichnen. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird oder wenn in der Probenvorbereitung kein Kontrastmittel verwendet wird, verwenden Sie höhere Defokuswerte im Bereich von -2 bis -4 m.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass die Lösung während der Experimente in der mikrofluidischen Kammer enthalten ist, fokussieren Sie den Elektronenstrahl, bis sich die Blasen in der Flüssigkeit innerhalb des Geräts bilden.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

Die Autorin, Madeline J. Dukes, ist Mitarbeiterin von Protochips, Inc.

In unserer vorgestellten Arbeit haben wir den Affinitätserfassungsansatz verwendet, um dlPs mit Rotavirus auf eine mikrofluidische Plattform zu bringen. Dies ermöglichte die In-situ-Bildgebung makromolekularer Komplexe in einer flüssigen Mikroumgebung. Der Erfassungsansatz ist im Vergleich zu anderen mikrofluidischen Bildgebungsverfahren von Bedeutung, da er biologische Proben in das Bildgebungsfenster lokalisiert, um große diffusive Probleme zu negieren, die bei der Aufnahme von Bildern in Flüss...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Ein gemeinsames Ziel von Biologen und Ingenieuren ist es, das Innenleben molekularer Maschinen zu verstehen. Transmission Electron Microscopes (TEMs) sind ideale Instrumente, um diese komplizierten Details mit nahezu atomarer Auflösung1-2zu visualisieren. Um das Hochvakuumsystem eines TEM aufrecht zu erhalten, sind biologische Proben typischerweise in dünne Folien aus Glaseis3, Zucker4, Schwermetallsalze5oder eine Kombination davon6eingebettet. Daher können Bilder eingebetteter Proben nur begrenzte Momentaufnahmen dynamischer Prozesse zeigen.
Erste Versuche, biologische Proben in Flüssigkammern der Umwelt hydratisiert zu halten, wurden von Parsons und Kollegen mit Differentialpumpstufen unternommen. Elektronenbeugungsmuster von ungefärbten Kataalasekristallen wurden erfolgreich mit einer Auflösung von 3 ° in einem hydratisierten Zustand7-8aufgezeichnet. Darüber hinaus könnten phasengetrennte Lipiddomänen in hydratisierten Membranen menschlicher Erythrozyten9-10untersucht werden. Bewegungsstörungen durch das Ausstreuen von Flüssigkeit und deren Interferenz mit dem Elektronenstrahl führten jedoch zu einem starken Auflösungsverlust, und weitere Experimente mit biologischen Proben wurden erst vor kurzem versucht.
Neu entwickelte mikrofluidische Probenhalter wurden eingeführt, die Halbleiter-Mikrochips verwenden, um eine mikroskalierte Umweltkammer zu bilden. Diese Geräte können Proben in Flüssigkeit halten, während sie in einerTEM-Säule 11-12positioniert sind. Dieser technische Durchbruch in der TEM-Bildgebung hat es Forschern ermöglicht, zum ersten Mal progressive Ereignisse auf molekularer Ebene13zu sehen. Wir bezeichnen diese neue Modalität als"in situ molekulare Mikroskopie", da Experimente nun "innerhalb" derEM-Säule 14-15durchgeführt werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, biologische Baugruppen in Flüssigkeit abzubilden, um ihr dynamisches Verhalten bei Nanometerauflösung zu beobachten. Der Grund gedanke hinter der entwickelten Technik ist es, Echtzeitbeobachtungen aufzuzeichnen und neue Eigenschaften biologischer Maschinen in Lösung zu untersuchen. Diese Methode erweitert die Verwendung von TEMs für breitere Zwecke in der Zell- und Molekularbiologie12-16.
Im aktuellen Videoartikel stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Montage und Verwendung eines handelsüblichen mikrofluidischen Probenhalters vor. Diese spezialisierten Halter verwenden Siliziumnitrid-Mikrochips, die mit integrierten Abstandshaltern hergestellt werden, um eine flüssige Kammer zu bilden, die winzige Lösungsvolumina umschließt. Dünne, transparente Fenster werden zu Bildgebungszwecken in die Mikrochips eingeätzt12. Wir zeigen die ordnungsgemäße Verwendung eines mikrofluidischen Halters zur Untersuchung von simianrotavirus double-layered particles (DLPs) in Flüssigkeit mit einem TEM. Um sicherzustellen, dass biologische Baugruppen, wie z. B. DLPs, während der Bildgebung nicht schnell über große Entfernungen diffundieren, verwenden wir den Affinity Capture-Ansatz, um sie an die Oberfläche der mikrofluidischen Kammer16zu fesseln. Dieser molekulare Erfassungsschritt hat einen großen Vorteil gegenüber alternativen Verfahren zur Abbildung biologischer Proben in Flüssigkeit, da er die Erfassung von Bildern ermöglicht, die für nachgelagerte Verarbeitungsroutinen verwendet werden. Dieser Erfassungsschritt in Verbindung mit mikrofluidischer Bildgebung ist einzigartig in unseren Verfahren17. Leser, die strukturbiologische Anwendungen mit TEM oder mikrofluidischen Bildgebungskammern verwenden, können den Einsatz von Affinitätserfassungstechniken in Betracht ziehen, wenn dynamische Beobachtungen auf molekularer Ebene das Endziel sind.

<table><tbody><tr><td>E-Chips, Spacer-Chip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m Fenster</td></tr><tr><td>E-Chip, Top-Chip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 mm m x 50 &mu; m window</td></tr><tr><td>Ni-NTA Lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>Pulver Form</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) Lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>Pulver Form</td></tr><tr><td>Messkolben&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton Spritzen</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu; l; 1-25 &mu; l</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 Stück, 90 mm</td></tr><tr><td>Petrischalen aus Glas</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten aus Glas</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Kulturröhrchen aus Glas</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>His-getaggtes Protein A</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q Wassersystem</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Reinstwasser</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ausrüstung&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon In situ Probenhalter</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; FEI kompatibel</td></tr><tr><td>FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS CCD-Kamera</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp; &Aring;/Pixel-Probenahme bei 30.000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Trockenpumpstation</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Pumpenhalterspitze auf 10-6&nbsp; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, Glimmentladungseinheit</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Negativer Polaritätsmodus</td></tr><tr><td>Isotemp beheizte Rührplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat auf 150 &ordm; C für 1,5 Std</td></tr></tbody></table>.

in situ tem der biologischen baugruppen in flüssig

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Die Forscher verwenden regelmäßig Transmission Electron Microscopes (TEMs), um biologische Einheiten zu untersuchen und neue Materialien zu bewerten. Hier beschreiben wir eine zusätzliche Anwendung für diese Instrumente - die Anzeige viraler Baugruppen in einer flüssigen Umgebung. Diese spannende und neuartige Methode zur Visualisierung biologischer Strukturen nutzt einen kürzlich entwickelten mikrofluidischen Probenhalter. Unser Videoartikel zeigt, wie man einen mikrofluidischen Halter zusammenbaut und verwendet, um flüssige Proben innerhalb eines TEM abzubilden. Insbesondere verwenden wir simian Rotavirus Doppelschichtpartikel (DLPs) als Modellsystem. Wir beschreiben auch Schritte, um die Oberfläche der Flüssigkeitskammer mit Affinitätsbiofilmen zu beschichten, die DLPs an das Sichtfenster ankleben. Dies ermöglicht es uns, Baugruppen so abzubilden, dass sie für die 3D-Strukturbestimmung geeignet sind. So präsentieren wir einen ersten Einblick in subvirale Partikel in einer nativen flüssigen Umgebung.

Repräsentative Bilder von DLPs in Flüssigkeit mit E-Chips, die glühend entladen wurden (Abbildung 3A) zeigen weniger DLPs in einem bestimmten Betrachtungsbereich, vermutlich aufgrund der Diffusion, im Vergleich zu DLPs, die auf Affinity Capture-Geräten angereichert sind (Abbildung 3B). Die Zugabe von Uranylformat in der Bildkammer erhöht den Kontrast der Probe und damit die Sichtbarkeit einzelner DLPs in Lösung(Abbildung 3C, oberes Panel). Ein besserer Kontrast ermöglich...

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Abbildung viraler Komplexe in Flüssigkeit in Nanometerauflösung mit einem Transmissionselektronenmikroskop.

In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biologische Assemblierungen und Flüssigkeiten abzubilden, um ihr dynamisches Verhalten mit Nanometerauflösung zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Siliziumnitrid-Mikrochips mit einer Affinitätsbindungsfläche präpariert werden, um Makromoleküle an der Oberfläche des Mikrochips zu verankern und so eine Diffusion in der Flüssigkeit zu verhindern. Der zweite Schritt besteht darin, biologische Proben auf den Mikrochip aufzubringen, um Rotavirus-Partikel anzureichern.Anschließend wird der Mikrochip, der die Viruspartikel enthält, mit einem Kontrastmittel gespült und danach in den mikrofluidischen Probenhalter eingelegt. Der letzte Schritt besteht darin, den oberen Chip und die Stirnplatte einzusetzen, um einen geschlossenen Behälter zu bilden, der die flüssige Probe einschließt. Abschließend werden im TEM Bilder aufgenommen, um die Merkmale der Virusprobe innerhalb der flüssigen Mikrokammer sichtbar zu machen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Untersuchung von Objekten in Flüssigkeiten liegt darin, dass unsere Proben während der Bildgebung aufgrund der auf die Mikrochips aufgebrachten Affinitäts-Capture-Beschichtung nicht rasch über große Entfernungen diffundieren. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zu Echtzeitanalysen von nanobasierten Arzneimittelabgabesystemen oder der Impfstoffentwicklung gegen virale Krankheitserreger, da wir erstmals beobachten können, wie sich dynamische Nanomaschinen in Lösung verändern. Obwohl diese Methode Einblicke in die Visualisierung biologischer Makromoleküle ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme wie elektrochemische Anwendungen angewandt werden.Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Herstellung von Affinitätsfangvorrichtungen und das Beladen des mikrofluidischen Probenhalters für unerfahrene Anwender problematisch sein können. Zum Beginn reinigen Sie die Siliziumnitrid-e-Chips, indem Sie sie zwei Minuten lang in 15 Milliliter Aceton und anschließend zwei Minuten lang in 15 Milliliter Methanol inkubieren.Um den im Herstellungsprozess verbliebenen Fotolack zu entfernen, lassen Sie die Chips unter laminarer Luftströmung schnell trocknen. Nach dem Trocknen inkubieren Sie die Chips 1,5 Stunden lang auf einer auf 150 Grad Celsius erhitzten Platte. Anschließend lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.Als Nächstes verwenden Sie Hamilton-Spritzen, um in einem kleinen Glasröhrchen ein Lipidgemisch herzustellen. Geben Sie zunächst 25 % Chloroform hinzu, anschließend 55 % DLPC in Chloroform mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Schließlich fügen Sie mit einer separaten Spritze 20 % Nickel-NTA-Lipid in Chloroform mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu, sodass sich ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern ergibt.Schneiden Sie dann ein Stück Param so zurecht, dass es in eine 100 mal 15 Millimeter große Glas-Petri-Schale passt, und geben Sie neun Tropfen à 15 Mikroliter Milli-Q-Wasser auf die Oberfläche des Params. Geben Sie je einen Ein-Mikroliter-Aliquot der Lipidmischung auf jeden 15-Mikroliter-Tropfen Milli-Q-Wasser und stellen Sie die Schale für mindestens 60 Minuten auf Eis in einer feuchten Umgebung ab, während sich auf der Oberfläche der Tropfen eine Lipid-Monoschicht bildet. Setzen Sie einen EIP mit einem integrierten 150-Nanometer-Abstandshalter auf den Monoschicht-Tropfen und inkubieren Sie beides gemeinsam für eine Minute.Heben Sie als Nächstes den Chip vorsichtig von der Tropfenoberfläche ab und geben Sie drei Mikroliter hist-markiertes Protein A mit einer Konzentration von 0,01 Milligramm pro Milliliter direkt auf die Oberfläche des Chips. Inkubieren Sie den Chip und das Protein A für eine Minute bei Raumtemperatur. Danach entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch Vorsichtiges Abtupfen mit Watman Nr. 1 Filterpapier und geben sofort drei Mikroliter IgG-Antikörperlösung mit einer Konzentration von 0,01 Milligramm pro Milliliter hinzu.Inkubieren Sie die Probe eine Minute lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend die überschüssige Lösung mit einer Hamilton-Spritze und geben Sie sofort ein Ein-Mikroliter-Aliquot von Rotavirus, doppelschichtigen Partikeln mit einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter in einer HEPES-Pufferlösung, hinzu. Inkubieren Sie den Chip danach mindestens zwei Minuten bei Raumtemperatur. Ein zweiter flacher IP wird durch eine Glutentladung für eine Minute vorbereitet; montieren Sie die mikrofluidische Kammer unter Verwendung eines ST.Stereoskops, indem Sie zuerst die Spitze der Probenkammer mit O-Ringen bestücken.Dann die feuchte E-IP, die die Virusprobe enthält, in die Spitze des mikrofluidischen Probenträgers einfüllen. Anschließend die glühentladene flache E-IP auf die Probe legen und die gesamte Anordnung zusammenfügen, um einen dichten Abschluss zu bilden, der mechanisch durch drei Messingschrauben im Träger fixiert wird. Nach der Montage die Spitze des Trägers auf 10⁻⁶ Torr evakuieren.Unter Verwendung einer Turbopumpen-Trockenpumpstation vor dem Einsetzen des Halters in das TEM, laden Sie den I-zwei-Probenhalter in ein Transmissionselektronenmikroskop, das mit einer Lab-sechs-Filamentröhre ausgestattet ist und bei 120 Kilovolt arbeitet. Schalten Sie danach das TEM-Filament ein und justieren Sie die zentrische Höhe des Mikroskopstages in Bezug auf die Probe mithilfe der Wobbler-Funktion, indem Sie die Probe um ±15 Grad hin und her kippen. Nehmen Sie im Säulenzustand Aufnahmen mit 6.000- bis 30.000-facher Vergrößerung entlang der Kanten und in den Eckbereichen der mikrofluidischen Kammer auf.Erstes Bild mit einer CCD-Kamera unter niedrigen Dosisbedingungen von ein bis drei Elektronen pro Quadratångström. Bestimmen Sie den geeigneten Defokuswert, indem Sie am Rand der fluidischen Kammer fokussieren. Verwenden Sie im Allgemeinen einen Defokuswert von minus 1,5 Mikrometern, um Bilder bei 30.000-facher Vergrößerung aufzunehmen, um sicherzustellen, dass die Lösung in der mikrofluidischen Kammer enthalten ist.Während der gesamten Experimente fokussieren Sie den Elektronenstrahl, bis Blasen in der Flüssigkeit innerhalb der Vorrichtung entstehen. Das hier gezeigte Bild wurde nach zwei Minuten bei fünf Elektronen pro Ångström Quadrat aufgenommen. Nach fünf Minuten bildeten sich noch mehr Blasen, es kam zu einer Glimmentladung und die Mikrochips verbanden sich.Sehr wenige doppelschichtige Partikel in Lösung, vermutlich aufgrund von Diffusion. Im Vergleich dazu sind die doppelschichtigen Partikel auf affinitätsbeschichteten Mikrochips angereichert; hier gezeigte Bilder stellen repräsentative Aufnahmen und eine 3D-Rekonstruktion doppelschichtiger Partikel in einer Flüssigkeit dar, die ein Kontrastmittel enthält. Der Durchmesser der Rekonstruktion beträgt 80 Nanometer.Die Klassendurchschnitte der doppelschichtigen Partikel und der Flüssigkeit zeigten deutlich definierte Merkmale entlang ihrer äußeren Oberfläche. Einzelne Felder betragen 110 Nanometer. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den E IPS in der Spitze des Probenträgers zu zentrieren und den Träger vor dem Einsetzen in das Elektronenmikroskop mit PrepU vorzubereiten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Beurteilung der transkriptionellen Aktivität angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise inwieweit die Elektronenstrahlung die funktionelle Kapazität der viralen Komplexe beeinträchtigt hat. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Affinitätsfangvorrichtungen hergestellt, mit molekularen Adaptern funktionalisiert, Virusproben in den mikrofluidischen TEM-Halter geladen und die Proben mithilfe von cche-Mikroskopieverfahren abgebildet werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Pathogenen äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille stets beachtet werden sollten, wenn mit Pathogenen der Sicherheitsstufe BSL zwei gearbeitet wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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