Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten
1. April 2014
Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lipidtröpfchen aus dem Gewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Plazentagewebe präpariert und getrennt wird. Als nächstes werden die Zellen des Oleins homogenisiert.
Anschließend werden die Organellen durch mehrere Zentrifugationsschritte getrennt. Schließlich wird die Schwimmschicht, die die Lipidtröpfchen enthält, gesammelt und die Lipidtropfen charakterisiert. Letztendlich werden die Fluoreszenzmikroskopie und die westliche Blutanalyse verwendet, um die Reinheit der Lipidtröpfchenfraktion nachzuweisen.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, Lipidtröpfchen aus den meisten Aortenzellen zu isolieren. Beachten Sie, dass in bestimmten Geweben die Anzahl der Tröpfchen unter der Anzahl der Tröpfchen liegen kann, die die schwimmende G-Schicht und die Anzahl der Tröpfchen reduziert. Plazenta wurden von gesunden Frauen mit Einlingsschwangerschaften entnommen, die sich vor dem Einsetzen der spontanen Wehen einem elektiven Kaiserschnitt unterzogen hatten, als die Probanden eine schriftliche Einverständniserklärung für die Entnahme ihrer Plazenta gaben.
Die Entnahme und anschließende Verwendung der Plazenta wurde mit Genehmigung der University of Tennessee und der University of Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville durchgeführt. Institutionelle Prüfstelle in der biologischen Sicherheitshaube, die Plazenta in ein steriles autoklavierbares Gefäß umfüllen und mit steriler Kochsalzlösung vorsichtig Blut von Plazenta und Membranen waschen. Entsorgen Sie die blutige Kochsalzlösung in einem Ein-Liter-Becherglas als flüssigen biologischen Abfall.
Legen Sie die Plazenta mit dieser glatten Oberfläche auf ein steriles Feld, wobei die Nabelschnur mit einer scharfen, feinen Schere und Pinzette nach oben zeigt. Entfernen Sie die Nabelschnur und die fetalen Membranen. Drehen Sie dann die Plazenta um, so dass die mütterliche Oberfläche nach oben zeigt.
Anschließend wird das darüber liegende Basalplattengewebe etwa drei Millimeter von der Oberfläche entfernt. Präparieren Sie jeweils ein COTA-Leadin, vermeiden Sie die Chorionplatte und sammeln Sie das Zottengewebe in einem 250-Milliliter-Becherglas mit Kochsalzlösung. Verwenden Sie dann 0,9% sterile Kochsalzlösung und Pinzette, um das Gewebe mehrmals in einem separaten Becherglas zu spülen, indem Sie es mit dem Ein-Liter-Becherglas für flüssige Abfälle schwenken.
Übertragen Sie jeweils ein Codi-Leadin in eine 150-Millimeter-Petrischale. Halten Sie es mit einer Pinzette fest und kratzen Sie mit einer Rasierklinge das Gewebe von den Gefäßen auf eine Petrischale. Legen Sie das abgeschabte Gewebe in ein separates Becherglas mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung.
Wiederholen Sie dies für alle Taschentuchstücke. Nachdem Sie das abgeschabte Gewebe in der Zelldissoziation cve gespült haben, lassen Sie es von überschüssiger Flüssigkeit und Gewicht ab, um das Plazentagewebe zu verdauen. Nach der Herstellung der Gewebeverdauungsmischung wird das Gewebe geteilt, indem 60 Gramm des insgesamt gesammelten Gewebes in einen sterilen 500-Milliliter-Helen-Meyer-Kolben überführt werden.
Die Gewebeverdauungsmischung in den Kolben mit dem Gewebe geben und 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Shaker inkubieren. Bei 150 U/min, um die dissoziierten Zellen nach der Inkubation zu sammeln und den Kolben zu kippen, damit sich das Gewebe absetzen kann. Sammle das Super-Natin.
Achten Sie darauf, kein UND-dissoziiertes Gewebe zu sammeln. Geben Sie eine gleiche Menge HBSS in den Überstand, bevor Sie ihn in sterile 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Wiederholen Sie die Dissoziations- und Überstandsentnahme mit den verbleibenden Teilen des UND-assoziierten Gewebes für jede Charge nach der Zentrifugation 1000-mal.
15 Minuten lang bei vier Grad Celsius Schwerkraft den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören. Die Plazenzottenzottenzellen befinden sich überwiegend im weißen Teil des Pellets, der über den roten Blutkörperchen liegt. Übertragen Sie die Zottenzellen im weißen Teil des Pellets in ein steriles konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.
Nachdem Sie die Zellen aus allen drei Verdauungsstufen gesammelt haben, verwenden Sie ein 100-Mikron-Nylon-Zellsieb, das in ein steriles konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen eingesetzt wird, um die Suspension zu filtrieren. Wenn sich die Filtration der Zellensuspension verlangsamt, heben Sie den Filter nach oben, um in der Röhrchenzentrifuge 10 Minuten lang ein Vakuum bei vier Grad Celsius und 1000-facher Schwerkraft zu erzeugen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, um Plazenzottenzottenzellen mit frisch zubereitetem hypotonischem Lysemedium oder HLM in einer biologischen Sicherheitshaube zu homogenisieren, und geben Sie das vierfache Zellpelletvolumen von eiskaltem HLM zu den Zellen.
Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Reanimation sanft und gründlich durchzuführen. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis inkubiert haben, geben Sie sie in einen eiskalten Homogenisator und homogenisieren Sie die Zellen langsam mit dem locker sitzenden Stößel mit 20 bis 25 sanften Strichen.
Schleudern Sie das Lysat 10 Minuten lang bei 3000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius, um ununterbrochene Zellen zu entfernen. Dann sammelt man den Überstand in einem neuen Röhrchen, bevor er sich 20 Minuten lang bei der 25.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius erneut dreht. Um die Mitochondrien zu entfernen, um die Lipidtröpfchen durch Ultrazentrifugation zu isolieren, sammeln Sie das Super Natin in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Auf 20 % Saccharose einstellen und in den Boden eines Ultrazentrifugenröhrchens für einen S SW 28-Rotor oder einen gleichwertigen Rotor übertragen, das an die Dichte angepasste Super Natin mit etwa 10 Millilitern eiskaltem, 100 millimolarem Natriumcarbonatpuffer und 0,5 bis einem Milliliter eiskaltem HLM überlagern, um das Röhrchen mit einer Schwenkrotorzentrifuge S SW 28 bei 130 zu füllen. 000-fache Schwerkraft und vier Grad Celsius für 45 Minuten. Sammeln Sie dann die Schwimmschicht, stellen Sie sie auf 10 % Saccharose ein und übertragen Sie sie auf den Boden eines 13,2-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchens für einen SW 41 TI-Rotor oder ein gleichwertiges Röhrchen. Überlagern Sie den dichteeingestellten Überstand mit etwa fünf Millilitern eiskaltem, 100 millimolarem Natriumcarbonatpuffer und 0,5 Millilitern eiskaltem HLM nach der Zentrifugation bei 274. 000-fache Schwerkraft und vier Grad Celsius für 60 Minuten. Verwenden Sie in einem SW 41 TI-Rotor eine Ein-Milliliter-Pipette, um die oberste Schwimmschicht mit den Lipidtröpfchen vorsichtig aufzufangen.
Stellen Sie das Volumen auf 10 % Saccharose ein und geben Sie es erneut in ein 13,2-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, bevor Sie es mit fünf Millilitern eiskaltem, 100 millimolarem Natriumcarbonatpuffer und 0,5 Millilitern eiskaltem HLM überlagern. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation verwenden Sie eine gebogene PE-Pipette, um die oberste weiße Schwimmschicht mit den Lipidtröpfchen vorsichtig in drei 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 100 Mikrolitern HLM zu sammeln. Charakterisieren Sie die Lipidtröpfchen gemäß dem Textprotokoll Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, wurde das Vorhandensein von Lipidtröpfchen, die aus humanen Terminkalzottenzottenzellen isoliert wurden, durch Färbung mit einem neutralen lipidspezifischen Fluoreszenzfarbstoff boda P 4 93 5 0 3 verifiziert und mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.
Die hier gezeigte Reinheit der isolierten Lipidtröpfchenfraktionen wurde durch Western Blotting mit Markerproteinen für Lipidtröpfchen bewertet, die para lippin zwei Calnexin für das er, den goi-Marker, GM one 30 CO x four für Mitochondrien und die Plasmamembran MEK one enthielten. Nach dem Verfall werden die Lipidtröpfchen mit kaltem Aceton und die Proteine extrahiert. Die Fraktionen wurden dem Western Blotting para lipin unterzogen.
Zweitens wurde das Lipidtröpfchenprotein in einem postnukleären Überstand und in der isolierten weißen Schwimmschicht mit Lipidtröpfchen nachgewiesen. Proteine, die spezifisch für Plasmamembranen sind, wie MK one und GM one 30, wurden in den Lipidtröpfchenfraktionen in keiner der Schichten unterhalb der Schwimmschicht für Spin vier und Spin fünf nachgewiesen. Wie bereits berichtet, wurden das Protein Calnexin und eine schwache Färbung des mitochondrialen Membranproteins CO X four an anderer Stelle in der Lipidtröpfchenfraktion nachgewiesen.
Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass Lipidtröpfchen mit Mitochondrien in Säugetierzellen und mit dem ER r interagieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie proteomische und lipidomische Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu untersuchen, z. B. welche Faktoren an die Tröpfchen gebunden sind.
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Übersicht
In diesem Artikel werden Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen aus Hefezellen und menschlichen Plazenten mittels Dichtegradientenzentrifugation vorgestellt. Die resultierende schwimmende Schicht, die die Tröpfchen enthält, kann leicht visualisiert, extrahiert und durch Western Blot-Analyse auf Reinheit überprüft werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biochemie
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen, die an der Lipidspeicherung und dem Lipidstoffwechsel beteiligt sind.
- Isolationsmethoden sind entscheidend, um die Funktion und Zusammensetzung von Lipidtröpfchen zu untersuchen.
- Die Dichtegradientenzentrifugation ist eine gängige Methode zur Trennung zellulärer Bestandteile.
- Die Fluoreszenzmikroskopie und die Western-Blot-Analyse werden zur Beurteilung der Reinheit verwendet.
Zweck der Studie
- Isolierung von Lipiddroplets aus Plazentagewebe und Hefezellen.
- Charakterisierung der isolierten Lipiddroplets für weitere Untersuchungen.
- Nachweis der Wirksamkeit der Dichtegradientenzentrifugation in diesem Verfahren.
Verwendete Methoden
- Dissektion und Trennung von Plazentagewebe.
- Homogenisierung von Oleinzellen.
- Trennung von Organellen durch mehrfache Zentrifugationsschritte.
- Sammlung und Charakterisierung der schwimmenden Lipidtröpfchenschicht.
Hauptergebnisse
- Lipidtröpfchen wurden erfolgreich aus Hefe- und menschlichem Placentagewebe isoliert.
- Die Reinheit der Lipidtröpfchen-Fraktion wurde mittels Western-Blot-Analyse bestätigt.
- Die Fluoreszenzmikroskopie lieferte eine visuelle Bestätigung der Lipidtröpfchen.
- Die Methoden zeigten Reproduzierbarkeit und Effektivität bei der Isolierung von Lipidtröpfchen.
Schlussfolgerungen
- Die vorgestellten Techniken eignen sich zur Isolierung von Lipidtröpfchen aus verschiedenen Geweben.
- Die Dichtegradientenzentrifugation ist eine zuverlässige Methode dafür.
- Weitere Studien können diese isolierten Lipidtröpfchen für Stoffwechselforschung nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von Lipidtröpfchen ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Target-Validierung, indem gereinigte Organellen für die proteomische und lipidomische Analyse bereitgestellt werden. Dies unterstützt das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckungsphase, indem Lipidstoffwechselwege und assoziierte Proteinwechselwirkungen geklärt werden. Die Methode bietet eine translationale Kontinuität von Hefe-Modellen zu menschlichen Plazentasystemen und erleichtert so die zielgerichtete Bewertung über Arten hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Lipiddroplet-assoziierten Proteinen, um deren funktionelle Rolle in den Wegen der Lipidspeicherung und des Lipidstoffwechsels aufzuklären.
- Operativer Wert: Stellt gereinigte Lipiddroplet-Fraktionen bereit, die für die nachgeschaltete proteomische und lipidomische Profilierung geeignet sind.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen, indem Organellen zur Hypothesenprüfung in Modellen metabolischer Erkrankungen isoliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Präparationen von Lipidtröpfchen für konsistente Assayauslesungen bei der Wirkstoffscreening.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die reproduzierbare Isolierung aus Hefe- und menschlichen Zellsystemen und damit den Plattformtransfer.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays zur Bewertung lipidmodulierender Wirkstoffe in Programmen zu Stoffwechselerkrankungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem die Analyse von Lipidtröpfchen in krankheitsrelevanten humanen Plazentamodellen ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Stellt eine Kontinuität von mechanistischen Studien an Hefe bis hin zur Validierung am menschlichen Gewebe bereit.
- Strategischer Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen bei der Entwicklung lipidspezifischer Therapeutika durch die Validierung über verschiedene Systeme hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung ein, indem sie gereinigte Lipidtröpfchen für die funktionelle Analyse bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Zusammensetzung des Lipidtröpfchen-Proteoms und zu Lipid-Protein-Interaktionen.
- Screening: Ermöglicht assaysfertige Präparationen von Lipidtröpfchen zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Lipidspeicherung.
- Analytik: Liefert quantifizierbare Ergebnisse mittels Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie zur Beurteilung der Reinheit und für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet Befunde aus dem Hefe-Modell mit menschlichen Plazentasystemen zur Validierung von Stoffwechselwegen.
- Unternehmenstechnische Wiederverwendung: Etabliert ein wiederverwendbares Isolierprotokoll, das auf verschiedene eukaryotische Systeme in der Stoffwechselforschung anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die Unsicherheit bei der Identifizierung von Lipiddroplet-assoziierten Proteinen verringert wird.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch Dichtegradientenzentrifugation über verschiedene Modellsysteme hinweg sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen in Programmen zum Lipidstoffwechsel, indem eine zuverlässige Isolierung von Organellen bereitgestellt wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten proteomischen Profilen von Lipiddroplets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellfraktionierung, Dichtegradientenzentrifugation und Methoden zur Isolierung von Organellen.
- Setzt Zugang zu Ultrazentrifugationsgeräten und kompatiblen Rotoren (SW 28, SW 41 TI) für die Trennung in Saccharose- oder Ficoll-Gradienten voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Homogenisierungs- und Zentrifugationsparametern bei der Aufbereitung von Hefe- und humanen Gewebeproben.
- Beinhaltet Anpassungen je nach Zelltyp, basierend auf der Häufigkeit von Lipidtröpfchen und den Profilen der Organellenkontamination.
- Beruht auf der Verwendung von Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie zur Überprüfung der Reinheit, was die Verfügbarkeit spezifischer Antikörper und einer geeigneten Bildgebungsausstattung voraussetzt.
