Name: Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung von AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung mechanischer Eigenschaften und Faltungszustände von Cellulosom-Proteinen. Diese Methode liefert kinetische und energetische Informationen über Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

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Die Autoren danken Hermann Gaub für die Finanzierung durch ein Advanced Grant des Europäischen Forschungsrats. Michael A. Nash bedankt sich dankbar für die Finanzierung durch das Branco Weiss Fellowship-Programm von Society in Science. Die Autoren danken Edward A. Bayer, Yoav Barak und Daniel B. Fried vom Weizmann Institute of Science für die großzügige Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Proteine. Die Autoren danken Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner und Stefan W. Stahl für die hilfreichen Gespräche.

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<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um aussagekräftige Daten aus Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Experimenten zu erhalten, ist es entscheidend, gut definierte und reproduzierbare Zuggeometrien zu erreichen. Das hier verwendete Protokoll führt zu einer ortsspezifischen Immobilisierung von Proteinkomplexen in einer definierten Zuggeometrie.
Die in dieser Studie verwendeten Ausleger wurden aufgrund ihrer Kraftempfindlichkeit und hohen Resonanzfrequenz im Wasser ausgewählt. Darüber hinaus ist die kleine Spitzenkrümmung von ca. 10 n...

Cellulosomen sind große Multienzymkomplexe, die auf der Oberfläche von anaeroben zellulolytischen Bakterien (z.B. C. thermocellum) dargestellt werden und sich entwickelt haben, um pflanzliche Zellwandlignocellulose effizient in lösliche Oligosaccharide zu depolymerisieren1. Ein zentrales Merkmal von Cellulosomen ist die hochaffine Kohäsin-Dockerin-Wechselwirkung. Im prominentesten Paradigma ist ein hochkonserviertes 60-75 Aminosäuren Typ I Dockerin-Modul am C-terminalen Ende der verschiedenen bakteriellen Enzyme dargestellt. Das Dockerin-Modul steuert die Assemblierung synergistischer Kombinationen von Enzymen auf das nichtkatalytische Gerüstprotein ("Scaffoldin"), das ein Polyprotein von Cohesin-Domänen umfasst, die spezifisch für das Typ-I-Dockerin-Modul sind. Auf höheren Ebenen kann die Zellulosomenarchitektur sehr komplex werden, da sie alternative Kohäsin- und Dockerinpaare (z. B. Typ II, Typ III) enthält, die die Strukturen an der Zelloberfläche verankern und den Zusammenbau von verzweigten Strukturen mit mehreren Gerüsten ermöglichen2. Die verschiedenen Cohesin-Dockerin-Typen weisen trotz verwandter Strukturen unterschiedliche Bindungsspezifitäten auf, die die Kreuzreaktivität mit unbeabsichtigten Gerüsten oder Komponenten anderer Cellulosom-produzierender Bakterienarten unterdrücken. Während bioinformatische Ansätze erfolgreich Tausende von einzigartigen zellulosomalen Komponenten auf genetischer Ebene identifiziert haben, sind vergleichsweise wenige Proteinstrukturen bekannt, und die Mechanismen, die bei der Bestimmung der Cohesin-Dockerin-Spezifität am Werk sind, bleiben ein aktives Gebiet der strukturbiologischen Forschung.
Seit der Erfindung des Rasterkraftmikroskops (AFM) durch Binnig et al.3 wurden verschiedene AFM-Betriebsmodi entwickelt und kontinuierlich verbessert, darunter die berührungslose Bildgebung, die Oszillationsmodus-Bildgebung4 und die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS)5,6. SMFS hat sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, um einzelne Proteine7-11, Nukleinsäuren12-15 und synthetische Polymere16-19 direkt zu untersuchen. In einem typischen SMFS-Experiment zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Bindung20,21 wird eine AFM-Cantileverspitze mit einem der Bindungspartner modifiziert, während eine flache Glasoberfläche mit dem komplementären Bindungspartner modifiziert wird. Der modifizierte Ausleger wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass sich die Partner binden können. Anschließend wird die Basis des Auslegers mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen und die Kraft mit dem optischen Hebelauslenkungsverfahren gemessen. Die resultierenden Kraft-Weg-Datenspuren weisen sägezahnartige Spitzen auf, wenn eine Bindung hergestellt wurde. In Fällen, in denen die Bindungspartner mit mehreren Proteindomänen fusioniert sind, kann jeder Peak in der Kraft-Weg-Kurve mit der Entfaltung einer einzelnen Proteindomäne oder gefalteten Subdomäne korreliert werden, während der letzte Peak einem Bruch der Proteinbindungsgrenzfläche entspricht. Die spezifischen Positionen der kraftresistenten Elemente können als Fingerabdruck verwendet werden, um die verschiedenen Proteindomänen zu identifizieren, die von Interesse sind. Mit dieser Methode können wichtige Aminosäuren abgefragt werden, die an der Proteinfaltung und -stabilisierung beteiligt sind. In der Literatur wurden viele Modelle beschrieben, um das charakteristische Kraftausdehnungsverhalten zu behandeln, das in SMFS-Experimenten beobachtet wurde. Zu den am häufigsten verwendeten Modellen gehören die freigelenkige Kette (FJC) Modell22, die schneckenartige Kette (WLC) Modell18,23-25 und die frei rotierende Kette (FRC) Modell25,26.
In unserer vorherigen Arbeit11 haben wir Einzelmolekül-Kraftspektroskopie verwendet, um die Wechselwirkung von Cohesin- und Dockerin-Modulen zu untersuchen. In dieser Arbeit stellen wir ein experimentelles Protokoll für die Funktionalisierung von Glasoberflächen und Cantilevern mit Enzym-Dockerin- und CBM-Cohesin-Proteinkonstrukten vor. Außerdem stellen wir ein AFM-basiertes SMFS-Protokoll vor, das Datenerfassungs- und Analyseverfahren umfasst. Das beschriebene Protokoll kann leicht auf andere molekulare Systeme verallgemeinert werden und sollte sich als besonders nützlich für Forscher erweisen, die an hochaffinen Rezeptorligandenpaaren interessiert sind.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyldimethylethoxysilan</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimid</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Disulfid Reduktionsgel</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever Mini-Siliziumnitrid-Ausleger</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Weiche Chargen</td></tr><tr><td>XYZ Piezoelektrische Aktuatoren</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarot " breites Spektrum" IR-Laser</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Datenerfassung und -analyse</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumborat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm Durchmesser, 0,5 mm Dicke</td></tr><tr><td>PTFE-Probenhalter</td><td></td><td></td><td>nach Maß</td></tr><tr><td>Sonicator-Bad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (konzentriert)</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td></td><td></td><td>analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td>geeignet für Mikroröhrchen</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung von rezeptor-liganden-systemen des cellulosom mit afm-basierter einzelmolekül-kraftspektroskopie

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomen sind diskrete Multienzymkomplexe, die von einer Untergruppe anaerober Bakterien und Pilze zur Verdauung lignozellulosehaltiger Substrate verwendet werden. Die Assemblierung der Enzyme an das nichtkatalytische Gerüstprotein wird durch Wechselwirkungen zwischen einer Familie verwandter Rezeptor-Liganden-Paare gesteuert, die interagierende Cohesin- und Dockerin-Module umfassen. Die extrem starke Bindung zwischen Kohäsin- und Dockerin-Modulen führt zu Dissoziationskonstanten im niedrigen pikomolaren bis nanomolaren Bereich, was genaue Off-Rate-Messungen mit herkömmlichen Bulk-Methoden erschweren kann. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) mit dem Rasterkraftmikroskop misst die Reaktion einzelner Biomoleküle auf Kraft und ist im Gegensatz zu anderen Einzelmolekül-Manipulationsmethoden (z. B. optische Pinzette) optimal für die Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit hoher Affinität, da sie den hohen Kraftbereich (>120 pN) untersuchen kann. Hier stellen wir unser vollständiges Protokoll zur Untersuchung zellulosomaler Proteinanordnungen auf Einzelmolekülebene vor. Unter Verwendung einer Proteintopologie, die vom nativen Cellulosom abgeleitet ist, arbeiteten wir mit Enzym-Dockerin- und Kohlenhydrat-Bindungsmodul-Cohesin (CBM-Cohesin)-Fusionsproteinen, die jeweils eine zugängliche freie Thiolgruppe an einem manipulierten Cysteinrest aufwiesen. Wir stellen unser ortsspezifisches Oberflächenimmobilisierungsprotokoll vor, zusammen mit unserem Mess- und Datenanalyseverfahren zur Ermittlung detaillierter Bindungsparameter für den hochaffinen Komplex. Wir zeigen, wie man die Entfaltungskräfte einzelner Subdomänen, komplexe Bruchkräfte, kinetische Off-Raten und potenzielle Breiten der Bindungsvertiefung quantifizieren kann. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methoden bei der Charakterisierung der Cohesin-Dockerin-Wechselwirkung, die für die Assemblierung von zellulolytischen Komplexen mit mehreren Domänen verantwortlich ist, wird weiter beschrieben.

Wir verwendeten das beschriebene Verfahren, um ein Typ-I-Cohesin-Dockerin-Paar aus C. thermocellum zu untersuchen. Nach erfolgreichem Binden des Cohesin-Dockerin-Paares zeigten die aufgezeichneten Kraft-Abstands-Kurven charakteristische Peak-Muster. Eine typische Kurve ist in Abbildung 4a dargestellt. Jeder Peak in der Kurve repräsentiert das Entfalten einer Proteinsubdomäne, wobei der letzte Peak der Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes entspricht.
Für den in d...

Cellulosomen sind Multienzymkomplexe, die für die Verdauung von Zellulose entwickelt wurden. AFM-basiertes SMFS wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften und die Faltungskonfiguration von Cellulosom-assoziierten Proteinanordnungen zu untersuchen. Wir präsentieren einen vollständigen Workflow für die Immobilisierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Proteinen, um die Wechselwirkungen einzelner Rezeptor-Liganden-Komplexe zu untersuchen, die an der Assemblierung von Cellulosomen beteiligt sind.

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die mechanischen Eigenschaften und Faltzustände von Fusionsprotein-Bindungspartnern mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie auf Basis einer Kraftmikroskopie (FM) zu untersuchen. Dazu werden die Protein-Bindungspartner kovalent auf einem Objektträger und auf einem FM-Kanalhebel immobilisiert, um als zweiter Schritt eine gut definierte Zuggeometrie zu erreichen. Die Glasoberfläche wird mit dem Kanalhebel eingedrückt, wodurch die Bindung von Rezeptor und Ligand ermöglicht wird. Anschließend wird der Cantilever mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen, um einzelne Proteindomänen zu entfalten und die Ergebnisse des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu erfassen; dabei erhält man Aufschluss über tertiäre Strukturelemente, die entlang des Entfaltungsprozesses als energetische Barrieren wirken und in Modellen der Polymerelastizität sichtbar werden. Weitere kinetische und energetische Informationen über die Bindungspartner können durch Anpassung kinetischer Modelle an das dynamische Kraftspektrum gewonnen werden. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entfaltungswege von Proteinen unter mechanischer Kraft zu un

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Systemen des Cellulosoms mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Wir beschreiben ein Protokoll zur Herstellung von gestützten Lipiddoppelschichten und dessen Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie und Kraftspektroskopie.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Wir präsentieren ein Verfahren zum Erreichen einer Sub-Nanometer Auflösung Bilder mit Amplituden-Modulation (Tapping-Modus) Rasterkraftmikroskopie in Flüssigkeit. Das Verfahren ist auf kommerzielle Atomkraftmikroskope demonstriert. Wir erläutern die Gründe für unsere Entscheidungen von Parametern und schlagen Strategien zur Auflösung Optimierung.

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Wir beschreiben die detaillierte Verfahren und Strategien zur Messung der mechanischen Eigenschaften und mechanische entfaltenden Wege der einzelnen Protein-Moleküle mit einem Rasterkraftmikroskop. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse als Referenz für die Auswahl und Begründung der gute einzelne Protein-Molekül-Aufnahmen.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Die kovalente Befestigung von Sondenmolekülen an aatomaren Kraftmikroskopie(AFM)-Auslegerspitzen ist eine wesentliche Technik für die Untersuchung ihrer physikalischen Eigenschaften. So können wir die Dehnkraft, Desorptionskraft und Länge von Polymeren über die AFM-basierte Einzelmolekülkraftspektroskopie mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmen.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

Rasterkraftmikroskopie-Infrarotspektroskopie (AFM-IR) bietet eine leistungsstarke Plattform für Bakterienstudien, die es ermöglicht, eine nanoskalige Auflösung zu erreichen. Sowohl die Abbildung subzellulärer Veränderungen (z. B. bei Zellteilung) als auch vergleichende Untersuchungen der chemischen Zusammensetzung (z. B. durch Arzneimittelresistenz) können auf Einzelzellebene in Bakterien durchgeführt werden.

Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Erfahren Sie die Anwendung von AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung mechanischer Eigenschaften und Faltungszustände von Cellulosom-Proteinen. Diese Methode liefert kinetische und energetische Informationen über Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

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