Name: A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Flow-Kammer-Technik zur quantitativen Messung der Chemokine-gesteuerten Extravasation zirkulierender Zellen unter physiologischen Scherstressbedingungen.

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Wir danken Chuck Scott McKnight und Victor von der CBS Scientific Company Inc. ( <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> ) für technische Unterstützung und die Herstellung des 3D-Kammer, Gasaustausch Einheit und fügt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Zuschüsse R21DK067084 und R43CA141782 zu SKK) unterstützt.

1. Bereiten Sie die Ober-und Niederösterreich Einsätze für Zellwachstum durch Collagen Coating <ol><li> Berechnen Sie die Anzahl der Einsätze für das Experiment benötigt. Setzen Sie jeden Einsatz in einem separaten sterilen Petrischale (35 x 10 mm) und sterilisieren durch Bestrahlung (11 Gy). </li><li> Bereiten Sie die Kollagen-Lösung für die Beschichtung von Membranen: 50 ug / ml, 154 ul pro Einsatz (einfügen Fläche 1,54 cm 2). </li><li> Legen Sie einige Tropfen (~ 20 ul pro Tropfen) von Kollagen-Lösung in einem Kreis auf der Oberfläche des Einsatzes Membran (lassen Sie sich nicht die Pipettenspitze berühren Sie die Oberfläche) und dann vorsichtig den Rest der aliquote zu einem großen Tropfen auf das Formular Membranfläche. Sicherstellen, dass die Kollagenlösung halbkugelförmigen bleibt und nicht von der Membranoberfläche abzulassen. </li><li> Decken Sie die Petrischale mit einem Deckel und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einer ebenen Fläche. </li><li> Saugen Sie die Kollagen-Lösung und waschen Sie die Membran einmal durch Abdecken mit 160 ul PBS. </li><li> Aspirate der PBS und ersetzen Sie den Deckel. Wenn Sie noch am selben Tag, platzieren Sie den Petrischale in einem trockenen Ort bei Raumtemperatur. Andernfalls setzen Sie die Schüssel bei 4 ° C und verwenden Sie den Einsatz innerhalb von 7 Tagen. </li></ol> 2. Kultur Endothelial Zellen auf der oberen Einsätze <ol><li> Bereiten EG Suspension in gewünschten Kulturmedium. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen&gt; 98% ist und sofort verwenden. </li></ol> Hinweis: Für den menschlichen Nabelschnur-EC (HUVEC), 4 x 10 5 Zellen in 160 ul pro Einsatz verwendet wird. <ol start="2"><li> Nehmen Sie die Petrischalen mit Kollagen-beschichteten Einsätze in Abschnitt 1 hergestellt; entfernen Sie nicht die Einsätze von den Gerichten. Legen Sie mehrere kleine Tropfen der Zellsuspension (etwa 20 ul pro Tropfen) in einem Kreis auf der Oberfläche des Kollagen-Membran (lassen Sie sich nicht die Pipettenspitze berühren die Oberfläche) und dann vorsichtig den Rest der Zellsuspension zu bilden, ein großer Tropfen. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension hemis bleibt<html> asphärischen und nicht von der Membranoberfläche abzulassen. </li><li> Ersetzen Sie die Deckel und vorsichtig die Gerichte in einer 5% CO 2 Zellkulturbrutschrank und inkubieren (ohne Schütteln) bei 37 ° C für 30 min, um die Zellen an die Membran zu befestigen. </li><li> Vorsichtig 5 ml Kulturmedium zu jeder Petrischale sicherzustellen, dass der Einsatz auf dem Boden der Schale bleibt und wird vollständig vom Medium bedeckt. Ersetzen Sie die Deckel und sorgfältig das Geschirr wieder in den Inkubator. Kultur die Zellen bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Verwenden Sie den gleichen Ansatz für die zweite (optional) unteren Einsatz mit Zellen, die die lokalen Mikroumgebung, die unterhalb des Einsatzes mit der EC-Schicht platziert werden vorzubereiten. </li></ol> Hinweis: Wenn die unteren Einsätze in den Experimenten enthalten sind, die oberen und unteren Einsätze werden zunächst miteinander, bevor die Einsätze in der 3D-Gerät (4B) verbunden. e &quot;&gt; 3. Montieren Sie das Gerät 3D-Flow-Kammer <ol><li> Schrauben Sie die oberen und unteren Platten, verbinden Sie die Platten an den Gasaustausch Gerät mit Schlauch, legen Sie die zusammengebaute Vorrichtung in eine saubere Plastiktüte und sterilisieren die Tasche und Inhalt durch Bestrahlung (11 Gy). </li><li> Entfernen Sie ein Tablett-Regal aus der Zellkultur-Inkubator, Ort in eine sterile Gewebekultur Kapuze, Spray mit 70% Ethanol, abwischen, und dann decken Sie das Fach mit einem großen sterilen Serviette. </li><li> Setzen Sie den bestrahlten Plastiktüte in die Haube, entfernen Sie das Gerät aus der Tasche und auf der sterilen Brutkasten Fach. Verbinden Sie das Gerät, um die peristaltische Pumpe mit dem Schlauch versehen. Programmieren Sie die Pumpe für eine optimale Geschwindigkeit von 0,2 ml / min. </li></ol> Hinweis: Um die Pumpe mit der Steckdose verbinden, extrudieren die Stromkabel durch das Loch in der Rückseite des Inkubators. Verwenden Räuber Stecker um das Kabel, um sicherzustellen, dass das Loch luftdicht ist. <ol start="4"><li&gt; Platz 5 - 7 ml gewünschten Kulturmedium in ein steriles 15 ml Röhrchen (für den &quot;Einlass&quot;). </li></ol> 4. Prime 3D-Flow-Kammer Gerät <ol><li> Trennen Sie den Zulaufschlauch aus der Steckdose, indem das Metall Nadel aus dem Schlauch (verwenden kleinen sterilen Servietten, um die Sterilität des Schlauches zu halten). Verwenden Sie die Metall-Nadel mit dem Schlauch als &quot;Einlass&quot; und das Ende des Schlauchs getrennt als &quot;Auslauf&quot;. Legen Sie die Metall-Nadel Einlass in die 15-ml-Tube mit den Medien; platzieren Sie den Ausgang in den leeren 15-ml-Tube. </li><li> Schalten Sie die Pumpe so die Strömung gegen den Uhrzeigersinn und stellen Sie die Durchflussmenge bei 0,2 ml / min. Erlauben den Unterdruck, um das Medium aus dem Einlass 15 ml Röhrchen ziehen in die Rohrleitung und die Pumpe, wenn das Medium das Ende des Schlauches unmittelbar vor der Vorrichtung (2, Stop # 1) verbindet. </li><li> Lösen Sie die oberen und unteren Platten des Gerätes. Entfernen Sie vorsichtig die obere Platte und Platz 1.500 - 1.550 ul medium (entweder Medium allein oder zuzüglich der experimentellen Chemokine) in die unteren Vertiefungen. Achten Sie darauf, die gut enthält ausreichend Medium, um eine Halbkugel, die ungefähr 1 erreicht bilden - 2 mm über die untere Platte. </li><li> Übertragen Sie die vorbereiteten Einsatz aus der Petrischale in die Vertiefungen der unteren Platte mit einer sterilen Pinzette, darauf achten, dass keine Luftblasen unter den Einsätzen gefangen sind. Saugen jedes Medium, das auf der Oberfläche der unteren Platte, um sicherzustellen, dass die Platte trocken bleibt geöffnet. Legen Sie die obere Platte wieder auf der unteren Platte und verbinden die Platten mit den Schrauben. </li><li> Unmittelbar nach der peristaltischen Pumpe drehen und ermöglichen Medium, durch das 3D-Gerät fließen. Erhöhen das Auslaßende der Vorrichtung und zur Erhaltung der Kammer in dieser Position, um die Bildung von Blasen in den Raum zwischen den Platten zu verhindern. </li><li> Lassen Sie das Medium, um die Kammer und den Schlauch, der die Kammer der Gasaustausch Einheit zu füllen. Stoppen Sie die Pumpe sofort, bevor das Medium erreicht das Gas eXchange-Einheit (Abbildung 2; Stop # 2). Platz 3 ml Medium in den Gasaustausch Einheit, an der Pumpe ein, und lassen die Luftblasen durch den Gasaustausch Einheit entkommen. Elevate den Gasaustausch Einheit, damit das Medium, um den Schlauch Verlassen des Gasaustauscheinheit füllen und die Pumpe, wenn das Medium erreicht 2 - 3 cm vor dem Ende der Ablaufschlauch (Abbildung 2, Stop # 3). </li><li> Schließen Sie den Eingang Metall Nadel an der Steckdose mit kleinen sterilen Servietten. Programmieren der Pumpe so strömt das Medium in die entgegengesetzte Richtung (im Uhrzeigersinn) in Richtung der Gasaustausch sowie Gewährleistung Luftblasen entfernt werden, sobald sie die Gasaustauscheinheit erreichen. Überprüfen Sie, dass keine Luftblasen im System verbleiben. </li><li> Programmieren Sie die Pumpe so strömt das Medium gegen den Uhrzeigersinn. 100 l des Tests Zellsuspension zum Gasaustausch Einheit. Schließen Sie den Deckel des Gasaustauscheinheit, legen Sie das Fach mit dem funktionierenden System zurück in den Inkubator, und lassen Sie die Test-Zellen circulate im 3D-Gerät bei 37 ° C für die gewünschte Zeit. </li></ol> Hinweis: Reinigen Sie das Stromkabel der Pumpe mit 70% Ethanol und legen Sie sie in dem Inkubator. 5. Beenden Sie den Test und sammeln Proben für Assay <ol><li> Entfernen Sie das Fach mit dem funktionierenden System aus dem Inkubator und in der Kapuze. Stoppen Sie die Pumpe, trennen Sie das Ein-und Auslass, und legen Sie die Enden in leere sterile 15 ml Röhrchen. </li><li> Schalten Sie die Pumpe und sammeln die Zellsuspension aus dem System; Ort der Zellsuspension auf Eis, gegebenenfalls bis zur Verwendung. </li><li> Demontieren Sie die Kammer durch Entfernen der Schrauben und Abheben der oberen Platte. Entfernen Sie die Einsätze aus der unteren Platte und übertragen Sie sie auf Petrischalen. </li></ol> Hinweis: Die Einsätze können gefärbt zu visualisieren und zu zählen Zellen in situ (Kristallviolett 0,05% in dH 2 O) oder Trypsin behandelt, um die EG weiter sammelnTests. <ol start="4"><li> Das Medium entfernt und die Zellen aus den unteren Vertiefungen in und Zentrifugenröhrchen für 5 min bei 210 x g. Der Überstand wird abgenommen, waschen und resuspendieren, wie gewünscht, und die Verarbeitung der Zellen je nach den spezifischen experimentellen Ziele (weiter unten diskutiert). </li></ol>

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Cascade LifeSciences Inc. besitzt exklusive Rechte an US-Patent Nr. 7.927.867 B2 &quot;Device zur Auswertung in vitro Zellwanderung unter Strömungsbedingungen und Methoden für deren Verwendungen&quot;. SKK ist ein Erfinder des 3D Fließkammer Gerätetechnik und eine wissenschaftliche Mitbegründer und Gesellschafter der Cascade LifeSciences Inc.

Die 3D-Gerät kann eine nützliche Technik für die Forschung in verschiedenen Bereichen wie Stammzellbiologie, vaskuläre Biologie, Hämatologie, Onkologie, Autoimmunerkrankungen und Entzündungen sein. Die 3D-Gerät ist besonders nützlich für die Forscher studieren hämatopoetische, mesenchymale, neuronalen und andere Stammzellen, um die molekularen Mechanismen, die die einzelnen Schritte der Stammzelle Extravasation Kaskade zu untersuchen. Forscher, die Zellwanderung kann auch mit diesem Gerät die unterschiedlichen Mechanismen der wandernden T-und B-Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, NK-Zellen und anderen wandernden Zellen zu untersuchen. In Gefäßbiologie, wird das Gerät nützlich sein für die Beurteilung der Wirkung der lokalen Mikroumgebung auf die Fähigkeit der EG Zellrekrutierung zu unterstützen und die Blut-Hirn-Schranke in vitro nachzuahmen. Für Forscher mit Schwerpunkt auf Krankheitsentstehung, kann das Gerät verwendet werden, um die Migration von zytotoxischen T-Zellen in der Bauchspeicheldrüse bei Typ-I-Diabetes, die mi studierengration von Eosinophilen in die Lunge von Asthma-Patienten, die Migration von Neutrophilen, Monozyten und Lymphozyten in entzündeten Stellen in einer Vielzahl von Erkrankungen, die Rekrutierung von Zellen zur Heilung Websites gewickelt, die Interaktion von zytotoxischen T-Zellen mit dem Neovaskulatur und Rekrutierung von zytotoxischen T-Zellen in Tumoren. Die neuartige 3D-Gerät wird auch ein nützliches Werkzeug für die translationale Wissenschaft und für die präklinische Entwicklung von Arzneimitteln und Screening. Zum Beispiel kann das Gerät verwendet, um die Herstellung von therapeutischen Zellsuspensionen für die intravenöse Verabreichung zu optimieren, um die Einstellung von therapeutischen Zellen an verletztes Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe zu testen, und die Rolle der spezifischen Organ oder Gewebe Endothel und Mikroumgebung in diese zu untersuchen Prozess. Für Entwicklung von Medikamenten, könnte das Gerät verwendet, um Wirkstoffkandidaten zu testen, die auf Tumorzellen und blockiert jeden Schritt der Extravasation Kaskade, die Migration Zellen als ein Medikament liefern testeny Fahrzeug Tumorstellen, um Medikamente, die die Funktion der menschlichen Organ-spezifische Endothel oder der lokalen Gewebe-spezifischen Mikroumgebung zu regulieren und Kombinationen von Medikamenten, die verschiedenen Schritte des Homing-Kaskade regulieren testen testen. Schließlich, wenn es in einem High-Throughput-System überführt, kann die Vorrichtung für das Screening kleiner Moleküle, Peptide und Antikörper, die Target-Moleküle vermittelt Zelltransportsignal verwendet werden. Technische Details und Tipps Rollen und die Adhäsion unter Fluss sind die entscheidenden Schritte in der Extravasation Kaskade und tragen wesentlich zur Effizienz der Zellwanderung in vivo. Bemerkenswert ist, diese Schritte nicht auf statische Tests in vitro beitragen. Allerdings sind statische Transmigration Assays, als negative Kontrollen in Experimenten Testen der Auswirkungen von Scherspannung auf das Überleben der Zelle und die Funktion, einschließlich der Fähigkeit von EG niedrig Affinitätswechselwirkungen (Rollen) und eine gute Haftung zu unterstützen. Die Wahl des Mediums für Experimente in der 3D-Gerät ist wichtig. Medien enthalten verschiedene Wachstumsfaktoren, die das Überleben der zirkulierenden Zellen beeinflussen, vor allem während der langen Inkubationszeit kann. Darüber hinaus sind die Konzentrationen von Ca 2 + und Mg 2 +, kann die adhäsive Wechselwirkungen unter den Bedingungen der physiologischen Strömung beeinflussen, variieren beträchtlich in kommerziellen Kulturmedien. Weitere technische Details, die berücksichtigt werden bei der Planung von Experimenten mit dem 3D-Gerät soll im Folgenden erörtert werden. Auswahl des EG Monoschicht Die Zelloberfläche Unterschrift des EG wird durch verschiedene Parameter, einschließlich der Arten und Gewebe des Ursprungs und die Bedingungen der Zellkultur, die Berücksichtigung in der experimentellen Design berücksichtigt werden sollten beeinflusst. Einige häufig verwendete EC zählen unter anderem Lungen-abgeleitet mikrovaskulären EC (LDMVEC), Knochenmark-abgeleitete EC (BMDEC), brain-derived EC (BDEC) und HUVEC.Die Eigenschaften von EC variieren auch mit ihrer Herkunft. Zum Beispiel BMDEC konstitutiv Selektine und VCAM-1, die für die Rollen und Haftung sind, während BDEC, LDMVEC und HUVEC nicht äußern diese Moleküle unter normalen Bedingungen. Daher kann Einsätze mit BDEC, LDMVEC und HUVEC beschichtet mit TNF α (10 ng / ml, 4 h) oder andere Faktoren zu imitieren Entzündung und induzieren die Expression von Homing-Moleküle vorbehandelt werden. Testen Übersprechen mit der lokalen Mikroumgebung Es gibt ein wachsendes Interesse an Verständnis, wie die lokale Mikroumgebung die Funktionen der EG regelt und beteiligt sich in Zelle Extravasation. Unsere Ergebnisse zeigen, daß das Einsetzen einer Monoschicht von Stromazellen unter dem EC Monoschicht erhöht Extravasation von zirkulierenden Zellen. Dieser Befund zeigt, dass Übersprechen zwischen EG und Stroma die Fähigkeit der Gemeinschaft zur Extravasation von zirkulierenden Zellen unterstützen verbessert. Moreover, könnte das Einführen von Zellen von verschiedenen Mikroumgebung (zB mesenchymale Stammzellen, Fibroblasten, Tumorzellen, Astrozyten) helfen, spezifische Gefäßbetten imitieren. Insbesondere könnte eine Kombination von brain-derived EG und Astrozyten einen sinnvollen Ansatz, um die Blut-Hirn-Schranke zu imitieren sein. Ebenso Zellen von Patienten oder normalen Zellen in vitro manipuliert erhalten, könnte dazu beitragen, eine bestimmte Mimik erkrankten Mikroumgebung. In unseren Studien haben wir niedrigere Einsätze mit Stromazellen gewachsen zu 50% Konfluenz. Obwohl die optimale Dichte microenvironmental Zellen der Einsätze von den Zielen der Studie abhängen wird, kann dieser leicht verändert und gesteuert werden. Auswählen einer Schubspannung Rate Die Scherspannung von 0,8 dyn / cm 2 wurde hier, weil dies von Von Andrian et al nachgewiesen werden. die Schubspannung sein im Knochenmark microvasculature, wo hämatopoetischen Vorläuferzellen verlassen die Durchblutung an und geben Geweben unter normalen physiologischen Bedingungen 15. Im Gegensatz dazu sind höhere Schubspannung in größeren Gefäßen, wo Zelle Extravasation begrenzt beobachtet. Daher könnte eine hohe Schubspannung Preise als zusätzliche Kontrollen für Experimente untersuchen Extravasation von verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Das Überleben von Zellen unter Schubspannung hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Zelltyp und ex vivo-Therapien (Gontscharowa et al., Unveröffentlichte Beobachtungen), und sollte daher sorgfältig während des Tests ausgewertet werden. Handy Empfindlichkeit zu unterschiedlichen Schubspannung (Scherspannung Widerstand) konnte durch die Programmierung der peristaltischen Pumpe, um die Scherspannung Rate schrittweise zu erhöhen von 0,8 dyn / cm 2 bis 6 dyn / cm 2 ausgewertet werden. Während dieser Tests können Zellen periodisch von der Gasaustauschkammer gesammelt werden, um Zelltod mit überwachen,sagt wie Trypanblauausschluß, Annexin V und PI-Färbung und Apoptose Marker Ausdruck. Wenn Experimente sind entworfen, um die Scherbeanspruchung Widerstand der ex vivo veränderten Zellen oder Zellen aus Parenchym abgeleitet testen, empfiehlt es sich, weitere positive Kontrollen, wie Blut übertragbaren Zellen, die in den Experimenten enthalten sind. Auswahl des Einsatzes Porengröße und ECM Beschichtung Einsätze sind mit mehreren Porengrößen (3, 5 und 8 um) zur Verfügung. Die Wahl der Porengröße hängt von der Größe und Eigenschaften der zirkulierenden Zellen Test abhängen, ist das auch der Fall für statische Transwell-Assays. Einsätze mit einer großen Porengröße (8 um) werden empfohlen, um Extravasation von großen Zellen wie Tumorzellen epithelialen Ursprungs testen. Leukozyten oder hämatopoetische Stammzellen sind häufiger mit 5 um Pore Einsätzen getestet und 3 um Pore Einsätze sind am besten für die Prüfung Extravasation von s vorbehaltenKleine Zellen. Allerdings ist die Messzelle Größe allein nicht der einzige wichtige Faktor, und wir empfehlen Testen Einsätze mit mehreren Porengrößen. In unseren ersten Studien testeten wir verschiedene ECM für ihre Fähigkeit, das Wachstum von EC an den Einsätzen zu unterstützen und Schubspannung für&gt; 4 h standhalten. Das ECM getesteten Matrigel, Poly-D-Lysin, Fibronectin, Laminin, Typ I Kollagen, Hydrogel, Meta-Keratin I, II, III, IV, und extrazellulären. Die besten Ergebnisse für die EG-Wachstum wurden mit extrazellulären, Fibronektin und Kollagen erhalten. Doch in unseren Händen, extrazellulären bei 0,8 g / cm 2 deutlich reduziert die Seelenwanderung von Test-Zellen durch die Membran. Daher verwenden wir jetzt Fibronektin (5 ug / cm 2) oder Kollagen (5 ug / cm 2) für die Beschichtung von Einsätzen. Allerdings wird die optimale Wahl von ECM wahrscheinlich sowohl von der Art der EG und den Transmigratory Eigenschaften der Test-Zellen beeinflusst werden. Ein Vorversuch durchgeführt werden, um die Integri testenty des EG-Monoschicht auf ausgewählte ECM gewachsen. Zum Beispiel, statt pre-beschichteten Wendeschneidplatten mit EC Monoschichten in Petrischalen mit Kulturmedium gefüllt, legen Sie die Gerichte auf einem Schüttler bis Schubspannung (niedrige Einstellung) zu erstellen, und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 für 12 Stunden. Die Integrität der EG nach der Einwirkung der Scherbeanspruchung unter Verwendung Kristallviolettfärbung werden. Auswahl der optimalen Test Zellkonzentrationen Die Fähigkeit von Zellen, um den Test zu beenden Zirkulation hängt von vielen Besonderheiten der einzelnen Zelltyp. Um signifikante Ergebnisse zu erzeugen, muss die umlaufende Zelldichte optimiert, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen in den positiven Kontrollvertiefungen zu migrieren. Daher empfehlen wir Vorversuche mit einer Reihe von Zelldichten (zB 10 3 / ml bis 10 7 / ml), die Beziehung zwischen der Anzahl der Zellen in das System geladen und verstehendie Zahl der Zellen, die Transmigration unterziehen. Darüber hinaus kann das optimale zirkulierende Konzentration im gleichen Zelltyp von verschiedenen Quellen unterscheiden. Zum Beispiel sind CD34 +-Zellen eine heterogene Zellpopulation, die sowohl hämatopoetischen Stammzellen und engagiert linienspezifischen Vorläuferzellen. Sie aus dem Knochenmark erzielt werden kann, mobilisierte periphere Blut und Nabelschnurblut. Die CD34 +-Zellen aus diesen drei Quellen besitzen unterschiedliche Fähigkeiten Homing und engrafting 16-18, so dass die Bedingungen für die Prüfung dieser Zellen in der 3D-Gerät sollte vor einem Full-Scale-Studie optimiert werden. Auswahl optimaler Zellzirkulation Zeit Die optimale Zirkulationszeit sollte empirisch für jeden Zelltyp bestimmen. Die minimale Zeit für die Zirkulation erforderlich konnte aus den Ergebnissen der statischen Zellmigrationsassays extrapoliert werden, aber dies kann exten werdended, wenn die Zellen einer Scherbeanspruchung unterworfen werden. Pilotstudien testen Umlaufzeiten zwischen 4 und 96 Stunden empfohlen. Der Gasaustausch Einheit Der Hauptzweck des Gaswechsel-Einheit ist, um die optimale Konzentration des CO 2 in dem Medium, welches durch den 3D-Vorrichtung, ähnlich wie bei den Standard-Einstellungen in Gewebekultur Inkubatoren halten. Der Gasaustausch Gerät kann auch zum Hinzufügen von Test-Zellen und Verbindungen und für das Sammeln von Sonden und Proben während des Tests verwendet werden. Auswertung der Versuchsergebnisse Zellzahlen Zirkulierenden Zellen können zu unterschiedlichen Zeiten während des Experiments durch den Gasaustausch Einheit abgetastet werden. Am Ende des Experiments, könnten die verbleibenden Zellen im Kreislauf vom Auslass gesammelt werden. Wenn das 3D-Vorrichtung am Ende des Experiments wird zerlegt, kann die transmigrierten Zellen aus den unteren Vertiefungen geerntet und gesammelt foder weiteren Analyse. Wenn die Eingangs-Zellen unmarkiert sind, können die transmigrierten Zellen mit Trypanblau und Live / Dead-Zellen mikroskopisch aufgezählt gefärbt werden. Alternativ könnten die Eingangs-Zellen, die mit einem der vielen &quot;Zelle tracker&quot; Farbstoffe für Live Cell Imaging vor dem Einlegen in das 3D-Gerät gekennzeichnet sein, in diesem Fall, transmigrierten Die geernteten Zellen zur Quantifizierung der Fluoreszenz sollte lysiert werden. Auswahl des optimalen Stichprobengröße Um statistische Analyse zu ermöglichen, muss eine Stichprobe gewählt werden, dass ca. 80% Strom zu versorgen, um die hypothetischen Unterschied in den mittleren prozentualen Veränderungen zwischen beiden Gruppen, wenn sie bei einem Signifikanzniveau von 0,05 getestet mit einem zweiseitigen t-Test zu ermitteln. Basierend auf unserer Erfahrung mit Knochenmarkzellen, verwenden wir drei Wells pro experimentelle Bedingung für den 3D-Gerät Experimente. Allerdings wird die optimale Stichprobengröße mit dem Ziel des Experiments variieren und sollte bestimmt werden empirically. Multiple Regression statistische Tests, zweiseitigen t-Tests und Analysen der Varianz können statistische Relevanz der Ergebnisse zu überprüfen. Auswahl von Chemokinen Wie bei allen Seelenwanderung Assays wird die Wahl von Lockstoff durch die Eigenschaften der Test-Zellen und das Ziel der Studie diktiert werden. SDF-1 ist ein gut etabliertes Lockstoff für hämatopoetische Zellen. In unseren Händen, war eine Konzentration von 50 ng / ml SDF-1 optimal Extravasation von Knochenmark gewonnenen hämatopoetischen Vorläuferzellen stimulieren. Wir verwenden auch C3a und bFGF als Lockstoffe für mesenchymale Stammzellen 19. Wir empfehlen jedoch, Titration jeweils Chemokin-und Cross-Titration Kombinationen von Chemokinen, die optimale Konzentrationsbereich vor einer Full-Scale-Studie identifizieren. Für bestimmte Zelltypen, kann eine Kombination von chemotaktischen Faktoren vorteilhaft sein. Wenn Chemokine für spezifische Prüf-Zellen sind unbekannt oder nicht verfügbar ist, conkonditionierten Medien von stimulierten Lymphozyten, Fibroblasten und anderen Zellen als Quelle für chemische Lockstoffe verwendet werden. Auswahl der ausgelesenen Parameter Die Vielseitigkeit des 3D-Gerät erweitert die Art der Seelenwanderung Experimenten, die durchgeführt werden können, und der Erfolg der Experimente wird auf nachdenkliche Erörterung und Gestaltung der Anzeige-Parameter abhängen. In der Regel Zellen aus dem oberen (Umluft) Kammer und die untere (statisch) Fach sollte für die Lebensfähigkeit gleichzeitig als Zellzählung getestet werden. Einige Zellen besitzen eine geringe Toleranz gegenüber dem physiologischen Schubspannung in der Mikrovaskulatur beobachtet. In diesem Fall wird die Anzahl der toten Zellen in der oberen Kammer erhöht werden. Die Zahl der anhaftenden Zellen verhaftet (oder gefangen) auf der EC-Schicht kann durch Immunzytochemie von Markern speziell von den Test-Zellen exprimiert ausgewertet werden. Antikörper, die für CD31 und vWF verwendet werdenEG zu erkennen und Diskriminierung zwischen den Test-und EC-Zellen zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte die Integrität des EG Monoschicht am Ende jedes Tests überwacht werden. Die Arten von Analysen mit den gesammelten Zellen durchgeführt wird auf der Ermittler experimentelle Ziele ab, konnte aber die Analyse von Veränderungen in der Genexpression von Mikroarrays und qPCR, Oberflächenmolekül Expression durch FACS-Analyse, die Aktivierung von Signalwegen durch FACS und Western Blot und Faktor enthalten Sekretion mittels ELISA. Eine riesige Auswahl an funktionalen Tests sind auf den gesammelten Zellen in vitro möglich, da durch unsere eigene Arbeit, in denen wir die kultiviert transmigrierten Knochenmarkzellen, die hämatopoetischen Vorläuferzellen (Abbildung 3) aufzuzählen belegt. Die gesammelten Proben können auch in einer Vielzahl von in-vivo-Tests überprüft werden. Ein wichtiger Parameter, die helfen, das Verhalten der Testzellen in vivo vorherzusagen ist neigenrenz von einigen Zellen zu Aggregaten unter verschiedenen Scherraten Stress bilden. Zum Beispiel könnte therapeutische Zellen, die Aggregatbildung in der 3D-Gerät zu unterziehen haben eine größere Neigung zur Klumpenbildung nach intravenöser Verabreichung zu bilden und zu akuten Gefäßverschluss in vivo (Gontscharowa et al., Unveröffentlichte Beobachtungen). Aggregatbildung konnte mikroskopisch durch Abtasten der Testzellen während oder nach Beendigung des 3D-Gerät Experiments überwacht werden.

Handy Extravasation ist der Prozess, durch den zirkulierenden Zellen verlassen die Blutbahn und ist eine wichtige Komponente für viele physiologische Reaktionen im Körper. Das Verfahren ist auch für die Geweberegeneration wichtig, da zum Beispiel, wenn therapeutische Zellen aus dem Gewebe in die Blutgefäße (oder intravenös injiziert) mobilisiert durch das Gefäßsystem wandern und verlassen die Zirkulation zu Websites von Verletzungen oder Degeneration. Extravasation ist auch ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese vieler Krankheiten, einschließlich Entzündung, Immunabwehr, Autoimmunität und der Metastasierung. Extravasation ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die die Interaktion von zirkulierenden Zellen, die mit Endothelzellen (EC) unter Bedingungen physiologische Strömung umfasst. Das Verfahren umfasst (a) Zelle Walzen, (b) eine feste Haftung an der luminalen Oberfläche der EG, und (c) Seelenwanderung in der EG. Wichtig ist, dass jeder Schritt des Extravasation Kaskade von einer Teilmenge von c geregeltell typspezifischen und Spezies-spezifischen Molekülen. Allerdings sind die genauen molekularen Mechanismen, die Extravasation von spezifischen Zellpopulationen regulieren nicht gut verstanden, vor allem wegen der technischen Schwierigkeit, rekapituliert die Bedingungen in den Blutkreislauf. Die neuartige 3D hier beschriebene Gerät wurde entwickelt, um diese technischen Herausforderungen überwunden werden können und Experimente durchgeführt werden, die unser Verständnis der Biologie der Zelle Migration zu verbessern. Die Moleküle, die Zellwanderung zu vermitteln sind wichtige therapeutische Ziele. Ein detailliertes Verständnis der molekularen Ereignisse, die die Migration von spezifischen Zelltypen steuern wird bei der Identifizierung neuer Targets für die therapeutische Förderung oder Hemmung der Extravasation unterstützen. Zum Beispiel würde Eingriffe, die die Wanderung von therapeutischen Stammzellen (ob von Erwachsenen, Neugeborenen oder auch aus fetalem Gewebe abgeleitet) in Richtung Stelle einer Verletzung oder Degeneration Verbesserung von großem Nutzen bei der Geweberegeneration werden.Es besteht ein wachsendes Interesse in der in-vitro-Herstellung von therapeutischen Stammzellen, einschließlich Zellen aus pluripotenten Quellen abgeleitet und in ex vivo manipuliert adulten Stammzellen (erweitert, genetisch manipuliert und mit verschiedenen Enzymen vorbehandelt) 1. Es besteht daher ein Bedarf an neuen Technologien, um die Qualität der Stammzellen zu bewerten, bevor sie für therapeutische Zwecke verwendet werden. Unter anderen Parametern, müssen die Zellen in der Lage, effizient verlassen den Kreislauf, weil Behandlungen für multifokale Störungen können die intravenöse Verabreichung der Stammzellen 2 erfordern. Tatsächlich ist eine der aktuellen Herausforderungen in der Stammzellbiologie, die extrem niedrige Effizienz zu überwinden, mit denen Stammzellen beherbergt Websites von Gewebeschäden 3-6, Hervorhebung der Notwendigkeit, diese Lücke in unserem Verständnis von Stammzellen Migration anzugehen. Im Gegensatz dazu, dass Strategien Block Zellmigration durch Referenzieren auf bestimmte Moleküle wäre nützlich für die Behandlung von inentzündlichen und Autoimmunerkrankungen sowie metastasiertem Krebs. So, das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Zellen und EG während der Zell-Migration und Extravasation vermitteln ist relevant für translationale Medizin und Wirkstoffforschung sowie der Grundlagenforschung. Derzeit gibt es eine Reihe von Methoden zur Verfügung, um verschiedene Aspekte der Zellwanderung studieren. Allerdings haben diese Methoden Nachteile, die mit der neuen 3D-Gerät überwunden werden können. Tiermodelle: Tiermodelle, wie immungeschwächten Mäusen und genetisch manipulierte Mäuse, wurden nützliche Werkzeuge, um die Migration von menschlichen Zellen in vivo zu untersuchen. Jedoch ist ein erheblicher Nachteil für diese Modelle, daß menschliche Zellen schlecht Interaktion mit Adhäsionsmolekülen vorliegenden on mouse EC, teilweise aufgrund artspezifischen Sequenz Unterschiede in viele Moleküle der Zelloberfläche. Somit ist die Verwendung von Nagetieren studierenmenschlichen Zelle Migration unwahrscheinlich ist authentisch spiegeln die Ereignisse in der menschlichen Organ-spezifische Gefäßbetten. Darüber hinaus in vivo Modelle sind nicht geeignet für das Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffkandidaten. Die herkömmliche in vivo Modelle mit zu Zelle Homing studieren nicht zwischen den verschiedenen Stufen des Extravasation Kaskade unterscheiden, so dass es schwer zu identifizieren und gezielt neue Moleküle Homing. Die Intravitalmikroskopie Ansatz wurde entwickelt, um diesem Bedarf zu begegnen und wurde informativ, jedoch ist diese Technik sehr zeit-und arbeitsintensiv 7,8. Statische Seelenwanderung Assays: Transwell oder Boyden-Kammer-Assays Maßnahme Zellwanderung in einer porösen Membran und sind weit verbreitet in der Migrationsforschung verwendet. Der Test hat den Vorteil, dass es verwendet werden kann, um nicht nur Zellmigration und Zell-extrazelluläre Matrix (ECM)-Interaktionen zu untersuchen, sondern auch Chemokin-vermittelte Migration von Zellenin einer EG-Monoschicht auf der porösen Membranen entwickelt. Leider unterscheiden sich der Phänotyp und Funktion der EG unter statischen Bedingungen erheblich von denen unter physiologischen fließen 9,10. So müssen die chemotaktische Ereignisse, die in Transwell-Assays nicht auftreten getreu nachahmen, die Wechselwirkungen zwischen wandernden Zellen und EG unter Scherbeanspruchung. Darüber hinaus bedeutet die &quot;rollenden&quot; Schritt des Homing-Kaskade, die eine zusätzliche Dimension der Selektivität ergänzt die allgemeine Prozess, nicht in statischen Transwell-Assays auftreten. Während also diese Technologie nicht zulässt quantitative Auswertung von Chemokin-vermittelten Zell-Migration in der EG Monoschicht wird durch seine Unfähigkeit, die Scherspannung, die den Blutfluss in vivo nachahmt bereitzustellen begrenzt. Assays unter Schubspannung: Wandschubspannung ist bekannt, dass eine wichtige Rolle bei der Regulierung der EG-Funktion 9,10 spielen. Scherkräfte induzieren schnelle Aktivierung von Signalkaskaden, umschriftription Faktoren und differentiellen Genexpression in EG 11,12. Diese Information führte zu der Entwicklung der nächsten Generation von Adhäsionsassays - parallel laminare Strömung Kammern und Kapillaren - zu studieren und rollenden Adhäsion von Zellen an EG unter den Bedingungen der Schubspannung 7,13. Der limitierende Faktor für diese Tests ist, dass sie messen nur Rollen und Haftung, aber nicht zwischen einem haftenden Zelle, die fortfahren würde, transmigrate und einem Anhänger, die Zelle &quot;verhaftet&quot; auf dem EG Monoschicht und würde nicht transmigrate unterscheiden. Darüber hinaus können diese Tests nicht messen Migration von Zellen zu einer Chemokingradienten. Mehrere Berichte haben die Fähigkeit von anhaftenden Zellen zu unter einer EG Monoschicht auf Glasplättchen unter den Bedingungen der Strömung 14 gewachsen kriechen beschrieben. Die Grenzen dieser kriechen Technik sind: sie analysiert nur eine begrenzte Anzahl von Zellen, es ist nicht quantitativ, sondern analysiert Zelle kriechen auf der Matrix und CELl Oberfläche, aber nicht die Migration in Richtung eines chemotaktischen Gradienten, und es nicht zulassen, die transmigrierten Zellen isoliert werden. Obwohl dieser Test hat den Vorteil der Anwendung von Scherspannung auf den EG-Monoschicht, kann es nicht zu quantifizieren Migration von Zellen zu einer Chemokingradienten. Die neuartige 3D-Technologie hier beschriebenen überwindet viele dieser Mängel durch die Kombination von Querkraft (oberes Fach) mit einer statischen Chemokingradienten (untere Kammer) und erlaubt quantitative Auswertung von jedem Schritt der Extravasation Kaskade (Abbildung 1). Das Gerät kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Übersprechen zwischen der EG und der Mikroumgebung der Fähigkeit der EG Extravasation von zirkulierenden Zellen unterstützt beeinflusst werden. Das folgende Protokoll beschreibt den Schritt-für-Schritt-Methode für die Verwendung der 3D Fließkammer Gerät.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/MaterialPVC-Schlauch</td></tr> <tr><td>(Bohrung 1.42, Wand 0.8)</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>981.0142.000</td><td></td></tr><tr><td>3D-Kammer</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Gasaustauscheinheit</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCI-1005U</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Rind, Typ I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure 0,1M</td><td>VWR</td><td>BDH3200-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC- 2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)</td><td>Lonza</td><td>CC - 3124</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralisationslösung</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td>Lonza CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>R7D System</td><td>460-SD</td><td></td></tr><tr><td>Extracel Trial 2.5 Kit</td><td>Glycosam Byosystems</td><td>GS211</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin, Mensch, Natur</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Gehirns</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Endoteliales Zellmedium (ECM) für Gehirnzellen</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>StemCells Technologien</td><td>7050</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, 10 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>PHC3015</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1, Maus Anti-Human, CD106-FITC</td><td>Southern Bioteck</td><td>9519-02</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid-Färbelösung</td><td>BD Pharmingen</td><td># 556463</td><td></td></tr><tr><td>Gefrorenes menschliches Nabelschnurblut CD34+ Zellen</td><td>Stammzelle</td><td>CB007F</td><td></td></tr><tr><td>Gefrorenes menschliches Nabelschnurblut CD34+</td><td>Zellen Zenbio</td><td>SER - CD34-F</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>GFM3434</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Methylcellulose complete</td> media <td>R& D</td><td>HSC007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Von-Willibrand-Faktor-Antikörper</td><td>abcam</td><td>C# ab11713</td><td></td></tr><tr><td>Petryschale (35 x 10 mm)</td><td>VWR</td><td>CA25373-041</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>VWR Fisher</td><td>21008 - 918</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflaschen 75cm2</td><td>VWR</td><td>BD353136</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C-3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange, gebogen</td><td>VWR</td><td>82027-384</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>37001-530<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>403U/VM3</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel dreidimensionale-flow-kammer-geräte zu chemokine gerichtet extravasation von zirkulierenden zellen unter physiologischen bedingungen zu studieren durchfluss

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation von zirkulierenden Zellen aus dem Blut spielt eine zentrale Rolle in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich Stammzellen Homing und Metastasierung. Die dreidimensionale Fließkammer Gerät (im Folgenden die 3D-Gerät) ist eine neuartige Technologie, die in vitro physiologischer Scherspannung erschafft und ermöglicht jedem Schritt der Zelle Extravasation Kaskade quantifiziert werden. Die 3D-Gerät besteht aus einem oberen Abteil, in dem die interessierenden Zellen zirkulieren unter Scherbelastung und einer unteren Kammer des statischen Vertiefungen, die Lockstoffe von Interesse enthalten. Die beiden Kammern sind durch poröse Einsätze mit einer Monoschicht aus Endothelzellen (EC) beschichtet getrennt. Ein optionaler zweiter Einsatz mit microenvironmental Zellen von Interesse kann sofort unter der EC-Schicht platziert werden. Ein Gasaustausch Gerät ermöglicht die optimale CO 2 Spannung gehalten werden und bietet einen Zugangspunkt hinzuzufügen oder zu entziehen Zellen oder Verbindungen, die während derExperiment. Die Testzellen zirkulieren in der oberen Kammer an der gewünschten Scherbeanspruchung (Volumenstrom) durch eine peristaltische Pumpe gesteuert. Am Ende des Versuches werden die zirkulierende und migriert Zellen für weitere Analysen gesammelt. Die 3D-Gerät kann verwendet werden, um Zellrollen auf und Haftung der EG unter Scherbeanspruchung, Seelenwanderung in Reaktion auf Chemokin-Gradienten, Beständigkeit gegen Scherspannung, Cluster-Bildung und das Überleben der Zelle zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht das optionale zweite Einsatz die Auswirkungen von Übersprechen zwischen EG und microenvironmental Zellen untersucht werden. Die translationale Anwendungen der 3D-Gerät gehören Testen von Wirkstoffkandidaten, die auf die Zellwanderung und die Vorhersage der In-vivo-Verhalten von Zellen nach intravenöser Injektion. Somit ist die neue 3D-Gerät ein vielseitiges und preiswertes Tool, um die molekularen Mechanismen, die zellulären Extravasation vermitteln studieren.

Das murine Knochenmark-abgeleitete EC Linie STR-12 wurde auf Einsätze mit 5 um Poren gewachsen. Die Rate der EC Wachstum wurde unter einem Mikroskop beobachtet, und wenn die EC 100% konfluent waren, wurden die Einsätze in die Vertiefungen in der unteren Kammer des 3D-Gerät übertragen. Unmittelbar vor dem Aufstellen der Einsätze wurden die Vertiefungen von der unteren Kammer mit Kulturmedium allein (negative Kontrolle) oder mit Medium mit Stromazellen abgeleiteten Faktor-1 (, 5 ng / ml und 50 ng / ml SDF-1) ergänzt gefüllt. Danach wurde das 3D Gerät montiert und die Kammer wurde mit Medium gefüllt, wie in der beschriebenen Protokoll. Die Testzellen in der oberen Kammer der Vorrichtung zirkuliert wurden frisch murine Knochenmarkszellen (3,5 x 10 6 Zellen pro Kammer) geerntet. Eine definierte Scherspannung von 0,8 dyn / cm 2 wurde durch Einstellung der peristaltischen Pumpe Geschwindigkeit von 0,2 ml / min aufgetragen. Der gesamte Arbeitsbereich System wurde dann in der 5% CO 2-Inkubator bei 37 ° C und der ce platziertlls durften zirkulieren und mit dem EG-Monoschicht für 4 Stunden zu interagieren. Am Ende dieser Zeit wurden die zirkulierenden Zellen gesammelt, die Kammer abgebaut wurde, und die Einsätze entfernt wurden, wie in dem beschriebenen Protokoll. Die transmigrierten Zellen wurden aus den unteren Vertiefungen, gewaschen, in frischem Medium resuspendiert geerntet und in Methylcellulose Kulturen mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren für Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Test (3) ergänzt. Wie erwartet, fanden wir eine signifikant höhere Anzahl von CFC hatte in der EG Monoschicht in die Vertiefungen mit 50 ng / ml SDF-1 als Vertiefungen mit 5 ng / ml SDF-1 oder Medium allein migriert. Wie wir bereits beschrieben, sind keine der aktuellen In-vitro-Techniken zur Verfügung, um die Zellwanderung studieren kann die Prüfung der Wirkung der lokalen Mikroumgebung auf die Fähigkeit der EG Extravasation von wandernden Zellen unterstützt. Um zu veranschaulichen, wie das mit dem 3D-Vorrichtung erreicht werden kann, haben wiruntersucht Extravasation von zirkulierenden hämatopoetischen Zellen in einer Schicht aus EG und einer Schicht aus Stromazellen des Knochenmarks. Dazu wurde eine zweite (untere) einfügen, die eine Schicht aus Stromazellen der obere Einsatz mit der EC Monoschicht in der unteren Platte (4) nebeneinander angeordnet sind. Das Experiment wurde dann, wie oben beschrieben, und die transmigrierten Zellen wurden aus den Vertiefungen geerntet und gezählt. Die Ergebnisse zeigten, daß das Einsetzen einer zusätzlichen Schicht aus Stromazellen unter dem EC Monoschicht erhöhte signifikant die Migration von hämatopoetischen Zellen auf SDF-1 (Abbildung 4). Dieser Befund steht im Einklang mit der Vorstellung, dass die lokale Mikroumgebung auf die Rekrutierung von zirkulierenden Zellen des Gewebes beiträgt. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 1. Die 3D Fließkammer Gerät. A: Die hermetisch dichte 3D-Vorrichtung besteht aus zwei durch eine auswechselbare poröse Membran (PM) getrennt. EC auf der Membran, die dann eine Sperre zwischen der oberen und unteren Kammern gewachsen. Definierte Scherspannungen sind an der oberen Kammer des 3D-Gerät durch Perfusion Medien unter Verwendung einer konstanten Infusion Schlauchpumpe eingesetzt. Zirkulierenden Zellen sind entweder nicht-wechselwirkende (NIC), mit dem EG-transient interagieren (&#39;roll&#39;; RC), oder sich an der EG-(AC). Eine Subpopulation von anhaftenden Zellen transmigriert über die EC-Schicht an der unteren statischen Abteil des Gerätes (TM) B:. Eine Draufsicht Zeichnung (oberes Feld) des 3D-Gerät. Der horizontale Schnitt (unten) zeigt die Position der oberen Membran (rot), die untere Membran (grün) und den Boden des Bohrlochs (blau) C:. Die isometric Ansicht zeigt die Bestandteile des Gerätes: vier Schrauben, ein Acryl oberen Block, eine obere Kammer Dichtung, oberen und unteren Membranen unteren O-Ring und eine 3-well Acryl unteren Block D:. Ein Foto von der 3D-Strömung Kammer mit einer peristaltischen Pumpe und einem Gasaustausch verbunden. Das System befindet sich in einem sterilen Abzug zusammengebaut und dann zu einem Zellkulturbrutschrank übertragen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine schematische Darstellung des 3D-Gerätesystem. Die Zeichnung zeigt die drei Anschläge erforderlich, um das System zu montieren. Das Kulturmedium wird in vom Einlass durch den Unterdruck durch die peristaltische Pumpe erzeugt wird gezeichnet. Die Strömung des Mediums wird durch Stop # 1 geschlossen, damit die Einsätze in das Gerät gestellt werden. Nachdem die Kammer geschlossen ist, ist die Pumpe SchaltCHED wieder und die Kammer unmittelbar mit Medium zu verhindern, Trocknen der Zellen, die auf den Einsätzen gewachsen gefüllt. Stop # 2 ermöglicht mittel-bis in den Gasaustausch Einheit platziert werden. Stop # 3 wird der Durchfluss für die Verbindung von dem Einlass und Auslass gestoppt werden. Die Strömung kann im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn gerichtet werden, um Luftblasen durch den Gasaustausch beim Ausbauen über einen Schalter an der Pumpe. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die 3D-Gerät unterstützt SDF-1-vermittelte Transmigration von hämatopoetischen Vorläuferzellen unter Bedingungen der physiologischen Schubspannung. A: Drei Geräte (mit jeweils 3 Brunnen in der unteren Kammer) wurden montiert und parallel laufen. Medium allein oder Medium, das SDF-1 in 5 oder 50 ng / ml in die untere Kammer Vertiefungen gegeben. Murine bone Knochenmarkzellen durften in den Geräten für 4 Stunden zirkulieren. Danach wurde jede Vorrichtung zerlegt und die Zellen, die auf SDF-1 (gelb) transmigrierten hatten, wurden von den unteren Vertiefungen gesammelt, gezählt und kultiviert in Methylcellulose mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren (GF) ergänzt. Vierzehn Tage später wurden die Kolonien unter dem Mikroskop hat B:. Die Zahl der Vorläuferzellen (Kolonie-bildende Zellen, CFC) aus den unteren Kammern gewonnen wird als Mittelwert ± SD von drei Vertiefungen pro Zustand dargestellt. * P &lt;0,05. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> Abbildung 4. Der Effekt der Mikroumgebung zu Wechselwirkungen zwischen hämatopoetischen Zellen und Endothelzellen. A: Die Abbildung zeigt die Position eines zweiten porösen Membran mit kultivierten stRomals Fibroblasten (SF) unter der oberen Membran mit EC. . Weitere Abkürzungen sind wie für 1A B beschrieben. Die zusätzliche Membran (untere Einsatz) mit kultivierten SF wurde unter der oberen Membran eingefügt C: drei Geräte (mit je 3 Vertiefungen) parallel laufen gelassen wurden. Medium allein oder Medium, das SDF-1 bei 50 ng / ml SDF-1 in die untere Kammer Vertiefungen gegeben. Die negative Kontrolle Kammern weggelassen SC, SDF-1, oder beides. Knochenmarkszellen wurden für 4 Stunden bei 37 ° C zirkulieren Danach wurde jede Vorrichtung zerlegt und die transmigrierten Zellen wurden aus der unteren Kammer Vertiefungen gesammelt und gezählt. Die Anzahl der transmigrierten Zellen gewonnen wird als Mittelwert ± SD von drei Vertiefungen pro Zustand dargestellt. * P &lt;0,05.

Die dreidimensionale Strömungskammer Vorrichtung ist eine neuartige<em&gt; In vitro</em&gt; Technologie für die quantitative und stufenweise Auswertung der Extravasation Kaskade von zirkulierenden Zellen unter Bedingungen physiologischer Scherspannung. Das Gerät füllt daher eine kritische Notwendigkeit für grundlegende, präklinischen und klinischen Studien der Zellwanderung.

A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wanderung zirkulierender Zellen entlang eines Chemokin-Gradienten quantitativ zu messen. Unter Bedingungen physiologischer Scherkräfte wird dies erreicht, indem zunächst eine Endothelzell-Monolayer auf kollagenbeschichteten mikroporösen Inserten kultiviert und anschließend in eine Durchflusskammer eingebaut wird, wodurch ein separater statischer Kompartiment, der Chemokine enthält, abgedeckt wird. Anschließend werden Scherkräfte auf die Zellen ausgeübt, um die physiologischen Bedingungen in der Gefäßwand nachzuahmen.Im zweiten Schritt werden Testzellen wie Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen in der 3D-Anlage während der Zirkulation zugeführt. Die Inhalte im statischen Kompartiment beeinflussen die Effizienz der Interaktionen zwischen zirkulierenden Zellen und endothelialen Zellen sowie anschließend die Rate der Transmigration der Testzellen durch die endotheliale Schicht. Danach wird das 3D-System zerlegt, und die transmigrierten Testzellen werden aus dem unteren statischen Kompartiment gesammelt, um mithilfe verschiedener modernster Methoden die Zellmigration quantitativ zu messen. So erhält man Ergebnisse, die die Fähigkeit zirkulierender Testzellen zeigen, unter Bedingungen physiologischer Strömung mit endothelialen Zellen zu interagieren und die Zirkulation basierend auf der Konzentration von Chemokinen im statischen Kompartiment zu verlassen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von parallelen Lamina-Flusskammern und statischen Transferversuchen besteht darin, dass sie sowohl Scherstress im oberen Kompartiment als auch ein Chemotaxin im unteren statischen Kompartiment kombiniert. Dadurch können Forscher die Rekrutierung zirkulierender Zellen entlang des Chemotaxin-Gradienten unter physiologischen Flussbedingungen quantitativ messen. Diese Methode kann außerdem verwendet werden, um den Einfluss einer Wechselwirkung zwischen den Zellen der lokalen Mikroumgebung und endothelialen Zellen auf die Extravasation zirkulierender Zellen zu untersuchen.Indem eine zusätzliche Zellschicht auf einem separaten Insert unterhalb der endothelialen Zellen hinzugefügt wird, demonstriert der Ablauf Valentina gegen Rova, eine Technikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie damit, die Anzahl der für das Experiment benötigten Inserts zu berechnen, und platzieren Sie jedes Insert in einer separaten sterilen Petrischale. Sterilisieren Sie sie durch Gamma-Bestrahlung, bis die Gesamtdosis je nach individueller Einrichtung 11 Gray erreicht.Anschließend verdünnen Sie die Stammlösung des Kollagens. Art-eine Lösung auf 50 Mikrogramm pro Milliliter mit 0,01-molarer Salzsäure, die bei vier Grad Celsius gelagert wird, und bereiten Sie Aliquote der Endlösung von jeweils 154 Mikroliter für jeden Insert vor. Geben Sie danach mehrere Tropfen aus einem Eloqua in kreisförmigem Muster auf die Oberfläche des Inserts.Gegeben Sie anschließend den Rest der Aliquot auf die Insert-Oberfläche, um einen großen Tropfen zu bilden. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze den Insert zu keinem Zeitpunkt berührt, und dass das Kollagen die gesamte Oberfläche des Inserts bedeckt, ohne abzulaufen. Sobald der Insert bedeckt ist, setzen Sie den Deckel auf die Petrischale und stellen Sie diese vorsichtig auf eine ebene Fläche.Inkubieren Sie die Inserts eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach pipettieren Sie die Kollagenlösung ab und waschen die Membran mit 160 Mikrolitern PBS. Anschließend entfernen Sie den PBS. Setzen Sie den Deckel wieder auf und umwickeln Sie die Schale mit Parafilm.Wenn die Inserts am selben Tag verwendet werden, stellen Sie die Petrischale an einen trockenen Ort bei Raumtemperatur. Andernfalls stellen Sie die Schale bei vier Grad Celsius und verwenden Sie das Insert innerhalb von sieben Tagen. Gewinnen Sie kultivierte humane Nabelvenenendothelzellen unmittelbar vor der Verwendung und resuspendieren Sie sie in dem gewünschten Kulturmedium mit 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter.Beim Zählen der Zellen sicherstellen, dass die Zellviabilität mittels Trypanblau über 98 % liegt, anschließend 160 Mikroliter der Zellsuspension auf jeden Insert geben. Dazu zunächst mehrere kleine Tropfen in einem Kreis auf die Oberfläche des mit Kollagen beschichteten Inserts geben und dann vorsichtig den Rest der Zellsuspension hinzufügen, um einen großen Tropfen zu bilden. Nach Abschluss den Deckel wieder aufsetzen und die Schalen vorsichtig in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius stellen und 30 Minuten inkubieren, damit sich die Zellen an der Membran anheften können.Nach 30 Minuten die Platten aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig fünf Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium über jeden Insert geben. Dabei darauf achten, dass der Insert auf dem Boden der Schale bleibt und vollständig vom Medium bedeckt ist. Anschließend die Deckel wieder aufsetzen und die Schalen vorsichtig in den Inkubator zurückstellen.Die Zellen bei 37 Grad Celsius über Nacht. Um die Durchflusskammer zusammenzubauen, zuerst die oberen und unteren Platten zusammenschrauben. Anschließend die Platten mit der Gasaustauscheinheit über 1,42 Millimeter Innendurchmesser umfassende PVC-Schläuche mit 0,8 Millimeter dicken Wänden verbinden.Als Nächstes das zusammengebaute Gerät in einen sauberen Plastikbeutel geben und durch Gamma-Bestrahlung sterilisieren, bis die Gesamtdosis 11 Gray erreicht. Im nächsten Schritt ein Inkubatortablett entnehmen, es in eine sterile Zellkulturbank bringen und mit 70 %igem Ethanol sterilisieren. Anschließend das Tablett mit einem großen sterilen Tuch abdecken.Entfernen Sie anschließend das Gerät aus der Plastiktüte und stellen Sie es auf das sterile Inkubatortablett. Schließen Sie dann das Gerät an die peristaltische Pumpe an und programmieren Sie die Pumpe so, dass sie mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Millilitern pro Minute läuft. Pipettieren Sie fünf bis sieben Milliliter des gewünschten Kulturmediums in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen, das als Zulauf verwendet wird.Trennen Sie dann den Zulaufschlauch vom Auslass, indem Sie die Metallnadel mit kleinen sterilen Tüchern aus dem Schlauch ziehen, um die Sterilität des Schlauchs aufrechtzuerhalten. Stecken Sie die metallene Zulaufnadel in das 15-Milliliter-Röhrchen mit dem Medium und platzieren Sie den Auslassschlauch in das leere 15-Milliliter-Röhrchen. Schalten Sie anschließend die Pumpe ein, sodass die Strömung im Gegenuhrzeigersinn verläuft. Lassen Sie den Unterdruck das Medium aus dem 15-Milliliter-Zulaufröhrchen in den Schlauch ziehen und stoppen Sie die Pumpe, sobald das Medium das Ende des Schlauchs erreicht, kurz bevor es in das Gerät eintritt.Öffnen Sie dann das Gerät, indem Sie die Röhrchenplatten abschrauben, und entfernen Sie vorsichtig die obere Platte. Pipettieren Sie 1500 bis 1.550 Mikroliter Medium in die unteren Vertiefungen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Vertiefungen ausreichend Medium enthalten, um eine Halbkugel zu bilden, die ein bis zwei Millimeter über die untere Platte hinausragt. Überführen Sie anschließend die vorbereiteten Inserts aus den Petrischalen in die Vertiefungen der unteren Platte. Mit einer sterilen Pinzette sicherstellen, dass sich keine Blasen unter den Inserts befinden, und jegliches auf der Oberfläche der unteren Platte sichtbares Medium abpipettieren.Danach die obere Platte wieder auf die untere Platte setzen und sie erneut miteinander verbinden. Mithilfe der Schrauben sofort die peristaltische Pumpe einschalten und das Medium durch die 3D-Vorrichtung fließen lassen. Das Auslassende der Vorrichtung anheben und die Kammer in dieser Position halten, um die Bildung von Blasen im Zwischenraum zwischen den Platten zu verhindern.Füllen Sie weiterhin das Schlauchsystem, das die Kammer mit der Gasaustauscheinheit verbindet, mit Medium, bis dieses die Gasaustauscheinheit erreicht. Geben Sie anschließend drei Milliliter Medium in die Gasaustauscheinheit. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Luftblasen durch diese entweichen.Heben Sie die Einheit an, damit das Medium den austretenden Schlauch füllen kann, und stoppen Sie die Pumpe, wenn sich das Medium zwei bis drei Zentimeter vor dem Ende befindet. Sobald die Einheit vollständig geprimt ist, verbinden Sie die Einlassnadel unter Verwendung kleiner steriler Tücher mit dem Auslassschlauch. Drehen Sie anschließend die Pumpenrichtung um, sodass das Medium im Uhrzeigersinn zur Gasaustauscheinheit fließt, und stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Luftblasen entfernt werden.Bei erneut im Gegenuhrzeigersinn fließender Pumpe 100 Mikroliter der Testzellensuspension der Gasaustauscheinheit hinzufügen. Anschließend den Deckel des Respirators schließen.Stellen Sie das Tablett zurück in den Inkubator und lassen Sie die Testzellen bei 37 Grad Celsius in der Vorrichtung zirkulieren. Sobald die gewünschte Zeit verstrichen ist, nehmen Sie das Tablett mit dem funktionierenden System aus dem Inkubator und stellen es in die Sicherheitswerkbank. Stoppen Sie die Pumpe, trennen Sie den Einlass und Auslass und legen Sie die Enden in leere sterile 15-Milliliter-Röhrchen.Schalten Sie dann die Pumpe ein und sammeln Sie die Zellsuspension aus dem System. Stellen Sie die Zellsuspension bis zur Verwendung auf Eis. Ziehen Sie anschließend die Schrauben ab und nehmen Sie die obere Platte ab, um die Kammer zu zerlegen.Entfernen Sie die Inserts aus der unteren Platte und überführen Sie sie in Petrischalen zur Färbung oder Zellensammlung. Entfernen Sie abschließend die Zellsuspension aus den unteren Vertiefungen und geben Sie sie in 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit jeweils 1,5 Milliliter Medium und geben Sie die Spüllösung zu dem entsprechenden Röhrchen hinzu.Anschließend die Röhrchen fünf Minuten bei 200 G zentrifugieren und die Zellen gemäß den spezifischen experimentellen Zielen weiterverarbeiten, wie sie im beigefügten Textprotokoll aufgeführt sind. Hier ist ein Beispiel für einen der vielen Tests, die mit diesem System durchgeführt werden können. Der Aufbau besteht aus spiegelbildlich angeordneten, aus Knochenmark stammenden endothelialen Zellen, die auf Inserten mit fünf Mikrometer großen Poren kultiviert werden; unterhalb der Inserten wurde das aus stromalen Zellen stammende Faktor-eins (SDF-1) in Konzentrationen von 0,5 oder 50 Nanogramm pro Milliliter zugegeben.Es wurde zugelassen, dass Knochenmarkzellen im 3D-System zirkulierten. Die Zellen, die durch den Insert migrierten, wurden gesammelt und anschließend auf Platten mit Methylcellulose-Medien kultiviert. In Gegenwart hämatopoetischer Wachstumsfaktoren, die verursachen, dass Vorläuferzellen Kolonien bilden, wurde die Anzahl der Kolonien 14 Tage später ausgewertet, um die Anzahl der Vorläuferzellen in jedem Well zu bestimmen und ihre Fähigkeit zur Migration in Richtung sdf aufzuzeigen.Eine unter physiologischen Flussbedingungen. Durch die Zugabe von auf dem unteren Insert im statischen Kammerabschnitt kultivierten stromalen Fibroblasten wanderten mehr hämatopoetische Zellen aus der Zirkulation in die Kammer, nachdem SDF-1 in einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter zugegeben worden war, im Vergleich zur alleinigen Zugabe von SDF-1. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in verschiedenen Bereichen der medizinischen und biologischen Wissenschaften den Weg, gewebespezifische Gefäßbetten in vitro zu modellieren und zelluläre sowie molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die Migration zirkulierender Zellen in Richtung gesunder Gewebe im Vergleich zu erkranktem Gewebe vermitteln.

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen "Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

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Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

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Zellmigration ist ein wichtiger Teil der menschlichen Entwicklung und des Lebens. Um die Mechanismen zu verstehen, die die Zellmigration verändern können, stellen wir ein planares Gradientendiffusionssystem zur Untersuchung der Chemotaxis in einer 3D-Kollagenmatrix vor, das es ermöglicht, die Einschränkungen moderner Diffusionskammern bestehender Assays zu überwinden.

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Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

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Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.

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A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss (Video) | JoVE Journal

A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

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