Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lipidtröpfchen aus dem Gewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Plazentagewebe präpariert und getrennt wird. Als nächstes werden die Zellen des Oleins homogenisiert.

Anschließend werden die Organellen durch mehrere Zentrifugationsschritte getrennt. Schließlich wird die Schwimmschicht, die die Lipidtröpfchen enthält, gesammelt und die Lipidtropfen charakterisiert. Letztendlich werden die Fluoreszenzmikroskopie und die westliche Blutanalyse verwendet, um die Reinheit der Lipidtröpfchenfraktion nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, Lipidtröpfchen aus den meisten Aortenzellen zu isolieren. Beachten Sie, dass in bestimmten Geweben die Anzahl der Tröpfchen unter der Anzahl der Tröpfchen liegen kann, die die schwimmende G-Schicht und die Anzahl der Tröpfchen reduziert. Plazenta wurden von gesunden Frauen mit Einlingsschwangerschaften entnommen, die sich vor dem Einsetzen der spontanen Wehen einem elektiven Kaiserschnitt unterzogen hatten, als die Probanden eine schriftliche Einverständniserklärung für die Entnahme ihrer Plazenta gaben.

Die Entnahme und anschließende Verwendung der Plazenta wurde mit Genehmigung der University of Tennessee und der University of Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville durchgeführt. Institutionelle Prüfstelle in der biologischen Sicherheitshaube, die Plazenta in ein steriles autoklavierbares Gefäß umfüllen und mit steriler Kochsalzlösung vorsichtig Blut von Plazenta und Membranen waschen. Entsorgen Sie die blutige Kochsalzlösung in einem Ein-Liter-Becherglas als flüssigen biologischen Abfall.

Legen Sie die Plazenta mit dieser glatten Oberfläche auf ein steriles Feld, wobei die Nabelschnur mit einer scharfen, feinen Schere und Pinzette nach oben zeigt. Entfernen Sie die Nabelschnur und die fetalen Membranen. Drehen Sie dann die Plazenta um, so dass die mütterliche Oberfläche nach oben zeigt.

Anschließend wird das darüber liegende Basalplattengewebe etwa drei Millimeter von der Oberfläche entfernt. Präparieren Sie jeweils ein COTA-Leadin, vermeiden Sie die Chorionplatte und sammeln Sie das Zottengewebe in einem 250-Milliliter-Becherglas mit Kochsalzlösung. Verwenden Sie dann 0,9% sterile Kochsalzlösung und Pinzette, um das Gewebe mehrmals in einem separaten Becherglas zu spülen, indem Sie es mit dem Ein-Liter-Becherglas für flüssige Abfälle schwenken.

Übertragen Sie jeweils ein Codi-Leadin in eine 150-Millimeter-Petrischale. Halten Sie es mit einer Pinzette fest und kratzen Sie mit einer Rasierklinge das Gewebe von den Gefäßen auf eine Petrischale. Legen Sie das abgeschabte Gewebe in ein separates Becherglas mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung.

Wiederholen Sie dies für alle Taschentuchstücke. Nachdem Sie das abgeschabte Gewebe in der Zelldissoziation cve gespült haben, lassen Sie es von überschüssiger Flüssigkeit und Gewicht ab, um das Plazentagewebe zu verdauen. Nach der Herstellung der Gewebeverdauungsmischung wird das Gewebe geteilt, indem 60 Gramm des insgesamt gesammelten Gewebes in einen sterilen 500-Milliliter-Helen-Meyer-Kolben überführt werden.

Die Gewebeverdauungsmischung in den Kolben mit dem Gewebe geben und 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Shaker inkubieren. Bei 150 U/min, um die dissoziierten Zellen nach der Inkubation zu sammeln und den Kolben zu kippen, damit sich das Gewebe absetzen kann. Sammle das Super-Natin.

Achten Sie darauf, kein UND-dissoziiertes Gewebe zu sammeln. Geben Sie eine gleiche Menge HBSS in den Überstand, bevor Sie ihn in sterile 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Wiederholen Sie die Dissoziations- und Überstandsentnahme mit den verbleibenden Teilen des UND-assoziierten Gewebes für jede Charge nach der Zentrifugation 1000-mal.

15 Minuten lang bei vier Grad Celsius Schwerkraft den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören. Die Plazenzottenzottenzellen befinden sich überwiegend im weißen Teil des Pellets, der über den roten Blutkörperchen liegt. Übertragen Sie die Zottenzellen im weißen Teil des Pellets in ein steriles konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.

Nachdem Sie die Zellen aus allen drei Verdauungsstufen gesammelt haben, verwenden Sie ein 100-Mikron-Nylon-Zellsieb, das in ein steriles konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen eingesetzt wird, um die Suspension zu filtrieren. Wenn sich die Filtration der Zellensuspension verlangsamt, heben Sie den Filter nach oben, um in der Röhrchenzentrifuge 10 Minuten lang ein Vakuum bei vier Grad Celsius und 1000-facher Schwerkraft zu erzeugen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, um Plazenzottenzottenzellen mit frisch zubereitetem hypotonischem Lysemedium oder HLM in einer biologischen Sicherheitshaube zu homogenisieren, und geben Sie das vierfache Zellpelletvolumen von eiskaltem HLM zu den Zellen.

Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Reanimation sanft und gründlich durchzuführen. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis inkubiert haben, geben Sie sie in einen eiskalten Homogenisator und homogenisieren Sie die Zellen langsam mit dem locker sitzenden Stößel mit 20 bis 25 sanften Strichen.

Schleudern Sie das Lysat 10 Minuten lang bei 3000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius, um ununterbrochene Zellen zu entfernen. Dann sammelt man den Überstand in einem neuen Röhrchen, bevor er sich 20 Minuten lang bei der 25.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius erneut dreht. Um die Mitochondrien zu entfernen, um die Lipidtröpfchen durch Ultrazentrifugation zu isolieren, sammeln Sie das Super Natin in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Auf 20 % Saccharose einstellen und in den Boden eines Ultrazentrifugenröhrchens für einen S SW 28-Rotor oder einen gleichwertigen Rotor übertragen, das an die Dichte angepasste Super Natin mit etwa 10 Millilitern eiskaltem, 100 millimolarem Natriumcarbonatpuffer und 0,5 bis einem Milliliter eiskaltem HLM überlagern, um das Röhrchen mit einer Schwenkrotorzentrifuge S SW 28 bei 130 zu füllen. 000-fache Schwerkraft und vier Grad Celsius für 45 Minuten. Sammeln Sie dann die Schwimmschicht, stellen Sie sie auf 10 % Saccharose ein und übertragen Sie sie auf den Boden eines 13,2-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchens für einen SW 41 TI-Rotor oder ein gleichwertiges Röhrchen. Überlagern Sie den dichteeingestellten Überstand mit etwa fünf Millilitern eiskaltem, 100 millimolarem Natriumcarbonatpuffer und 0,5 Millilitern eiskaltem HLM nach der Zentrifugation bei 274. 000-fache Schwerkraft und vier Grad Celsius für 60 Minuten. Verwenden Sie in einem SW 41 TI-Rotor eine Ein-Milliliter-Pipette, um die oberste Schwimmschicht mit den Lipidtröpfchen vorsichtig aufzufangen.

Stellen Sie das Volumen auf 10 % Saccharose ein und geben Sie es erneut in ein 13,2-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, bevor Sie es mit fünf Millilitern eiskaltem, 100 millimolarem Natriumcarbonatpuffer und 0,5 Millilitern eiskaltem HLM überlagern. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation verwenden Sie eine gebogene PE-Pipette, um die oberste weiße Schwimmschicht mit den Lipidtröpfchen vorsichtig in drei 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 100 Mikrolitern HLM zu sammeln. Charakterisieren Sie die Lipidtröpfchen gemäß dem Textprotokoll Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, wurde das Vorhandensein von Lipidtröpfchen, die aus humanen Terminkalzottenzottenzellen isoliert wurden, durch Färbung mit einem neutralen lipidspezifischen Fluoreszenzfarbstoff boda P 4 93 5 0 3 verifiziert und mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Die hier gezeigte Reinheit der isolierten Lipidtröpfchenfraktionen wurde durch Western Blotting mit Markerproteinen für Lipidtröpfchen bewertet, die para lippin zwei Calnexin für das er, den goi-Marker, GM one 30 CO x four für Mitochondrien und die Plasmamembran MEK one enthielten. Nach dem Verfall werden die Lipidtröpfchen mit kaltem Aceton und die Proteine extrahiert. Die Fraktionen wurden dem Western Blotting para lipin unterzogen.

Zweitens wurde das Lipidtröpfchenprotein in einem postnukleären Überstand und in der isolierten weißen Schwimmschicht mit Lipidtröpfchen nachgewiesen. Proteine, die spezifisch für Plasmamembranen sind, wie MK one und GM one 30, wurden in den Lipidtröpfchenfraktionen in keiner der Schichten unterhalb der Schwimmschicht für Spin vier und Spin fünf nachgewiesen. Wie bereits berichtet, wurden das Protein Calnexin und eine schwache Färbung des mitochondrialen Membranproteins CO X four an anderer Stelle in der Lipidtröpfchenfraktion nachgewiesen.

Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass Lipidtröpfchen mit Mitochondrien in Säugetierzellen und mit dem ER r interagieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie proteomische und lipidomische Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu untersuchen, z. B. welche Faktoren an die Tröpfchen gebunden sind.