Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die mechanischen Eigenschaften und Faltzustände von Fusionsprotein-Bindungspartnern mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie auf Basis einer Kraftmikroskopie (FM) zu untersuchen. Dazu werden die Protein-Bindungspartner kovalent auf einem Objektträger und auf einem FM-Kanalhebel immobilisiert, um als zweiter Schritt eine gut definierte Zuggeometrie zu erreichen. Die Glasoberfläche wird mit dem Kanalhebel eingedrückt, wodurch die Bindung von Rezeptor und Ligand ermöglicht wird.

Anschließend wird der Cantilever mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen, um einzelne Proteindomänen zu entfalten und die Ergebnisse des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu erfassen; dabei erhält man Aufschluss über tertiäre Strukturelemente, die entlang des Entfaltungsprozesses als energetische Barrieren wirken und in Modellen der Polymerelastizität sichtbar werden. Weitere kinetische und energetische Informationen über die Bindungspartner können durch Anpassung kinetischer Modelle an das dynamische Kraftspektrum gewonnen werden. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entfaltungswege von Proteinen unter mechanischer Kraft zu untersuchen.

Diese Methode kann Einblicke in die mechanische Stabilität von Proteinen liefern. Sie ist auf jedes Protein-Rezeptor-Ligand-System anwendbar, das so modifiziert werden kann, dass eine zugängliche Gruppe vorliegt. Forscher, die diese Methode erstmals anwenden, haben häufig Schwierigkeiten, da der Zeitpunkt entscheidend ist und die Handhabung der Cantilever kompliziert sein kann.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biophysik zu beantworten, beispielsweise wie ein mehrdomänenhaltiges Protein entfaltet wird. Zunächst werden zwei Deckgläser mit einem Durchmesser von 24 Millimetern und einer Dicke von 0,5 Millimetern in einen A-P-T-F-E-Halter gegeben und anschließend 15 Minuten lang in einer 50:50-Mischung aus Ethanol und ultrareinem Wasser ultraschallbehandelt.

Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, spülen Sie die Deckgläser mit ultrareinem Wasser ab und ätzen Sie sie 30 Minuten lang in einer Piranha-Lösung. Nach 30 Minuten entfernen Sie die Deckgläser, spülen sie mit ultrareinem Wasser und trocknen sie unter einem schwachen Strom von Stickstoff. Tauchen Sie die Deckgläser anschließend in ein 45:5:1-Gemisch aus Ethanol, ultrareinem Wasser und 3-Aminopropyl-dimethyl-ahoy.

Stellen Sie die untergetauchten Proben 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Schüttler mit etwa 50 Umdrehungen pro Minute. Tauchen Sie dann den Deckel nacheinander jeweils zweimal in 100 % Ethanol und danach zweimal in ultrareines Wasser. Trocknen Sie die Deckgläser erneut unter einem sanften Strom von Stickstoff.

Nach dem Trocknen die Deckgläser 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius im Ofen backen. Die unbenutzten Deckgläser bis zu sechs Wochen unter Argon aufbewahren, um die Aminierung von Silizium-Cantilever-Spitzen durchzuführen. Zunächst vier Silizium-Cantilever auf einen sauberen Objektträger geben und 15 Minuten lang einer UV-Ozon-Behandlung unterziehen.

Anschließend tauchen Sie die Cantilever für drei Minuten in eine 50:50-Lösung aus Ethanol und drei Amino-Propyl-Dimethyl-Oxys-Ilene zusammen mit 0,25 % ultrareinem Wasser ein. Spülen Sie die Cantilever danach nacheinander jeweils 60 Sekunden lang in Bechern mit Toluol, Ethanol und ultrareinem Wasser aus. Trocknen Sie die Cantilever nach dem letzten Spülschritt vorsichtig auf Filterpapier zwischen den Spülgängen ab.

Platzieren Sie die Cantilever auf einem sauberen Objektträger und backen Sie sie 30 Minuten bei 80 Grad Celsius. Bereiten Sie zwei TEP-Dithiothreitol-vermindernde Beads vor, indem Sie zunächst die Spitze einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abschneiden, um deren Durchmesser zu vergrößern, und anschließend 100 Mikroliter der Stammlösung der Beads in jedes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen pipettieren. Geben Sie danach ein Milliliter TBS zur TEP-Bead-Suspension in den OTTs hinzu und waschen Sie die Beads durch kurzes Vortexen des Mikroröhrchens.

Sedimentieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation der Proben bei 850 Gs für drei Minuten. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette und waschen Sie die Kügelchen anschließend zweimal mit je einem Milliliter TBS. Zentrifugieren Sie jeweils zwischen den Waschschritten. Nach dem letzten Waschschritt geben Sie eine konzentrierte Proteingabe mit drei Milligramm pro Milliliter in einem Verhältnis von eins zu zwei zu den TEP-Kügelchen hinzu und mischen die Suspension vorsichtig durch Rühren mit einer Mikropipettenspitze, um die Bildung von Luftsblasen zu vermeiden.

Anschießend die Protein-TEP-Perlen-Suspensionsmischung 2,5 Stunden lang auf einem Rotator platzieren. Amino-Augen-Cantilever und Deckgläser 45 Minuten lang in Natriumboratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5 einweichen, um die primären Aminogruppen auf der Oberfläche zu deprotonieren. Danach N-H-S-P-E-G-Malam-Pulver auf Raumtemperatur erwärmen und 210 Mikroliter davon bei 25 Mikromolar durch Vortexen in Natriumboratpuffer herstellen.

Die Lösung sollte aufgrund der äußerst kurzen Halbwertszeit von NHS so schnell wie möglich verwendet werden. Bei pH 8,5 werden 30 Mikroliter-Tropfen der N-H-S-P-E-G-Malam-Lösung schnell auf eine Petrischale und 90 Mikroliter auf jede andere Glasdeckenschiebe gegeben. Die Cantilever werden vorsichtig in die 30-Mikroliter-Tropfen platziert.

Dann drehen Sie die Deckglasseite ohne Tropfen auf eine mit N-H-S-P-E-G-MALAM-Lösung, um ein Sandwich mit der N-H-S-P-E-G-MALAM-Lösung zu bilden. Inkubieren Sie in der Mitte die Cantilever und Deckgläser mit der N-H-S-P-E-G-MALAM-Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die TEP-Perle und die reduzierte Proteinlösung eine Minute lang bei 100 ×g und sammeln Sie das Überstand.

Als Nächstes verdünnen Sie die Proteiniösung mit TBS. Streben Sie eine Protein-Konzentration während der Oberflächenkonjugation im Bereich von 0,5 bis zwei Milligramm pro Milliliter an. Stellen Sie die reduzierten und verdünnten Proteinlösungen anschließend einige Minuten lang beiseite, während Sie die Cantilever und Deckgläser spülen.

Spülen Sie die Deckgläser nacheinander in drei Bechern mit ultrareinem Wasser. Entfernen Sie die restliche Flüssigkeit von den Deckgläsern, indem Sie vorsichtig die Ränder an Filterpapier anfassen. Danach montieren Sie die Deckgläser in einer geeigneten Probenhalterung, die mit dem AFM-Gerät kompatibel ist, und trocknen Sie die restliche Flüssigkeit unter einem schwachen Strom von Stickstoff.

Tragen Sie 20 Mikroliter der verdünnten Proteiniösung als Tropfen in die Mitte der Deckgläser auf. Spülen Sie anschließend die Cantilever nacheinander in drei Bechern mit ultrareinem Wasser, gefolgt von 30-Mikroliter-Tropfen der zweiten verdünnten Proteiniösung. Inkubieren Sie die pegylierten Deckgläser und Cantilever mit den jeweiligen verdünnten Proteiniösungen bei Raumtemperatur eine bis zwei Stunden in einer Feuchtigkeitskammer.

Als Nächstes spülen Sie die Deckgläser mit einer Pipette mindestens zehnmal mit je einem Milliliter TBS und lagern Sie anschließend in TBS bis zur Messung. Spülen Sie die Cantilever ebenfalls durch drei aufeinanderfolgende Becher mit TBS, um nicht gebundene Proteine zu entfernen, und lagern Sie sie ebenfalls in TBS. Befestigen Sie die funktionalisierten Cantilever und Glasscheiben in einem AFM-Modell, das für Messungen in Flüssigkeiten geeignet ist und einen zugänglichen Geschwindigkeitsbereich am Z-Piezo von etwa 200 bis 5.000 Nanometer pro Sekunde unterstützt.

Beim Montieren kann die Exposition gegenüber Luft minimiert werden, indem sichergestellt wird, dass die Oberflächen während des gesamten Prozesses nach korrekter Einstellung des Laserstrahls mit Puffer bedeckt bleiben. Lassen Sie das System mindestens 30 Minuten lang equilibrieren, um Drift-Effekte zu verringern, und nehmen Sie gegebenenfalls erneut eine Justierung vor. Beginnen Sie dann mit den Messungen nach erfolgreichem Binden der Kohäsion.

Docker in Paar die hier gezeigten aufgezeichneten Kraft-Abstand-Spuren. Zeigen ein charakteristisches Peak-Muster. Jeder Peak in der Spur repräsentiert die Entfaltung einer Protein-Subdomäne, wobei der letzte Peak der Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes entspricht.

Die aufgezeichneten Kraft-Abstand-Kurven wurden anschließend in den Kraft-Konturlängen-Raum überführt und in einem Histogramm der Barrierenpositionen zusammengefasst. Die Daten zeigen einen Anstieg der Konturlänge von etwa 89 Nanometern, der eindeutig der Entfaltung der Xin-Domäne zugeordnet werden kann, um die Energielandschaft der kohäsiven Docker-Wechselwirkung zu untersuchen. Insgesamt wurden 186 Datenspuren bei vier verschiedenen Sammelgeschwindigkeiten erhalten.

Das resultierende dynamische Kraftspektrum, dargestellt als große blaue Kreise, repräsentiert die wahrscheinlichsten Risskräfte bei einer gegebenen Belastungsrate. Diese Werte wurden anschließend an das Bell-Evans-Modell angepasst; die Anpassung ergab Werte für Koff und delta X, die in guter Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen lagen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann der experimentelle Teil dieses Verfahrens in acht bis neun Stunden durchgeführt werden.

Mithilfe dieses Verfahrens kann in einem nachfolgenden Experiment eine gezielte Mutagenese durchgeführt werden, um Aminosäuren zu identifizieren, die für die Bindung nach ihrer Entstehung entscheidend sind. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Einzelmolekül-Biophysik den Weg, um Faltungslandschaften von Proteinen zu untersuchen. Wir nutzen sie, um die mechanischen Eigenschaften von Cellulose-SOE zu erforschen, die zu den mechanisch stabilsten Proteinsystemen gehören, die derzeit bekannt sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie an Proteinrezeptor-Ligand-Paaren durchführt.