Name: Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung von AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung mechanischer Eigenschaften und Faltungszustände von Cellulosom-Proteinen. Diese Methode liefert kinetische und energetische Informationen über Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

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Die Autoren danken Hermann Gaub für die Finanzierung durch ein Advanced Grant des Europäischen Forschungsrats. Michael A. Nash bedankt sich dankbar für die Finanzierung durch das Branco Weiss Fellowship-Programm von Society in Science. Die Autoren danken Edward A. Bayer, Yoav Barak und Daniel B. Fried vom Weizmann Institute of Science für die großzügige Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Proteine. Die Autoren danken Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner und Stefan W. Stahl für die hilfreichen Gespräche.

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<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um aussagekräftige Daten aus Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Experimenten zu erhalten, ist es entscheidend, gut definierte und reproduzierbare Zuggeometrien zu erreichen. Das hier verwendete Protokoll führt zu einer ortsspezifischen Immobilisierung von Proteinkomplexen in einer definierten Zuggeometrie.
Die in dieser Studie verwendeten Ausleger wurden aufgrund ihrer Kraftempfindlichkeit und hohen Resonanzfrequenz im Wasser ausgewählt. Darüber hinaus ist die kleine Spitzenkrümmung von ca. 10 n...

Cellulosomen sind große Multienzymkomplexe, die auf der Oberfläche von anaeroben zellulolytischen Bakterien (z.B. C. thermocellum) dargestellt werden und sich entwickelt haben, um pflanzliche Zellwandlignocellulose effizient in lösliche Oligosaccharide zu depolymerisieren1. Ein zentrales Merkmal von Cellulosomen ist die hochaffine Kohäsin-Dockerin-Wechselwirkung. Im prominentesten Paradigma ist ein hochkonserviertes 60-75 Aminosäuren Typ I Dockerin-Modul am C-terminalen Ende der verschiedenen bakteriellen Enzyme dargestellt. Das Dockerin-Modul steuert die Assemblierung synergistischer Kombinationen von Enzymen auf das nichtkatalytische Gerüstprotein ("Scaffoldin"), das ein Polyprotein von Cohesin-Domänen umfasst, die spezifisch für das Typ-I-Dockerin-Modul sind. Auf höheren Ebenen kann die Zellulosomenarchitektur sehr komplex werden, da sie alternative Kohäsin- und Dockerinpaare (z. B. Typ II, Typ III) enthält, die die Strukturen an der Zelloberfläche verankern und den Zusammenbau von verzweigten Strukturen mit mehreren Gerüsten ermöglichen2. Die verschiedenen Cohesin-Dockerin-Typen weisen trotz verwandter Strukturen unterschiedliche Bindungsspezifitäten auf, die die Kreuzreaktivität mit unbeabsichtigten Gerüsten oder Komponenten anderer Cellulosom-produzierender Bakterienarten unterdrücken. Während bioinformatische Ansätze erfolgreich Tausende von einzigartigen zellulosomalen Komponenten auf genetischer Ebene identifiziert haben, sind vergleichsweise wenige Proteinstrukturen bekannt, und die Mechanismen, die bei der Bestimmung der Cohesin-Dockerin-Spezifität am Werk sind, bleiben ein aktives Gebiet der strukturbiologischen Forschung.
Seit der Erfindung des Rasterkraftmikroskops (AFM) durch Binnig et al.3 wurden verschiedene AFM-Betriebsmodi entwickelt und kontinuierlich verbessert, darunter die berührungslose Bildgebung, die Oszillationsmodus-Bildgebung4 und die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS)5,6. SMFS hat sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, um einzelne Proteine7-11, Nukleinsäuren12-15 und synthetische Polymere16-19 direkt zu untersuchen. In einem typischen SMFS-Experiment zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Bindung20,21 wird eine AFM-Cantileverspitze mit einem der Bindungspartner modifiziert, während eine flache Glasoberfläche mit dem komplementären Bindungspartner modifiziert wird. Der modifizierte Ausleger wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass sich die Partner binden können. Anschließend wird die Basis des Auslegers mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen und die Kraft mit dem optischen Hebelauslenkungsverfahren gemessen. Die resultierenden Kraft-Weg-Datenspuren weisen sägezahnartige Spitzen auf, wenn eine Bindung hergestellt wurde. In Fällen, in denen die Bindungspartner mit mehreren Proteindomänen fusioniert sind, kann jeder Peak in der Kraft-Weg-Kurve mit der Entfaltung einer einzelnen Proteindomäne oder gefalteten Subdomäne korreliert werden, während der letzte Peak einem Bruch der Proteinbindungsgrenzfläche entspricht. Die spezifischen Positionen der kraftresistenten Elemente können als Fingerabdruck verwendet werden, um die verschiedenen Proteindomänen zu identifizieren, die von Interesse sind. Mit dieser Methode können wichtige Aminosäuren abgefragt werden, die an der Proteinfaltung und -stabilisierung beteiligt sind. In der Literatur wurden viele Modelle beschrieben, um das charakteristische Kraftausdehnungsverhalten zu behandeln, das in SMFS-Experimenten beobachtet wurde. Zu den am häufigsten verwendeten Modellen gehören die freigelenkige Kette (FJC) Modell22, die schneckenartige Kette (WLC) Modell18,23-25 und die frei rotierende Kette (FRC) Modell25,26.
In unserer vorherigen Arbeit11 haben wir Einzelmolekül-Kraftspektroskopie verwendet, um die Wechselwirkung von Cohesin- und Dockerin-Modulen zu untersuchen. In dieser Arbeit stellen wir ein experimentelles Protokoll für die Funktionalisierung von Glasoberflächen und Cantilevern mit Enzym-Dockerin- und CBM-Cohesin-Proteinkonstrukten vor. Außerdem stellen wir ein AFM-basiertes SMFS-Protokoll vor, das Datenerfassungs- und Analyseverfahren umfasst. Das beschriebene Protokoll kann leicht auf andere molekulare Systeme verallgemeinert werden und sollte sich als besonders nützlich für Forscher erweisen, die an hochaffinen Rezeptorligandenpaaren interessiert sind.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyldimethylethoxysilan</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimid</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Disulfid Reduktionsgel</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever Mini-Siliziumnitrid-Ausleger</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Weiche Chargen</td></tr><tr><td>XYZ Piezoelektrische Aktuatoren</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarot " breites Spektrum" IR-Laser</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Datenerfassung und -analyse</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumborat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm Durchmesser, 0,5 mm Dicke</td></tr><tr><td>PTFE-Probenhalter</td><td></td><td></td><td>nach Maß</td></tr><tr><td>Sonicator-Bad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (konzentriert)</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td>geeignet für Mikroröhrchen</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung von rezeptor-liganden-systemen des cellulosom mit afm-basierter einzelmolekül-kraftspektroskopie

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomen sind diskrete Multienzymkomplexe, die von einer Untergruppe anaerober Bakterien und Pilze zur Verdauung lignozellulosehaltiger Substrate verwendet werden. Die Assemblierung der Enzyme an das nichtkatalytische Gerüstprotein wird durch Wechselwirkungen zwischen einer Familie verwandter Rezeptor-Liganden-Paare gesteuert, die interagierende Cohesin- und Dockerin-Module umfassen. Die extrem starke Bindung zwischen Kohäsin- und Dockerin-Modulen führt zu Dissoziationskonstanten im niedrigen pikomolaren bis nanomolaren Bereich, was genaue Off-Rate-Messungen mit herkömmlichen Bulk-Methoden erschweren kann. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) mit dem Rasterkraftmikroskop misst die Reaktion einzelner Biomoleküle auf Kraft und ist im Gegensatz zu anderen Einzelmolekül-Manipulationsmethoden (z. B. optische Pinzette) optimal für die Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit hoher Affinität, da sie den hohen Kraftbereich (>120 pN) untersuchen kann. Hier stellen wir unser vollständiges Protokoll zur Untersuchung zellulosomaler Proteinanordnungen auf Einzelmolekülebene vor. Unter Verwendung einer Proteintopologie, die vom nativen Cellulosom abgeleitet ist, arbeiteten wir mit Enzym-Dockerin- und Kohlenhydrat-Bindungsmodul-Cohesin (CBM-Cohesin)-Fusionsproteinen, die jeweils eine zugängliche freie Thiolgruppe an einem manipulierten Cysteinrest aufwiesen. Wir stellen unser ortsspezifisches Oberflächenimmobilisierungsprotokoll vor, zusammen mit unserem Mess- und Datenanalyseverfahren zur Ermittlung detaillierter Bindungsparameter für den hochaffinen Komplex. Wir zeigen, wie man die Entfaltungskräfte einzelner Subdomänen, komplexe Bruchkräfte, kinetische Off-Raten und potenzielle Breiten der Bindungsvertiefung quantifizieren kann. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methoden bei der Charakterisierung der Cohesin-Dockerin-Wechselwirkung, die für die Assemblierung von zellulolytischen Komplexen mit mehreren Domänen verantwortlich ist, wird weiter beschrieben.

Wir verwendeten das beschriebene Verfahren, um ein Typ-I-Cohesin-Dockerin-Paar aus C. thermocellum zu untersuchen. Nach erfolgreichem Binden des Cohesin-Dockerin-Paares zeigten die aufgezeichneten Kraft-Abstands-Kurven charakteristische Peak-Muster. Eine typische Kurve ist in Abbildung 4a dargestellt. Jeder Peak in der Kurve repräsentiert das Entfalten einer Proteinsubdomäne, wobei der letzte Peak der Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes entspricht.
Für den in d...

Cellulosomen sind Multienzymkomplexe, die für die Verdauung von Zellulose entwickelt wurden. AFM-basiertes SMFS wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften und die Faltungskonfiguration von Cellulosom-assoziierten Proteinanordnungen zu untersuchen. Wir präsentieren einen vollständigen Workflow für die Immobilisierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Proteinen, um die Wechselwirkungen einzelner Rezeptor-Liganden-Komplexe zu untersuchen, die an der Assemblierung von Cellulosomen beteiligt sind.

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die mechanischen Eigenschaften und Faltzustände von Fusionsprotein-Bindungspartnern mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie auf Basis einer Kraftmikroskopie (FM) zu untersuchen. Dazu werden die Protein-Bindungspartner kovalent auf einem Objektträger und auf einem FM-Kanalhebel immobilisiert, um als zweiter Schritt eine gut definierte Zuggeometrie zu erreichen. Die Glasoberfläche wird mit dem Kanalhebel eingedrückt, wodurch die Bindung von Rezeptor und Ligand ermöglicht wird. Anschließend wird der Cantilever mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen, um einzelne Proteindomänen zu entfalten und die Ergebnisse des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu erfassen; dabei erhält man Aufschluss über tertiäre Strukturelemente, die entlang des Entfaltungsprozesses als energetische Barrieren wirken und in Modellen der Polymerelastizität sichtbar werden. Weitere kinetische und energetische Informationen über die Bindungspartner können durch Anpassung kinetischer Modelle an das dynamische Kraftspektrum gewonnen werden. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entfaltungswege von Proteinen unter mechanischer Kraft zu untersuchen.Diese Methode kann Einblicke in die mechanische Stabilität von Proteinen liefern. Sie ist auf jedes Protein-Rezeptor-Ligand-System anwendbar, das so modifiziert werden kann, dass eine zugängliche Gruppe vorliegt. Forscher, die diese Methode erstmals anwenden, haben häufig Schwierigkeiten, da der Zeitpunkt entscheidend ist und die Handhabung der Cantilever kompliziert sein kann.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biophysik zu beantworten, beispielsweise wie ein mehrdomänenhaltiges Protein entfaltet wird. Zunächst werden zwei Deckgläser mit einem Durchmesser von 24 Millimetern und einer Dicke von 0,5 Millimetern in einen A-P-T-F-E-Halter gegeben und anschließend 15 Minuten lang in einer 50:50-Mischung aus Ethanol und ultrareinem Wasser ultraschallbehandelt.Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, spülen Sie die Deckgläser mit ultrareinem Wasser ab und ätzen Sie sie 30 Minuten lang in einer Piranha-Lösung. Nach 30 Minuten entfernen Sie die Deckgläser, spülen sie mit ultrareinem Wasser und trocknen sie unter einem schwachen Strom von Stickstoff. Tauchen Sie die Deckgläser anschließend in ein 45:5:1-Gemisch aus Ethanol, ultrareinem Wasser und 3-Aminopropyl-dimethyl-ahoy.Stellen Sie die untergetauchten Proben 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Schüttler mit etwa 50 Umdrehungen pro Minute. Tauchen Sie dann den Deckel nacheinander jeweils zweimal in 100 % Ethanol und danach zweimal in ultrareines Wasser. Trocknen Sie die Deckgläser erneut unter einem sanften Strom von Stickstoff.Nach dem Trocknen die Deckgläser 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius im Ofen backen. Die unbenutzten Deckgläser bis zu sechs Wochen unter Argon aufbewahren, um die Aminierung von Silizium-Cantilever-Spitzen durchzuführen. Zunächst vier Silizium-Cantilever auf einen sauberen Objektträger geben und 15 Minuten lang einer UV-Ozon-Behandlung unterziehen.Anschließend tauchen Sie die Cantilever für drei Minuten in eine 50:50-Lösung aus Ethanol und drei Amino-Propyl-Dimethyl-Oxys-Ilene zusammen mit 0,25 % ultrareinem Wasser ein. Spülen Sie die Cantilever danach nacheinander jeweils 60 Sekunden lang in Bechern mit Toluol, Ethanol und ultrareinem Wasser aus. Trocknen Sie die Cantilever nach dem letzten Spülschritt vorsichtig auf Filterpapier zwischen den Spülgängen ab.Platzieren Sie die Cantilever auf einem sauberen Objektträger und backen Sie sie 30 Minuten bei 80 Grad Celsius. Bereiten Sie zwei TEP-Dithiothreitol-vermindernde Beads vor, indem Sie zunächst die Spitze einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abschneiden, um deren Durchmesser zu vergrößern, und anschließend 100 Mikroliter der Stammlösung der Beads in jedes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen pipettieren. Geben Sie danach ein Milliliter TBS zur TEP-Bead-Suspension in den OTTs hinzu und waschen Sie die Beads durch kurzes Vortexen des Mikroröhrchens.Sedimentieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation der Proben bei 850 Gs für drei Minuten. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette und waschen Sie die Kügelchen anschließend zweimal mit je einem Milliliter TBS. Zentrifugieren Sie jeweils zwischen den Waschschritten. Nach dem letzten Waschschritt geben Sie eine konzentrierte Proteingabe mit drei Milligramm pro Milliliter in einem Verhältnis von eins zu zwei zu den TEP-Kügelchen hinzu und mischen die Suspension vorsichtig durch Rühren mit einer Mikropipettenspitze, um die Bildung von Luftsblasen zu vermeiden.Anschießend die Protein-TEP-Perlen-Suspensionsmischung 2,5 Stunden lang auf einem Rotator platzieren. Amino-Augen-Cantilever und Deckgläser 45 Minuten lang in Natriumboratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5 einweichen, um die primären Aminogruppen auf der Oberfläche zu deprotonieren. Danach N-H-S-P-E-G-Malam-Pulver auf Raumtemperatur erwärmen und 210 Mikroliter davon bei 25 Mikromolar durch Vortexen in Natriumboratpuffer herstellen.Die Lösung sollte aufgrund der äußerst kurzen Halbwertszeit von NHS so schnell wie möglich verwendet werden. Bei pH 8,5 werden 30 Mikroliter-Tropfen der N-H-S-P-E-G-Malam-Lösung schnell auf eine Petrischale und 90 Mikroliter auf jede andere Glasdeckenschiebe gegeben. Die Cantilever werden vorsichtig in die 30-Mikroliter-Tropfen platziert.Dann drehen Sie die Deckglasseite ohne Tropfen auf eine mit N-H-S-P-E-G-MALAM-Lösung, um ein Sandwich mit der N-H-S-P-E-G-MALAM-Lösung zu bilden. Inkubieren Sie in der Mitte die Cantilever und Deckgläser mit der N-H-S-P-E-G-MALAM-Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die TEP-Perle und die reduzierte Proteinlösung eine Minute lang bei 100 ×g und sammeln Sie das Überstand. Als Nächstes verdünnen Sie die Proteiniösung mit TBS. Streben Sie eine Protein-Konzentration während der Oberflächenkonjugation im Bereich von 0,5 bis zwei Milligramm pro Milliliter an. Stellen Sie die reduzierten und verdünnten Proteinlösungen anschließend einige Minuten lang beiseite, während Sie die Cantilever und Deckgläser spülen.Spülen Sie die Deckgläser nacheinander in drei Bechern mit ultrareinem Wasser. Entfernen Sie die restliche Flüssigkeit von den Deckgläsern, indem Sie vorsichtig die Ränder an Filterpapier anfassen. Danach montieren Sie die Deckgläser in einer geeigneten Probenhalterung, die mit dem AFM-Gerät kompatibel ist, und trocknen Sie die restliche Flüssigkeit unter einem schwachen Strom von Stickstoff. Tragen Sie 20 Mikroliter der verdünnten Proteiniösung als Tropfen in die Mitte der Deckgläser auf. Spülen Sie anschließend die Cantilever nacheinander in drei Bechern mit ultrareinem Wasser, gefolgt von 30-Mikroliter-Tropfen der zweiten verdünnten Proteiniösung. Inkubieren Sie die pegylierten Deckgläser und Cantilever mit den jeweiligen verdünnten Proteiniösungen bei Raumtemperatur eine bis zwei Stunden in einer Feuchtigkeitskammer.Als Nächstes spülen Sie die Deckgläser mit einer Pipette mindestens zehnmal mit je einem Milliliter TBS und lagern Sie anschließend in TBS bis zur Messung. Spülen Sie die Cantilever ebenfalls durch drei aufeinanderfolgende Becher mit TBS, um nicht gebundene Proteine zu entfernen, und lagern Sie sie ebenfalls in TBS. Befestigen Sie die funktionalisierten Cantilever und Glasscheiben in einem AFM-Modell, das für Messungen in Flüssigkeiten geeignet ist und einen zugänglichen Geschwindigkeitsbereich am Z-Piezo von etwa 200 bis 5.000 Nanometer pro Sekunde unterstützt.Beim Montieren kann die Exposition gegenüber Luft minimiert werden, indem sichergestellt wird, dass die Oberflächen während des gesamten Prozesses nach korrekter Einstellung des Laserstrahls mit Puffer bedeckt bleiben. Lassen Sie das System mindestens 30 Minuten lang equilibrieren, um Drift-Effekte zu verringern, und nehmen Sie gegebenenfalls erneut eine Justierung vor. Beginnen Sie dann mit den Messungen nach erfolgreichem Binden der Kohäsion.Docker in Paar die hier gezeigten aufgezeichneten Kraft-Abstand-Spuren. Zeigen ein charakteristisches Peak-Muster. Jeder Peak in der Spur repräsentiert die Entfaltung einer Protein-Subdomäne, wobei der letzte Peak der Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes entspricht.Die aufgezeichneten Kraft-Abstand-Kurven wurden anschließend in den Kraft-Konturlängen-Raum überführt und in einem Histogramm der Barrierenpositionen zusammengefasst. Die Daten zeigen einen Anstieg der Konturlänge von etwa 89 Nanometern, der eindeutig der Entfaltung der Xin-Domäne zugeordnet werden kann, um die Energielandschaft der kohäsiven Docker-Wechselwirkung zu untersuchen. Insgesamt wurden 186 Datenspuren bei vier verschiedenen Sammelgeschwindigkeiten erhalten.Das resultierende dynamische Kraftspektrum, dargestellt als große blaue Kreise, repräsentiert die wahrscheinlichsten Risskräfte bei einer gegebenen Belastungsrate. Diese Werte wurden anschließend an das Bell-Evans-Modell angepasst; die Anpassung ergab Werte für Koff und delta X, die in guter Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen lagen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann der experimentelle Teil dieses Verfahrens in acht bis neun Stunden durchgeführt werden.Mithilfe dieses Verfahrens kann in einem nachfolgenden Experiment eine gezielte Mutagenese durchgeführt werden, um Aminosäuren zu identifizieren, die für die Bindung nach ihrer Entstehung entscheidend sind. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Einzelmolekül-Biophysik den Weg, um Faltungslandschaften von Proteinen zu untersuchen. Wir nutzen sie, um die mechanischen Eigenschaften von Cellulose-SOE zu erforschen, die zu den mechanisch stabilsten Proteinsystemen gehören, die derzeit bekannt sind.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie an Proteinrezeptor-Ligand-Paaren durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

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Die kovalente Befestigung von Sondenmolekülen an aatomaren Kraftmikroskopie(AFM)-Auslegerspitzen ist eine wesentliche Technik für die Untersuchung ihrer physikalischen Eigenschaften. So können wir die Dehnkraft, Desorptionskraft und Länge von Polymeren über die AFM-basierte Einzelmolekülkraftspektroskopie mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmen.

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.

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Rasterkraftmikroskopie-Infrarotspektroskopie (AFM-IR) bietet eine leistungsstarke Plattform für Bakterienstudien, die es ermöglicht, eine nanoskalige Auflösung zu erreichen. Sowohl die Abbildung subzellulärer Veränderungen (z. B. bei Zellteilung) als auch vergleichende Untersuchungen der chemischen Zusammensetzung (z. B. durch Arzneimittelresistenz) können auf Einzelzellebene in Bakterien durchgeführt werden.

Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Erfahren Sie die Anwendung von AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung mechanischer Eigenschaften und Faltungszustände von Cellulosom-Proteinen. Diese Methode liefert kinetische und energetische Informationen über Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

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