Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die mechanischen Eigenschaften und Faltungszustände von Fusionsprotein-Bindungspartnern mit Hilfe einer FM-basierten Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zu untersuchen. Dies wird durch kovalente Immobilisierung von Proteinbindungspartnern auf einem Objektträger und auf einem A FM-Cantilever, um in einem zweiten Schritt eine gut definierte Zuggeometrie zu erreichen. Die Glasoberfläche ist mit dem Cantilever eingedrückt, wodurch die Rezeptorligandenbindung hergestellt werden kann.

Als nächstes wird der Cantilever mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen, um einzelne Proteindomänen zu entfalten und den Rezeptorligandenkomplex zu assoziieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die tertiäre Strukturelemente offenbaren, die als Energiebarrieren entlang des Entfaltungswegs wirken, was in Polymerelastizitätsmodellen aufgedeckt wird. Weitere kinetische und energetische Informationen über die Bindungspartner können durch die Anpassung kinetischer Modelle an das dynamische Kraftspektrum gewonnen werden. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entfaltungswege von Proteinen unter Kraft zu untersuchen.

Diese Methode kann Aufschluss über die mechanische Stabilität von Proteinen geben. Es kann auf jedes Proteinrezeptor-Ligandensystem angewendet werden, das mit einer zugänglichen Dateigruppe hergestellt werden kann. Forscher, die diese Methode zum ersten Mal anwenden, tun mir schwer, weil das Timing entscheidend ist und die Handhabung der Ausleger schwierig sein kann.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Biophysik zu beantworten, z. B. wie sich ein Multi-Domain-Protein entfaltet. Zwei x 24 Millimeter große Glasabdeckungen mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern werden in den A-P-T-F-E-Halter gesteckt und dann beschallt. Der Deckel wird 15 Minuten lang in eine Mischung aus 50 bis 50 % Ethanol und Reinstwasser gleiten lassen.

Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, spülen Sie die Deckgläser mit Reinstwasser ab und ätzen Sie sie 30 Minuten lang in einer Piranha-Lösung. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Deckgläser und spülen Sie sie mit Reinstwasser ab und trocknen Sie sie unter einem sanften Stickstoffstrahl. Nächstes Eintauchen: Der Deckel gleitet in eine Mischung von 45 bis fünf zu eins aus Ethanol, Reinstwasser und drei Aminosäuren Propyldimethyl Ahoi.

Die Tauchproben werden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit etwa 50 Umdrehungen pro Minute auf einen Schüttler gelegt. Tauchen Sie dann den Deckglas nacheinander in 100 % Ethanol, gefolgt von Reinstwasser jeweils zweimal. Trocknen Sie die Eindeckeinlagen erneut unter einem sanften Stickstoffstrahl.

Nach dem Trocknen die Deckgläser im Ofen bei 80 Grad Celsius 30 Minuten backen. Lagern Sie die unbenutzten Deckgläser bis zu sechs Wochen unter Argonnen, um die Aminoisierung von Silikon-Cantilever-Spitzen durchzuführen. Legen Sie zunächst vier Silikonausleger auf einen sauberen Objektträger und behandeln Sie sie 15 Minuten lang mit UV-Ozon.

Tauchen Sie dann Ausleger für drei Minuten und eine 50 bis 50 Lösung aus Ethanol und drei Aminopropyldimethyloxis Ilene zusammen mit 25% Reinstwasser ein. Spülen Sie anschließend die Ausleger nacheinander 60 Sekunden lang in Bäckern mit Toluol, Ethanol und Reinstwasser. Trocknen Sie die Ausleger nach der letzten Spülung vorsichtig auf Filterpapier zwischen den RINs.

Lege die Auskragungen auf einen sauberen Glasschieber und backe sie bei 80 Grad Celsius für 30 Minuten. Bereiten Sie zwei Ts TEP Diss-Sulfid-Reduktionsperlen vor, indem Sie zuerst die Spitze einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abschneiden, um ihren Durchmesser zu erweitern, und dann 100 Mikroliter der Stammperlenlösung in jedes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen pipettieren. Geben Sie anschließend einen Milliliter TBS zu den TEP-Bead-Slurry-OTTs und spülen Sie die Kügelchen aus, indem Sie das Mikroröhrchen kurz vortexen.

Pelletieren Sie dann die Kügelchen, indem Sie die Proben drei Minuten lang bei 850 g zentrifugieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette und spülen Sie die Kügelchen noch zweimal mit einem Milliliter TBS aus. Zentrifugieren Sie zwischen den Spülgängen nach der letzten Spülung, fügen Sie den TEP-Kügelchen im Verhältnis eins zu zwei eine konzentrierte Proteinlösung mit drei Milligramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie die Aufschlämmung vorsichtig durch Rühren mit einer Mikropipettenspitze, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden.

Geben Sie dann die Protein-TEP-Bead-Slurry-Mischung für 2,5 Stunden auf einen Rotator. Weichen Sie Aminoaugen-Cantilever und Deckgläser 45 Minuten lang in Natriumbatpuffer bei einem pH-Wert von 8,5 ein, um die primären Amingruppen auf der Oberfläche zu deprotonieren. Dann N-H-S-P-E-G Malampulver auf Raumtemperatur erwärmen und 210 Mikroliter davon bei 25 Mikromolar zubereiten, indem es in Natrium-Boy-Acht-Puffer vortexiert wird.

Die Lösung sollte aufgrund der extrem kurzen Halbwertszeit von NHS so schnell wie möglich verwendet werden. Bei einem pH-Wert von 8,5 schnell 30 Mikroliter N-H-S-P-E-G Malam-Lösung auf eine Petrischale und 90 Mikroliter auf jeden zweiten Glasdeckglas geben. Platzieren Sie die Ausleger vorsichtig in den 30-Mikroliter-Tröpfchen.

Drehen Sie dann den Deckglas ohne Tröpfchen auf einen mit N-H-S-P-E-G Malam-Lösung, um ein Sandwich mit der N-H-S-P-E-G Malam-Lösung zu bilden. In der Mitte die Ausleger und Deckgläser eine Stunde lang mit der N-H-S-P-E-G MALAM-Lösung bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die TEP-Kugel und die reduzierte Proteinlösung eine Minute lang bei 100 GS und sammeln Sie das Snat.

Als nächstes verdünnen Sie die Proteinlösung mit TBS. Streben Sie während der Oberflächenkonjugation eine Proteinkonzentration in einem Bereich von 0,5 bis zwei Milligramm pro Milliliter an. Legen Sie dann die reduzierten und verdünnten Proteinlösungen für einige Minuten beiseite, während Sie Ausleger und Deckgläser spülen.

Spülen Sie die Deckgläser in drei nacheinander angeordneten Bechern mit Reinstwasser. Entfernen Sie Flüssigkeitsreste von den Deckgläsern, indem Sie vorsichtig die Ränder berühren, um das Papier zu filtern. Montieren Sie dann die Deckgläser in einen geeigneten Probenhalter, der mit dem A FM Gerät kompatibel ist, und trocknen Sie die Restflüssigkeit unter einem sanften Stickstoffstrahl.

Tragen Sie 20 Mikroliter der verdünnten Proteinlösung als Tröpfchen auf die Mitte der Deckgläser auf. Spülen Sie dann die Ausleger in drei aufeinanderfolgenden Bechern mit Reinstwasser, gefolgt von 30 Mikrolitern der zweiten verdünnten Proteinlösung. Pegylierte Deckgläser und Cantilever mit entsprechenden verdünnten Proteinlösungen werden bei Raumtemperatur für ein bis zwei Stunden in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert.

Spülen Sie anschließend mit einer Pipette mindestens 10 Mal mit einem Milliliter TBS ab und bewahren Sie sie dann bis zur Messung in TBS auf. Spülen Sie auch die Ausleger mit drei aufeinanderfolgenden TBS-haltigen Bechern, um ungebundene Proteine zu entfernen und sie ebenfalls in TBS zu speichern. Montieren Sie die funktionalisierten Objektträger, Cantilever- und Glasobjektträger in einem A FM-Modell, das für die Messung in Flüssigkeiten geeignet ist und einen zugänglichen Geschwindigkeitsbereich von ca. 200 bis 5.000 Nanometern pro Sekunde auf dem Z pieto unterstützt.

Bei der Montage der Dose ist darauf zu achten, dass die Oberflächen während des gesamten Prozesses bei korrekter Einstellung des Laserstrahls mit Puffer bedeckt bleiben. Lassen Sie das System mindestens 30 Minuten lang äquilibrieren, um Drifteffekte zu reduzieren, und passen Sie es bei Bedarf neu an. Beginnen Sie dann mit der Messung nach erfolgreicher Bindung der Kohäsion.

Docker im Paar die hier gezeigten aufgezeichneten Kraft-Entfernungs-Traces. Weisen ein charakteristisches Peakmuster auf. Jeder Peak in der Spur repräsentiert die Entfaltung einer Proteinsubdomäne, wobei der letzte Peak der Dissoziation des Rezeptorligandenkomplexes entspricht.

Die aufgezeichneten Kraft-Abstands-Leiterbahnen wurden dann in den Kraftkonturlängenraum transformiert und in einem Barrierenpositionshistogramm zusammengesetzt. Die Daten zeigen ein Konturlängeninkrement von etwa 89 Nanometern, das eindeutig der Entfaltung der Xin-Domäne zugeordnet werden kann, um die Energielandschaft des kohäsiven Dockers und der Wechselwirkung zu untersuchen. Insgesamt wurden 186 Datentraces bei vier verschiedenen Pooling-Geschwindigkeiten gewonnen.

Das resultierende dynamische Kraftkollektiv, dargestellt als große blaue Kreise, stellt die wahrscheinlichsten Bruchkräfte bei gegebener Belastungsrate dar. Diese Werte wurden dann an das Bell-Evans-Modell angepasst, die Anpassung ergab Werte für Koff und Delta X, die in guter Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen lagen. Einmal gemeistert, kann der experimentelle Teil dieser Technik in acht bis neun Stunden durchgeführt werden.

Nach diesem Verfahren kann in einem Folgeexperiment eine ortsspezifische Mutagenese durchgeführt werden, um Aminosäuren zu bestimmen, die für die Bindung nach ihrer Entwicklung entscheidend sind. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Einzelmolekül-Biophysik den Weg, um die Proteinfaltungslandschaften zu erforschen. Wir verwenden es, um die mechanischen Eigenschaften von Cellulose-SOEs zu untersuchen, die zu den mechanisch stabilsten bekannten Proteinsystemen gehören.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelmolekül-Kraftspektroskopie an Proteinrezeptor-Ligandenpaaren durchführt.