Name: Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von PEG-Mikrogelen durch photopolymerisierte Fällungsreaktionen für Wirkstofffreisetzung und Gewebeengineering. Diese Methode ermöglicht präzise Steuerung von Durchmesser und Quellverhalten durch Variation des Molekulargewichts.

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Die Finanzierung dieses Projekts erfolgte durch den NSF CBET Award 1061834. Die Autoren möchten CIBA für eine Stichprobe von Photoinitiatoren danken.

1. Vorbereitung von Lösungen für die Verwendung bei der Herstellung von Mikrogelen
<ol>
	<li>Bevor Sie mit der Fällungsreaktion beginnen, stellen Sie die erforderlichen Lösungen her und erwärmen Sie sie auf 37 °C. Zu den erforderlichen Lösungen gehören 0,5 % Photoinitiator, 1,5 M Na2SO4, Pufferlösung, 200 mg/ml PEG-Diacrylat (PEG-DA) Lösung und 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Hinweis: Alle PEG-Vorläuferstoffe werden gemäß den veröffentlichten Methoden acryliert und bis zur Verwendung12 bei -20 °C unter Argon gelagert.</li>
	<li>Wiegen Sie den Photoinitiator ab und lösen Sie ihn in deionisiertem (DI) H2O auf, um eine Lösung von 0,5 (w/v) % zu erhalten. Es ist wichtig, die Lösung vor UV-Licht zu schützen.
	<ol>
		<li>Nach vollständiger Auflösung durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Diese Lösung kann im Voraus hergestellt und bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden. Hinweis: Verringern Sie die Rührzeit auf ca. 1 Stunde, indem Sie die Lösung unter Rühren auf 40 °C erhitzen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Für 1x PBS 1 Tablette PBS auf 1 L DI H2O geben und durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. PBS kann im Voraus hergestellt und bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Messen Sie 39,4 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,4) und fügen Sie 612 μl Triethanolamin (TEOA) und 260 μl 6 M Salzsäure (HCl) hinzu. Hinweis: TEOA ist sehr viskos; TEOA vor dem Pipettieren auf 37 °C vorheizen.
	<ol>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert des Puffers so ein, dass er etwa 7,7 beträgt, und filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter (endgültiger pH-Wert ~7,8). Die Pufferlösung kann hochskaliert, im Voraus hergestellt und bei 37 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die PEG-DA-Lösung wird jedes Mal vor Beginn der Reaktion hergestellt; bei Lagerung der Lösung wurde eine verminderte Reaktivität beobachtet. Wiegen Sie PEG-DA ab und fügen Sie PBS/TEOA/HCl-Puffer bis zur Endkonzentration von 200 mg/ml hinzu. Hinweis: Geben Sie den Puffer langsam hinzu, um die PEG-Konzentration sorgfältig zu kontrollieren, da PEG in Lösung quillt. 
	Hinweis: Diese Lösung ist hochgradig anpassbar. Zu den Optionen für die Anpassung von Mikrogelen gehören: Ändern des Ausgangsmolekulargewichts von PEG, um die Mikrogeleigenschaften zu verändern, Verwendung eines abbaubaren PEG-Vorläufers zur Herstellung von abbaubaren Mikrogelen, Sterilfiltration aller Lösungen für biologisch sterile Mikrogele, Abschluss des Bildungsprozesses in einer Laminar-Flow-Haube und schließlich Hinzufügen von funktionellen Gruppen zur Oberfläche durch Einarbeiten in die PEG-Lösung.</li>
	<li>Na2SO4 abwiegen und in DI H2O auflösen, um eine Lösung von 1,5 M zu erhalten. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, muss die Natriumsulfatlösung auch kurz vor Beginn der Reaktion hergestellt werden.
	<ol>
		<li>Die Lösung erhitzen und wirbeln, bis Na2SO4 vollständig aufgelöst ist. Bei Bedarf durch 0,22 μm Filter filtrieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Herstellung von Mikrogelen
<ol>
	<li>Geben Sie 127,5 μl PBS/TEOA/HCl-Puffer, 10 μl 0,5 % Photoinitiator und 25 μl 200 mg/ml PEG-Lösung in die Röhrchen, in denen die Mikrogele gebildet werden; typischerweise 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
	<ol>
		<li>Diese Rohre werden zusammen mit der 1,5 M Na2SO4 Lösung auf 37 °C erhitzt.</li>
		<li>Mischen Sie die Röhren beim Erhitzen. Hinweis: Dieses Mikrogel-Protokoll kann hochskaliert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um Moleküle in die Mikrogele einzukapseln, fügen Sie das gewünschte Molekül (z. B. Ovalbumin) zum PBS/TEOA/HCl-Puffer, zum Photoinitiator und zur PEG-Lösung hinzu. Nach der Vernetzung wird das Molekül im Mikrogel-Netzwerk gefangen.</li>
	<li>Führen Sie jede Mikrogelreaktion nacheinander durch. Nehmen Sie das erste Röhrchen und fügen Sie 87,5 μl 1,5 M Na2SO4 hinzu.</li>
	<li>Röhrchen durch 3-5x Pipettieren mischen; alternativ 30 Sekunden warten. Nach dem Mischen ist die Salzkonzentration gleichmäßig verteilt und die Lösung sollte klar sein.</li>
	<li>Legen Sie die Röhre unter das UV-Licht und vernetzen Sie sie 30 Sekunden lang. Nach der Vernetzung sollte sich eine trübe Schicht auf der Lösung befinden, diese Schicht enthält die Mikrogele. Siehe Abbildung 1 für das Reaktionsschema.</li>
	<li>750 μl PBS nach der Zentrifugation zu einem Pellet hinzufügen und gut vermischen.</li>
	<li>Waschen Sie die Mikrogele 5 x durch Zentrifugieren für 2 min bei 4.000 x g zu einem Pellet und tauschen Sie den Überstand gegen PBS aus. Hinweis: Stören Sie das Mikrogel-Pellet nicht während des Pufferwechsels, es ist möglicherweise nicht möglich, den gesamten Überstand zu entfernen.</li>
</ol>
3. Mikrogelgröße und Polydispersität
<ol>
	<li>30 μl Mikrogele aus dem durch Zentrifugieren gebildeten Pellet in 1 ml DI H2O pipettieren. Um beste Ergebnisse zu erzielen, beschallen Sie die Mikrogellösung 1 Stunde lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät (50-60 Hz und 1,4 A) oder mischen Sie kräftig, um die Mikrogele zu suspendieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie 15 μl der Mikrogellösung auf einen sauberen Objektträger und legen Sie den Deckglas #1,5 darauf. Drehen Sie den Objektträger und den Deckbogen auf ein Laborgewebe und drücken Sie den Objektträger nach unten, um überschüssige Lösung zu entfernen und sicherzustellen, dass sich die Mikrogele in einer einzigen Schicht befinden.</li>
	<li>Nehmen Sie mehrere Bilder der Mikrogele mit einem DIC 100X Ölobjektiv auf. In der Regel werden 5 Bilder pro Probe und 3 Proben pro Charge empfohlen, um insgesamt 15 Bilder zu erhalten. Hinweis: Bisher wurden keine Schwankungen von Charge zu Charge beobachtet.</li>
	<li>Messen Sie die Mikrogele, um einen repräsentativen Durchmesser zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie den PDI mit der folgenden volumenbasierten Gleichung, in der N die Gesamtzahl der Mikrogele und Vi das Volumen des Mikrogels i ist.</li>
</ol>
4. Mikrogel-Dichte
<ol>
	<li>Bereiten Sie Dextran 7, 6, 5, 4, 3 und 1 (w/v)%-Lösungen in DI H2O vor, um die Mikrogeldichte zu bestimmen. Diese Dichten wurden mit 1,022, 1,020, 1,018, 1,016, 1,014 bzw. 1,010 g/cm3 berechnet.</li>
	<li>1 ml 7%ige Dextranlösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
	<ol>
		<li>Pipettieren Sie langsam 1 ml 6%ige Dextranlösung, um eine deutliche Schicht auf dem 7%igen Dextran zu bilden.</li>
		<li>Warten Sie 5 Minuten und fügen Sie dann 1 ml der 5%igen Lösung hinzu.</li>
		<li>Fahren Sie fort, bis alle Dextranlösungen in der Reihenfolge abnehmender Dextrankonzentration geschichtet sind.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schichten Sie die Mikrogele vorsichtig über die 1%ige Dextranlösung.</li>
	<li>Der Gradient wird 10 min lang bei 4.000 x g und 5 °C zentrifugiert. Die Mikrogelposition nach der Zentrifugation ermöglicht eine einfache Berechnung der Dichte13.</li>
</ol>
5. Schwellung des Mikrogel-Gleichgewichts
<ol>
	<li>Um die gequollene Masse (Ms) der Mikrogele, definiert als die Masse nach Gleichgewichtsquellung (48 Stunden), zu messen, waschen Sie die Mikrogele zunächst 5x in DI H2O und quellen Sie mindestens 48 Stunden lang in vorgewogenen Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mikrogele für 10 min bei 4.000 x g.</li>
	<li>Entfernen Sie den gesamten Überstand und notieren Sie die nasse Masse. Verwenden Sie Filtermethoden, um sicherzustellen, dass überschüssiges Wasser entfernt wird, um genauere Ergebnisse zu erhalten.</li>
	<li>Frieren Sie die Mikrogele bei -80 °C ein und lyophilisieren Sie dann auf eine konstante Masse, um die Trockenmasse (Md) zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie den Wassergehalt in den Mikrogelen als Wasser% = (Ms - Md) / Md x 100.</li>
	<li>Bestimmen Sie den Polymergehalt anhand von Polymer% = 100 - Wasser% .</li>
	<li>Führen Sie statistische Analysen aller Daten mit SAS mit n-Wege-ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test durch. Unterschiede werden bei p<0.05 vermerkt.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die physikalischen Eigenschaften von PEG-Mikrogelen wurden auf Veränderungen der Polymerisationsbedingungen untersucht. Für diese Fällungsreaktion wurden eine Pufferlösung, eine 20%ige (w/v) PEG-Diacrylat-Lösung (MW 3.000, 4.600 oder 6.000 Da) und ein Photoinitiator gemischt und auf 37 °C erwärmt. Die Zugabe von 1,5 M Na2SO4, einem kosmotrophen Salz, das die Wechselwirkungen zwischen Wassermolekülen erhöht, führte dazu, dass PEG bei seiner Zugabe kurzzeitig ausfiel. Dieser Effekt ist bei PEG8</...

Per Definition sind Mikrogele Hydrogele beliebiger Form mit einem äquivalenten Durchmesser von ca. 0,1-100 μm1. Aufgrund ihrer Größe und Eigenschaften stellen polymere Mikrogele ein vielseitiges Werkzeug für die Weiterentwicklung von Arzneimittelverabreichungs- und Tissue-Engineering-Systemen dar. Während Bulk-Hydrogele in großem Umfang mit großem Erfolg als Tissue-Engineering-Gerüste und Arzneimittelverabreichungsvehikel eingesetzt werden2-4, bietet eine kürzliche Umstellung auf die mikroskalige Kontrolle von Gerüsten eine einzigartige Gelegenheit für Mikrogele, als Basismaterial für den Bau von Gerüsten verwendet zu werden. Darüber hinaus haben Mikrogele ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis für zelluläre Wechselwirkungen und in Lösung eine niedrige Viskosität, was sie ideal für Injektionen macht. Schließlich können Mikrogele unter Verwendung zahlreicher Polymere durch eine Vielzahl von Methoden in Abhängigkeit von den gewünschten Mikrogeleigenschaften geformt werden, wodurch sie für eine Vielzahl von Anwendungen hochgradig anpassbar sind.
Techniken zur Herstellung von Mikrogelen umfassen Suspensions-, Emulsions-, Dispersions- oder Fällungspolymerisationen. Emulsions- und Suspensionspolymerisationen erfordern typischerweise organische Lösungsmittel und Tenside oder Stabilisatoren, um die Mikrogele zu bilden. Die Art dieser Verfahren führt zu einer hochdispersen Partikelgrößenverteilung5. Dispersions- und Fällungsreaktionen führen zu Partikeln mit geringerer Polydispersität6; Partikel, die durch Dispersionspolymerisation gebildet werden, erfordern jedoch immer noch den Einsatz von Stabilisatoren6. Mikrogele, die durch Fällungsreaktionen gebildet werden, sind insofern einzigartig, als sie Partikel von einheitlicher Größe und Form bilden, ohne dass Stabilisatoren oder Tenside verwendet werden. Die Bildung von Mikrogelen wird erreicht, wenn die Polymerketten durch enthalpische oder entropische Fällung phasengetrennt von der kontinuierlichen Phase wachsen7. Die Fällungspolymerisation erfolgt häufig bei hohen Temperaturen, die durch die Verwendung von kosmotrophen Salzen gesenkt werden können, die die Löslichkeit des Polymers im Lösungsmittel verringern8. Diese Arbeit konzentriert sich auf Mikrogele, die aus Poly(ethylenglykol) (PEG) durch eine photopolymerisierte Fällungsreaktion unter biologisch kompatiblen Bedingungen gebildet werden, mit Variationen zur Veränderung der Mikrogeleigenschaften und zur Verkapselung von Molekülen für Anwendungen zur Wirkstoffverabreichung.
Frühere Studien mit PEG-Hydrogelen zeigen, dass die Polymerisationsbedingungen die physikalischen und mechanischen Eigenschaften von Hydrogelen, nämlich den Wassergehalt des Hydrogels und den Druckmodul3,9, stark beeinflussen. Diese vernetzten Materialien sind von Interesse, da die von Flory10 beschriebene Beziehung zwischen strukturellen und physikalischen Eigenschaften genutzt werden kann, um das vernetzte Hydrogel für bestimmte Anwendungen maßzuschneidern. Diese Prinzipien sind bei Mikrogelen ähnlich. Es wurde festgestellt, dass fällungsgebildete PEG-Mikrogele Potenzial für die regenerative Medizinhaben 11, jedoch waren weitere Untersuchungen der Mikrogeleigenschaften erforderlich, um ihr Repertoire für zukünftige biomedizinische Anwendungen zu erweitern. Dieser Bericht beschreibt das Verfahren zur Herstellung von Mikrogelen durch Fällungsreaktion und zur Veränderung von Eigenschaften wie Mikropartikeldurchmesser, Polydispersitätsindex (PDI), Dichte und Quellung, die für die Weiterentwicklung dieser Materialien für die Arzneimittelverabreichung oder regenerative Medizin wichtig wären.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>MP Biomedical</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamin (TEOA)</td><td>J.T. Baker</td><td>9468-01</td><td>Auf 37 & Grad vorheizen; C vor dem Pipettieren</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>BDH Aristar</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfat</td><td>J.T. Baker</td><td>3891-01</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin (OVA)</td><td>Invitrogen</td><td>34782</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1.500</td><td>Alfa Aesar A16241</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG 3.000</td><td>Fluka</td><td>03997-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4.000</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4.600</td><td>Sigma</td><td>373001-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6.000</td><td>Fluka</td><td>03394-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 10.000</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>TCI</td><td>D1449</td><td></td></tr></tbody></table>

merkmale der niederschlag gebildet polyethylene glycol-mikrogele durch molekulargewicht der reaktanden controlled

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

Diese Arbeit beschreibt die Bildung von Poly (ethylenglycol) (PEG)-Mikrogele über eine photopolymerisierte Fällungsreaktion. Fällungsreaktionen bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Mikrokügelchen Herstellungstechniken. Entgegen der Emulsion, Suspension, Dispersion und Techniken sind von gleicher Form und Größe Mikrogele durch Ausfällung gebildet, dh geringer Polydispersitätsindex ohne die Verwendung von organischen Lösemitteln oder Stabilisatoren. Die milden Bedingungen der Fällungsreaktion, anpassbare Eigenschaften der Mikrogele und niedrige Viskosität für Injektions machen sie gelten für in-vivo-Zwecke. Im Gegensatz zu anderen Herstellungstechniken können Mikrogel Eigenschaften durch Veränderung der Ausgangspolymermolekulargewicht geändert werden. Die Erhöhung der Start PEG-Molekulargewicht erhöht Mikrogel Durchmesser und Quellverhältnis. Weitere Modifikationen sind wie Kapselung Moleküle während Mikrogel Vernetzung vorgeschlagen. Einfache Anpassungen der PEG microgel Bausteine ​​sind für zukünftige Anwendungen der Mikrogele als Drug-Delivery-Fahrzeuge und Tissue Engineering Scaffolds erforscht.

Die Größe der Mikrogele hängt von den Polymerisationsbedingungen ab. Abbildung 2A veranschaulicht, wie der Durchmesser der Mikrogele mit zunehmendem Startmolekulargewicht von PEG und längeren Vernetzungszeiten ansteigt. Repräsentative Bilder von Mikrogelen, die zur Größenbestimmung bei verschiedenen Molekulargewichten verwendet wurden und 30 Sekunden vernetzt wurden, sind in Abbildung 2C–G dargestellt. Bei PEG mit einem Molekulargewicht von 3.000 Da nahm der durchschnittliche Durchmesser...

Diese Arbeit beschreibt die Bildung von Poly(ethylenglykol) (PEG)-Mikrogelen durch eine photopolymerisierte Fällungsreaktion. Durch die Erhöhung des PEG-Molekulargewichts wurde der Durchmesser des Mikrogels und das Quellverhältnis erhöht. Einfache Anpassungen an die PEG-Mikrogel-Fällungsreaktion werden für zukünftige Anwendungen von Mikrogelen als Wirkstoffverabreichungsvehikel und Tissue-Engineering-Gerüste untersucht.

Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Polyethylenglykol-Mikrogele durch eine photopolymerisierte Fällungsreaktion herzustellen, um sie als Arzneimittelträger und Gerüste für das Gewebeengineering zu nutzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Reagenzien, einschließlich eines Photoinitiators, Puffer, Triethylamin und PEG-DL-Lösung, vorbereitet und auf 37 Grad Celsius erwärmt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Reagenzien in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu geben und unter Beibehaltung einer Temperatur von 37 Grad Celsius zu verwirbeln.Anschließend wird Natriumsulfat hinzugefügt und die Lösung 30 Sekunden lang unter UV-Licht zum Vernetzen gestellt. Nach der Vernetzung bildet sich eine trübe Schicht auf der Lösung, die die Mikrogele enthält. Im letzten Schritt wird PBS zur Mischung gegeben und zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden.Schließlich werden Mikroskopie und dynamische Lichtstreuung verwendet, um die Größe der Mikrogele zu bestimmen, und die Dichte wird mithilfe eines Dextrin-Dichtegradienten gemessen. Zusätzlich wird das Quellverhalten durch Bestimmung der nassen und trockenen Gewichte der Mikrogele ermittelt. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Verfahren wie Emulsions-, Suspensions- und Dispersionsverfahren besteht darin, dass die durch Fällungsreaktion gebildeten Mikrogele über einen niedrigen Polydispersitätsindex verfügen, ohne organische Lösungsmittel oder Stabilisatoren einzusetzen. Die milden Bedingungen der Fällungsreaktion, die anpassbaren Eigenschaften der Mikrogele sowie deren geringe Viskosität für Injektionen machen sie für NVivo-Anwendungen geeignet.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Gewebeengineering und regenerative Medizin zu beantworten, beispielsweise die Herstellung von Gerüsten mit gleichmäßiger Größe und niedrigem Polydispersitätsindex. Die Bedeutung dieser Technik kann sich auch auf die Arzneimitteldelivery-Therapie auswirken, da Wachstumsfaktoren in Arzneimitteln leicht eingeschlossen werden können. Zunächst wiegen Sie 500 Milligramm des Photoinitiators ab und geben Sie ihn zu 100 Milliliter entionisiertem Wasser hinzu, um eine 0,5%-ige Lösung herzustellen.Schützen Sie die Lösung vor UV-Licht und erhitzen Sie sie unter ständigem Rühren auf 40 Grad Celsius, um den Photoinitiator innerhalb von etwa einer Stunde vollständig aufzulösen. Nach der vollständigen Auflösung filtrieren Sie die Lösung steril, indem Sie sie durch einen 0,22-Mikron-Filter leiten, und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bis sie benötigt wird. Erwärmen Sie als Nächstes Triethylamin vor, indem Sie es auf 37 Grad Celsius bringen, um seine Viskosität zu verringern.Gegeben Sie anschließend 612 µL davon zusammen mit 260 µL sechsmolarer Salzsäure zu 39,4 mL PBS und stellen den pH-Wert auf 7,8 steril ein. Filtern Sie die endgültige Lösung durch einen 0,22 µm-Filter und lagern Sie sie bei 37 °C, bis sie benötigt wird. Gemäß der Arbeit von Sony at all acro lte stellen Sie die PEG-Vorläufer nach den publizierten Methoden her und lagern Sie das fertige Produkt bei minus 20 °C unter Argon. Unmittelbar vor der Verwendung bereiten Sie 1 mL einer 200 mg/mL Peg-Di-Acrylat-Lösung vor, indem Sie langsam 0,8 mL des PBS, das mit Triethanolamin und Salzsäure versetzt wurde, zu 200 mg Peg-Di-Acrylat hinzufügen.Außerdem wiegen Sie kurz vor dem Experiment 213 Milligramm Natriumsulfat ab und lösen es in einem Milliliter entionisiertem Wasser auf. Um eine 1,5-molare Lösung herzustellen, erhitzen Sie die Lösung 20 Minuten lang auf 37 Grad Celsius und wirbeln sie anschließend im Vortex, bis sie vollständig gelöst ist. Nach der Auflösung filtrieren Sie sowohl die endgültige Natriumsulfatlösung als auch die PEG-Diacrylat-Lösung bei 37 Grad Celsius durch 0,22-Mikrometer-Filter.Mischen Sie 127,5 µL PBS mit Triethylamin und Salzsäure, 10 µL des 0,5-%-Photoinitiators und 25 µL der 200 Milligramm pro Milliliter PEG-Diacrylat-Lösung in einem 1,6-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend beliebige gewünschte Moleküle für die Einschließung hinzu.Erhitzen Sie diese Röhrchen zusammen mit der 1,5 molaren Natriumsulfatlösung auf 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 87,5 µL der vorgewärmten 1,5 molaren Natriumsulfatlösung zu dem ersten Röhrchen der PEG-Lösung hinzu und mischen Sie das Röhrchen, indem Sie die Lösung drei bis fünf Mal mit einer Pipette auf- und abpipettieren. Nach dem Mischen ist die Salzkonzentration gleichmäßig verteilt und die Lösung sollte klar werden.Stellen Sie das Gefäß unter das UV-Licht und vernetzen Sie 30 Sekunden lang nach dem Vernetzen. Es sollte sich eine trübe Schicht auf der Oberfläche der Lösung befinden, die die Mikrogel enthalten. Geben Sie anschließend 750 Mikroliter PBS zu dem Gefäß hinzu und mischen Sie die Lösung gründlich durch Vortexen.Anschließend die Mischung bei 4.000 × g für zwei Minuten zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden. Nach dem Zentrifugieren die Überstände vorsichtig entfernen, wobei darauf zu achten ist, das Pellet nicht aufzuwirbeln, und die Mikrogele in frischem PBS resuspendieren. Die Mikrogele insgesamt fünfmal mit frischem PBS waschen, wobei zwischen jedem Waschschritt eine Zentrifugation erfolgt.Nach dem letzten Waschschritt entfernen Sie den Überstand und pipettieren 30 Mikroliter Mikrogele aus dem Pellet in ein Milliliter entionisiertes Wasser. Anschließend werden die Mikrogellösung eine Stunde lang in einem Ultraschallbad bei 50 bis 60 Hertz und einer Leistung von 1,4 Ampere sonifiziert. Danach pipettieren Sie 15 Mikroliter der Mikrogellösung auf einen sauberen, mit Säure geätzten Glasobjektträger und legen eine mit Säure geätzte Deckglasnummer 1,5 darauf.Drehen Sie den Objektträger auf ein Laborpapier und drücken Sie vorsichtig darauf, um überschüssige Lösung zu entfernen und sicherzustellen, dass die Mikrogele in einer einzigen Schicht liegen. Erfassen Sie anschließend mit einem optischen Mikroskop mehrere Bilder der Mikrogele mithilfe eines DIC 100x-Ölobjektivs. Messen Sie die Mikrogele, um einen repräsentativen Durchmesser zu erhalten.Berechnen Sie den Polydispersitätsindex unter Verwendung der hier gezeigten volumenbasierten Gleichung, wobei N die Gesamtanzahl der Mikrogele und VI das Volumen des Mikrogels ist. Um die durchschnittliche Dichte der Mikrogele zu bestimmen, stellen Sie zunächst Dextrinlösungen mit 7, 6, 5, 4, 3 und 1 % in deionisiertem Wasser her; die Dichten der Dextrinlösungen sind hier dargestellt. Geben Sie anschließend zwei Milliliter der 7-%-Dextrinlösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Danach langsam zwei Milliliter der 6%igen Dextrinlösung pipettieren, um eine deutliche Schicht über der 7%igen Dextrinlösung zu bilden. Nach fünf Minuten zwei Milliliter der nächsten Schicht aus 5%iger Dextrinlösung hinzufügen und auf diese Weise fortfahren, bis jede Dextrinkonzentration in abnehmender Reihenfolge geschichtet wurde. Anschließend die Mikrogele vorsichtig über die 1%ige Dextrinlösung schichten, den Gradienten bei fünf Grad Celsius mit 4.000 ×g zehn Minuten lang zentrifugieren.Visualisieren Sie dann die Position der Mikrogele und berechnen Sie die Dichte der Mikrogele entsprechend ihrer Lage zwischen den Schichten. Um die Quellmasse der Mikrogele zu bestimmen, wiegen Sie zunächst ein Mikrozentrifugenröhrchen vor und geben anschließend ein Milliliter der Mikrogele hinzu. Waschen Sie die Mikrogele fünfmal mit jeweils deionisiertem Wasser, wobei zwischen jeder Waschung eine Zwischenschritt erfolgt.Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 4.000 × g, um nach der letzten Waschung die Mikrogele zu pelletieren. Resuspendieren Sie sie in entionisiertem Wasser und lassen Sie sie mindestens 48 Stunden lang quellen. Nach 48 Stunden zentrifugieren Sie die aufgequollenen Mikrogele 10 Minuten bei 4.000 × g und entfernen anschließend sämtlichen Überstand.Wiegen Sie die Probe anschließend und notieren Sie die Feuchtmasse. Nachdem eine genaue Feuchtmessung vorliegt, gefrieren Sie die Mikrogele bei minus 80 Grad Celsius und trocknen Sie sie gefriertrocknerisch, um das Wasser zu entfernen und die Trockenmasse zu erhalten. Sobald das gesamte Wasser sublimiert ist, berechnen Sie den Wassergehalt und den Polymergehalt in den Mikrogelelen mithilfe der hier gezeigten Gleichungen, wobei MS die Feuchtmasse der Mikrogele und MD die Trockenmasse ist.Der durchschnittliche Durchmesser von PEG-Mikrogelen, die unter Verwendung verschiedener Molekulargewichte von 20 % PEG hergestellt wurden, ist hier dargestellt. Eine längere Bestrahlungsdauer mit UV-Licht beeinflusste ebenfalls den Durchmesser der Mikrogel. Mit zunehmender UV-Bestrahlungsdauer nahmen auch die Durchmesser der hier gezeigten drei Formulierungen zu.Die durch Dextrin-Gradienten gemessene Dichte nahm mit steigendem Molekulargewicht der Vorläufer-PEG-Moleküle ab. Dies wird auch durch das Diagramm zum prozentualen Wassergehalt bestätigt, in dem sich zeigte, dass PEG mit höherem Molekulargewicht eine größere Menge Wasser pro Gramm Polymer enthielt. Schließlich wurde gezeigt, dass die Mikrogele mit fluoreszenzmarkiertem Protein beladen werden können, indem Albumin der Mischung vor der Polymerisation hinzugefügt wurde und so in den Kugeln eingeschlossen wurde.Steigende Konzentrationen des fluoreszenzmarkierten Proteins erhöhten den Polydispersitätsindex der Sphären, aber die durchschnittliche Größe blieb konstant. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Lösungen auf 37 Grad Celsius zu erwärmen und die Mikrogele gut zu verwirbeln, um Aggregate während des Waschens und der Vorbereitung der Objektträger für die Bildgebung aufzulösen. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden zur Arzneimittelverkapselung durchgeführt werden, um weitere Fragen bezüglich der Wirkung der Arzneimittelfreisetzung zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PEG-DA-Mikrogele unter milden Bedingungen über Fällungsreaktionen herstellt.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

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