Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Polyethylenglykol-Mikrogele durch eine photopolymerisierte Fällungsreaktion herzustellen, um sie als Arzneimittelträger und Gerüste für das Gewebeengineering zu nutzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Reagenzien, einschließlich eines Photoinitiators, Puffer, Triethylamin und PEG-DL-Lösung, vorbereitet und auf 37 Grad Celsius erwärmt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Reagenzien in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu geben und unter Beibehaltung einer Temperatur von 37 Grad Celsius zu verwirbeln.

Anschließend wird Natriumsulfat hinzugefügt und die Lösung 30 Sekunden lang unter UV-Licht zum Vernetzen gestellt. Nach der Vernetzung bildet sich eine trübe Schicht auf der Lösung, die die Mikrogele enthält. Im letzten Schritt wird PBS zur Mischung gegeben und zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden.

Schließlich werden Mikroskopie und dynamische Lichtstreuung verwendet, um die Größe der Mikrogele zu bestimmen, und die Dichte wird mithilfe eines Dextrin-Dichtegradienten gemessen. Zusätzlich wird das Quellverhalten durch Bestimmung der nassen und trockenen Gewichte der Mikrogele ermittelt. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Verfahren wie Emulsions-, Suspensions- und Dispersionsverfahren besteht darin, dass die durch Fällungsreaktion gebildeten Mikrogele über einen niedrigen Polydispersitätsindex verfügen, ohne organische Lösungsmittel oder Stabilisatoren einzusetzen. Die milden Bedingungen der Fällungsreaktion, die anpassbaren Eigenschaften der Mikrogele sowie deren geringe Viskosität für Injektionen machen sie für NVivo-Anwendungen geeignet.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Gewebeengineering und regenerative Medizin zu beantworten, beispielsweise die Herstellung von Gerüsten mit gleichmäßiger Größe und niedrigem Polydispersitätsindex. Die Bedeutung dieser Technik kann sich auch auf die Arzneimitteldelivery-Therapie auswirken, da Wachstumsfaktoren in Arzneimitteln leicht eingeschlossen werden können. Zunächst wiegen Sie 500 Milligramm des Photoinitiators ab und geben Sie ihn zu 100 Milliliter entionisiertem Wasser hinzu, um eine 0,5%-ige Lösung herzustellen.

Schützen Sie die Lösung vor UV-Licht und erhitzen Sie sie unter ständigem Rühren auf 40 Grad Celsius, um den Photoinitiator innerhalb von etwa einer Stunde vollständig aufzulösen. Nach der vollständigen Auflösung filtrieren Sie die Lösung steril, indem Sie sie durch einen 0,22-Mikron-Filter leiten, und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bis sie benötigt wird. Erwärmen Sie als Nächstes Triethylamin vor, indem Sie es auf 37 Grad Celsius bringen, um seine Viskosität zu verringern.

Gegeben Sie anschließend 612 µL davon zusammen mit 260 µL sechsmolarer Salzsäure zu 39,4 mL PBS und stellen den pH-Wert auf 7,8 steril ein. Filtern Sie die endgültige Lösung durch einen 0,22 µm-Filter und lagern Sie sie bei 37 °C, bis sie benötigt wird. Gemäß der Arbeit von Sony at all acro lte stellen Sie die PEG-Vorläufer nach den publizierten Methoden her und lagern Sie das fertige Produkt bei minus 20 °C unter Argon. Unmittelbar vor der Verwendung bereiten Sie 1 mL einer 200 mg/mL Peg-Di-Acrylat-Lösung vor, indem Sie langsam 0,8 mL des PBS, das mit Triethanolamin und Salzsäure versetzt wurde, zu 200 mg Peg-Di-Acrylat hinzufügen.

Außerdem wiegen Sie kurz vor dem Experiment 213 Milligramm Natriumsulfat ab und lösen es in einem Milliliter entionisiertem Wasser auf. Um eine 1,5-molare Lösung herzustellen, erhitzen Sie die Lösung 20 Minuten lang auf 37 Grad Celsius und wirbeln sie anschließend im Vortex, bis sie vollständig gelöst ist. Nach der Auflösung filtrieren Sie sowohl die endgültige Natriumsulfatlösung als auch die PEG-Diacrylat-Lösung bei 37 Grad Celsius durch 0,22-Mikrometer-Filter.

Mischen Sie 127,5 µL PBS mit Triethylamin und Salzsäure, 10 µL des 0,5-%-Photoinitiators und 25 µL der 200 Milligramm pro Milliliter PEG-Diacrylat-Lösung in einem 1,6-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend beliebige gewünschte Moleküle für die Einschließung hinzu.

Erhitzen Sie diese Röhrchen zusammen mit der 1,5 molaren Natriumsulfatlösung auf 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 87,5 µL der vorgewärmten 1,5 molaren Natriumsulfatlösung zu dem ersten Röhrchen der PEG-Lösung hinzu und mischen Sie das Röhrchen, indem Sie die Lösung drei bis fünf Mal mit einer Pipette auf- und abpipettieren. Nach dem Mischen ist die Salzkonzentration gleichmäßig verteilt und die Lösung sollte klar werden.

Stellen Sie das Gefäß unter das UV-Licht und vernetzen Sie 30 Sekunden lang nach dem Vernetzen. Es sollte sich eine trübe Schicht auf der Oberfläche der Lösung befinden, die die Mikrogel enthalten. Geben Sie anschließend 750 Mikroliter PBS zu dem Gefäß hinzu und mischen Sie die Lösung gründlich durch Vortexen.

Anschließend die Mischung bei 4.000 × g für zwei Minuten zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden. Nach dem Zentrifugieren die Überstände vorsichtig entfernen, wobei darauf zu achten ist, das Pellet nicht aufzuwirbeln, und die Mikrogele in frischem PBS resuspendieren. Die Mikrogele insgesamt fünfmal mit frischem PBS waschen, wobei zwischen jedem Waschschritt eine Zentrifugation erfolgt.

Nach dem letzten Waschschritt entfernen Sie den Überstand und pipettieren 30 Mikroliter Mikrogele aus dem Pellet in ein Milliliter entionisiertes Wasser. Anschließend werden die Mikrogellösung eine Stunde lang in einem Ultraschallbad bei 50 bis 60 Hertz und einer Leistung von 1,4 Ampere sonifiziert. Danach pipettieren Sie 15 Mikroliter der Mikrogellösung auf einen sauberen, mit Säure geätzten Glasobjektträger und legen eine mit Säure geätzte Deckglasnummer 1,5 darauf.

Drehen Sie den Objektträger auf ein Laborpapier und drücken Sie vorsichtig darauf, um überschüssige Lösung zu entfernen und sicherzustellen, dass die Mikrogele in einer einzigen Schicht liegen. Erfassen Sie anschließend mit einem optischen Mikroskop mehrere Bilder der Mikrogele mithilfe eines DIC 100x-Ölobjektivs. Messen Sie die Mikrogele, um einen repräsentativen Durchmesser zu erhalten.

Berechnen Sie den Polydispersitätsindex unter Verwendung der hier gezeigten volumenbasierten Gleichung, wobei N die Gesamtanzahl der Mikrogele und VI das Volumen des Mikrogels ist. Um die durchschnittliche Dichte der Mikrogele zu bestimmen, stellen Sie zunächst Dextrinlösungen mit 7, 6, 5, 4, 3 und 1 % in deionisiertem Wasser her; die Dichten der Dextrinlösungen sind hier dargestellt. Geben Sie anschließend zwei Milliliter der 7-%-Dextrinlösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Danach langsam zwei Milliliter der 6%igen Dextrinlösung pipettieren, um eine deutliche Schicht über der 7%igen Dextrinlösung zu bilden. Nach fünf Minuten zwei Milliliter der nächsten Schicht aus 5%iger Dextrinlösung hinzufügen und auf diese Weise fortfahren, bis jede Dextrinkonzentration in abnehmender Reihenfolge geschichtet wurde. Anschließend die Mikrogele vorsichtig über die 1%ige Dextrinlösung schichten, den Gradienten bei fünf Grad Celsius mit 4.000 ×g zehn Minuten lang zentrifugieren.

Visualisieren Sie dann die Position der Mikrogele und berechnen Sie die Dichte der Mikrogele entsprechend ihrer Lage zwischen den Schichten. Um die Quellmasse der Mikrogele zu bestimmen, wiegen Sie zunächst ein Mikrozentrifugenröhrchen vor und geben anschließend ein Milliliter der Mikrogele hinzu. Waschen Sie die Mikrogele fünfmal mit jeweils deionisiertem Wasser, wobei zwischen jeder Waschung eine Zwischenschritt erfolgt.

Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 4.000 × g, um nach der letzten Waschung die Mikrogele zu pelletieren. Resuspendieren Sie sie in entionisiertem Wasser und lassen Sie sie mindestens 48 Stunden lang quellen. Nach 48 Stunden zentrifugieren Sie die aufgequollenen Mikrogele 10 Minuten bei 4.000 × g und entfernen anschließend sämtlichen Überstand.

Wiegen Sie die Probe anschließend und notieren Sie die Feuchtmasse. Nachdem eine genaue Feuchtmessung vorliegt, gefrieren Sie die Mikrogele bei minus 80 Grad Celsius und trocknen Sie sie gefriertrocknerisch, um das Wasser zu entfernen und die Trockenmasse zu erhalten. Sobald das gesamte Wasser sublimiert ist, berechnen Sie den Wassergehalt und den Polymergehalt in den Mikrogelelen mithilfe der hier gezeigten Gleichungen, wobei MS die Feuchtmasse der Mikrogele und MD die Trockenmasse ist.

Der durchschnittliche Durchmesser von PEG-Mikrogelen, die unter Verwendung verschiedener Molekulargewichte von 20 % PEG hergestellt wurden, ist hier dargestellt. Eine längere Bestrahlungsdauer mit UV-Licht beeinflusste ebenfalls den Durchmesser der Mikrogel. Mit zunehmender UV-Bestrahlungsdauer nahmen auch die Durchmesser der hier gezeigten drei Formulierungen zu.

Die durch Dextrin-Gradienten gemessene Dichte nahm mit steigendem Molekulargewicht der Vorläufer-PEG-Moleküle ab. Dies wird auch durch das Diagramm zum prozentualen Wassergehalt bestätigt, in dem sich zeigte, dass PEG mit höherem Molekulargewicht eine größere Menge Wasser pro Gramm Polymer enthielt. Schließlich wurde gezeigt, dass die Mikrogele mit fluoreszenzmarkiertem Protein beladen werden können, indem Albumin der Mischung vor der Polymerisation hinzugefügt wurde und so in den Kugeln eingeschlossen wurde.

Steigende Konzentrationen des fluoreszenzmarkierten Proteins erhöhten den Polydispersitätsindex der Sphären, aber die durchschnittliche Größe blieb konstant. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Lösungen auf 37 Grad Celsius zu erwärmen und die Mikrogele gut zu verwirbeln, um Aggregate während des Waschens und der Vorbereitung der Objektträger für die Bildgebung aufzulösen. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden zur Arzneimittelverkapselung durchgeführt werden, um weitere Fragen bezüglich der Wirkung der Arzneimittelfreisetzung zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PEG-DA-Mikrogele unter milden Bedingungen über Fällungsreaktionen herstellt.