A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wanderung zirkulierender Zellen entlang eines Chemokin-Gradienten quantitativ zu messen. Unter Bedingungen physiologischer Scherkräfte wird dies erreicht, indem zunächst eine Endothelzell-Monolayer auf kollagenbeschichteten mikroporösen Inserten kultiviert und anschließend in eine Durchflusskammer eingebaut wird, wodurch ein separater statischer Kompartiment, der Chemokine enthält, abgedeckt wird. Anschließend werden Scherkräfte auf die Zellen ausgeübt, um die physiologischen Bedingungen in der Gefäßwand nachzuahmen.

Im zweiten Schritt werden Testzellen wie Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen in der 3D-Anlage während der Zirkulation zugeführt. Die Inhalte im statischen Kompartiment beeinflussen die Effizienz der Interaktionen zwischen zirkulierenden Zellen und endothelialen Zellen sowie anschließend die Rate der Transmigration der Testzellen durch die endotheliale Schicht. Danach wird das 3D-System zerlegt, und die transmigrierten Testzellen werden aus dem unteren statischen Kompartiment gesammelt, um mithilfe verschiedener modernster Methoden die Zellmigration quantitativ zu messen. So erhält man Ergebnisse, die die Fähigkeit zirkulierender Testzellen zeigen, unter Bedingungen physiologischer Strömung mit endothelialen Zellen zu interagieren und die Zirkulation basierend auf der Konzentration von Chemokinen im statischen Kompartiment zu verlassen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von parallelen Lamina-Flusskammern und statischen Transferversuchen besteht darin, dass sie sowohl Scherstress im oberen Kompartiment als auch ein Chemotaxin im unteren statischen Kompartiment kombiniert. Dadurch können Forscher die Rekrutierung zirkulierender Zellen entlang des Chemotaxin-Gradienten unter physiologischen Flussbedingungen quantitativ messen. Diese Methode kann außerdem verwendet werden, um den Einfluss einer Wechselwirkung zwischen den Zellen der lokalen Mikroumgebung und endothelialen Zellen auf die Extravasation zirkulierender Zellen zu untersuchen.

Indem eine zusätzliche Zellschicht auf einem separaten Insert unterhalb der endothelialen Zellen hinzugefügt wird, demonstriert der Ablauf Valentina gegen Rova, eine Technikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie damit, die Anzahl der für das Experiment benötigten Inserts zu berechnen, und platzieren Sie jedes Insert in einer separaten sterilen Petrischale. Sterilisieren Sie sie durch Gamma-Bestrahlung, bis die Gesamtdosis je nach individueller Einrichtung 11 Gray erreicht.

Anschließend verdünnen Sie die Stammlösung des Kollagens. Art-eine Lösung auf 50 Mikrogramm pro Milliliter mit 0,01-molarer Salzsäure, die bei vier Grad Celsius gelagert wird, und bereiten Sie Aliquote der Endlösung von jeweils 154 Mikroliter für jeden Insert vor. Geben Sie danach mehrere Tropfen aus einem Eloqua in kreisförmigem Muster auf die Oberfläche des Inserts.

Gegeben Sie anschließend den Rest der Aliquot auf die Insert-Oberfläche, um einen großen Tropfen zu bilden. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze den Insert zu keinem Zeitpunkt berührt, und dass das Kollagen die gesamte Oberfläche des Inserts bedeckt, ohne abzulaufen. Sobald der Insert bedeckt ist, setzen Sie den Deckel auf die Petrischale und stellen Sie diese vorsichtig auf eine ebene Fläche.

Inkubieren Sie die Inserts eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach pipettieren Sie die Kollagenlösung ab und waschen die Membran mit 160 Mikrolitern PBS. Anschließend entfernen Sie den PBS. Setzen Sie den Deckel wieder auf und umwickeln Sie die Schale mit Parafilm.

Wenn die Inserts am selben Tag verwendet werden, stellen Sie die Petrischale an einen trockenen Ort bei Raumtemperatur. Andernfalls stellen Sie die Schale bei vier Grad Celsius und verwenden Sie das Insert innerhalb von sieben Tagen. Gewinnen Sie kultivierte humane Nabelvenenendothelzellen unmittelbar vor der Verwendung und resuspendieren Sie sie in dem gewünschten Kulturmedium mit 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter.

Beim Zählen der Zellen sicherstellen, dass die Zellviabilität mittels Trypanblau über 98 % liegt, anschließend 160 Mikroliter der Zellsuspension auf jeden Insert geben. Dazu zunächst mehrere kleine Tropfen in einem Kreis auf die Oberfläche des mit Kollagen beschichteten Inserts geben und dann vorsichtig den Rest der Zellsuspension hinzufügen, um einen großen Tropfen zu bilden. Nach Abschluss den Deckel wieder aufsetzen und die Schalen vorsichtig in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius stellen und 30 Minuten inkubieren, damit sich die Zellen an der Membran anheften können.

Nach 30 Minuten die Platten aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig fünf Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium über jeden Insert geben. Dabei darauf achten, dass der Insert auf dem Boden der Schale bleibt und vollständig vom Medium bedeckt ist. Anschließend die Deckel wieder aufsetzen und die Schalen vorsichtig in den Inkubator zurückstellen.

Die Zellen bei 37 Grad Celsius über Nacht. Um die Durchflusskammer zusammenzubauen, zuerst die oberen und unteren Platten zusammenschrauben. Anschließend die Platten mit der Gasaustauscheinheit über 1,42 Millimeter Innendurchmesser umfassende PVC-Schläuche mit 0,8 Millimeter dicken Wänden verbinden.

Als Nächstes das zusammengebaute Gerät in einen sauberen Plastikbeutel geben und durch Gamma-Bestrahlung sterilisieren, bis die Gesamtdosis 11 Gray erreicht. Im nächsten Schritt ein Inkubatortablett entnehmen, es in eine sterile Zellkulturbank bringen und mit 70 %igem Ethanol sterilisieren. Anschließend das Tablett mit einem großen sterilen Tuch abdecken.

Entfernen Sie anschließend das Gerät aus der Plastiktüte und stellen Sie es auf das sterile Inkubatortablett. Schließen Sie dann das Gerät an die peristaltische Pumpe an und programmieren Sie die Pumpe so, dass sie mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Millilitern pro Minute läuft. Pipettieren Sie fünf bis sieben Milliliter des gewünschten Kulturmediums in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen, das als Zulauf verwendet wird.

Trennen Sie dann den Zulaufschlauch vom Auslass, indem Sie die Metallnadel mit kleinen sterilen Tüchern aus dem Schlauch ziehen, um die Sterilität des Schlauchs aufrechtzuerhalten. Stecken Sie die metallene Zulaufnadel in das 15-Milliliter-Röhrchen mit dem Medium und platzieren Sie den Auslassschlauch in das leere 15-Milliliter-Röhrchen. Schalten Sie anschließend die Pumpe ein, sodass die Strömung im Gegenuhrzeigersinn verläuft. Lassen Sie den Unterdruck das Medium aus dem 15-Milliliter-Zulaufröhrchen in den Schlauch ziehen und stoppen Sie die Pumpe, sobald das Medium das Ende des Schlauchs erreicht, kurz bevor es in das Gerät eintritt.

Öffnen Sie dann das Gerät, indem Sie die Röhrchenplatten abschrauben, und entfernen Sie vorsichtig die obere Platte. Pipettieren Sie 1500 bis 1.550 Mikroliter Medium in die unteren Vertiefungen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Vertiefungen ausreichend Medium enthalten, um eine Halbkugel zu bilden, die ein bis zwei Millimeter über die untere Platte hinausragt. Überführen Sie anschließend die vorbereiteten Inserts aus den Petrischalen in die Vertiefungen der unteren Platte. Mit einer sterilen Pinzette sicherstellen, dass sich keine Blasen unter den Inserts befinden, und jegliches auf der Oberfläche der unteren Platte sichtbares Medium abpipettieren.

Danach die obere Platte wieder auf die untere Platte setzen und sie erneut miteinander verbinden. Mithilfe der Schrauben sofort die peristaltische Pumpe einschalten und das Medium durch die 3D-Vorrichtung fließen lassen. Das Auslassende der Vorrichtung anheben und die Kammer in dieser Position halten, um die Bildung von Blasen im Zwischenraum zwischen den Platten zu verhindern.

Füllen Sie weiterhin das Schlauchsystem, das die Kammer mit der Gasaustauscheinheit verbindet, mit Medium, bis dieses die Gasaustauscheinheit erreicht. Geben Sie anschließend drei Milliliter Medium in die Gasaustauscheinheit. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Luftblasen durch diese entweichen.

Heben Sie die Einheit an, damit das Medium den austretenden Schlauch füllen kann, und stoppen Sie die Pumpe, wenn sich das Medium zwei bis drei Zentimeter vor dem Ende befindet. Sobald die Einheit vollständig geprimt ist, verbinden Sie die Einlassnadel unter Verwendung kleiner steriler Tücher mit dem Auslassschlauch. Drehen Sie anschließend die Pumpenrichtung um, sodass das Medium im Uhrzeigersinn zur Gasaustauscheinheit fließt, und stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Luftblasen entfernt werden.

Bei erneut im Gegenuhrzeigersinn fließender Pumpe 100 Mikroliter der Testzellensuspension der Gasaustauscheinheit hinzufügen. Anschließend den Deckel des Respirators schließen.

Stellen Sie das Tablett zurück in den Inkubator und lassen Sie die Testzellen bei 37 Grad Celsius in der Vorrichtung zirkulieren. Sobald die gewünschte Zeit verstrichen ist, nehmen Sie das Tablett mit dem funktionierenden System aus dem Inkubator und stellen es in die Sicherheitswerkbank. Stoppen Sie die Pumpe, trennen Sie den Einlass und Auslass und legen Sie die Enden in leere sterile 15-Milliliter-Röhrchen.

Schalten Sie dann die Pumpe ein und sammeln Sie die Zellsuspension aus dem System. Stellen Sie die Zellsuspension bis zur Verwendung auf Eis. Ziehen Sie anschließend die Schrauben ab und nehmen Sie die obere Platte ab, um die Kammer zu zerlegen.

Entfernen Sie die Inserts aus der unteren Platte und überführen Sie sie in Petrischalen zur Färbung oder Zellensammlung. Entfernen Sie abschließend die Zellsuspension aus den unteren Vertiefungen und geben Sie sie in 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit jeweils 1,5 Milliliter Medium und geben Sie die Spüllösung zu dem entsprechenden Röhrchen hinzu.

Anschließend die Röhrchen fünf Minuten bei 200 G zentrifugieren und die Zellen gemäß den spezifischen experimentellen Zielen weiterverarbeiten, wie sie im beigefügten Textprotokoll aufgeführt sind. Hier ist ein Beispiel für einen der vielen Tests, die mit diesem System durchgeführt werden können. Der Aufbau besteht aus spiegelbildlich angeordneten, aus Knochenmark stammenden endothelialen Zellen, die auf Inserten mit fünf Mikrometer großen Poren kultiviert werden; unterhalb der Inserten wurde das aus stromalen Zellen stammende Faktor-eins (SDF-1) in Konzentrationen von 0,5 oder 50 Nanogramm pro Milliliter zugegeben.

Es wurde zugelassen, dass Knochenmarkzellen im 3D-System zirkulierten. Die Zellen, die durch den Insert migrierten, wurden gesammelt und anschließend auf Platten mit Methylcellulose-Medien kultiviert. In Gegenwart hämatopoetischer Wachstumsfaktoren, die verursachen, dass Vorläuferzellen Kolonien bilden, wurde die Anzahl der Kolonien 14 Tage später ausgewertet, um die Anzahl der Vorläuferzellen in jedem Well zu bestimmen und ihre Fähigkeit zur Migration in Richtung sdf aufzuzeigen.

Eine unter physiologischen Flussbedingungen. Durch die Zugabe von auf dem unteren Insert im statischen Kammerabschnitt kultivierten stromalen Fibroblasten wanderten mehr hämatopoetische Zellen aus der Zirkulation in die Kammer, nachdem SDF-1 in einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter zugegeben worden war, im Vergleich zur alleinigen Zugabe von SDF-1. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in verschiedenen Bereichen der medizinischen und biologischen Wissenschaften den Weg, gewebespezifische Gefäßbetten in vitro zu modellieren und zelluläre sowie molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die Migration zirkulierender Zellen in Richtung gesunder Gewebe im Vergleich zu erkranktem Gewebe vermitteln.