Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fibrinbasierte Konstrukte zu schaffen, die zur Untersuchung der Zell- und Kollagenreorganisation verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst humane venöse Stammzellen aus Spendergewebe isoliert und in Kultur expandiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Velcro-Streifen auf flexible Membranen zu kleben.

Am Boden von sechs Well-Platten, um in der Mitte einen quadratischen Raum zu schaffen, der das Konstrukt aufnehmen wird. Als nächstes wird eine Mischung aus Fibrinogen-Thrombinzellen und fluoreszenzmarkierten Kügelchen in den Raum zwischen den Velcro-Streifen gegeben und polymerisiert gelassen, um ein Gel zu bilden. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu konditionieren und eine orientierte Matrixbildung zu induzieren, indem entweder eine einachsige zyklische Dehnung auf das Konstrukt angewendet oder statische Dehnung freigesetzt wird.

Indem Sie das Fibringel von den Velcro-Stiften in eine einzige Richtung abschneiden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Zell- und Kollagenreorganisation beschreiben, indem die Konstrukte über die Zeit mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie überwacht werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Kollagenumbaus zu beantworten, die sich auf die Geschwindigkeit der Kollagenbildung und -umorientierung durch verschiedene Zelltypen beziehen.

Zu Beginn wird humanes Spendergewebe aus der venösen Saana magna gemäß den Richtlinien für die Zweitverwendung des Materials gewonnen. Isolieren Sie dann die humanen venösen Stammzellen oder H-VSCs aus dem Gewebe, indem Sie dem Protokoll von Schnell et al. folgen, und lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff. Bei Bedarf expandieren Sie die Zellen, indem Sie ein Fläschchen mit 250.000 schnell auftauenden H-VSCs in einen T 75-Kolben mit 15 Millilitern Vorwarmwachstum geben.

Medium, bestehend aus 440 Millilitern fortgeschrittenem DMEM und 50 Millilitern fötalem Rinderserum. Fünf Milliliter 100 X Pen Streptokokken und fünf Milliliter 200 Millimolar L Schwemme max. Wechseln Sie das Wachstumsmedium etwa zwei Wochen lang alle zwei bis drei Tage, bis die Zellen zusammenfließen.

Sobald sie zusammenfließen, ernten und spalten Sie die Zellen bis zur Passage. Neun. Verwendung von Trypsin, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen für das geplante Experiment vorhanden ist. Für jedes Konstrukt werden ca. 1,5 Millionen Zellen benötigt.

Wenn eine ausreichende Anzahl von Zellen gezüchtet wurde, ernten Sie sie bei 90 % Co-Flüssigkeit und suspendieren Sie die Zellen dann in Wachstumsmedien bei 15 Millionen Zellen pro Milliliter. Legen Sie sie auf Eis, bis sie gebraucht werden. Bereiten Sie den Silikonkleber vor, indem Sie das Elastomer und das Härter im Verhältnis 10 zu eins mischen.

Verwenden Sie diesen Kleber, um sieben Millimeter mal drei Millimeter große Streifen, die sich von der weichen Seite des Velcro verfangen haben, an der flexiblen Membran von Flex-Cell-Platten zu befestigen. Um eine Kreuzform mit offenem Zentrum zu bilden, trocknen Sie den Silikonkleber über Nacht im Ofen bei 60 Grad Celsius, um eine Aushärtung des Klebers zu gewährleisten. Sterilisieren Sie dann die Platte, indem Sie fünf Milliliter 70%iges Ethanol in jede Vertiefung geben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit sterilem PBS. Entfernen Sie dann das PBS aus den Vertiefungen und den Velcro-Streifen. Legen Sie die Platte unbedeckt für 30 Minuten unter die UV-Lampe einer Gewebekulturhaube, um die Oberflächen zu sterilisieren.

Wenn Sie fertig sind, decken Sie die Platte ab und halten Sie sie bis zur Verwendung steril. Als nächstes bereiten Sie das Tissue-Engineering-Medium vor, indem Sie während der ersten sieben Tage der Kultur 130 Milligramm Allinsäure, zwei Phosphate zu 500 Millilitern Wachstumsmedium hinzufügen. Fügen Sie außerdem ein Milligramm pro Milliliter Epsilon-Aminocapronsäure hinzu, um zu verhindern, dass das Fibrin abgebaut wird, lösen Sie Fibrinogen auf eine Konzentration von 10 Milligramm tatsächlichem Protein pro Milliliter Tissue Engineering Medium auf, das mit Aminocapronsäure ergänzt wird, indem Sie es vorsichtig mischen.

Dann steril. Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis. Als nächstes bereiten Sie die Thrombinlösung vor, indem Sie Stammthrombin auf eine Endkonzentration von 10 internationalen Einheiten pro Milliliter in Tissue-Engineering-Medium verdünnen, das mit Aminocapronsäure ergänzt wird, und lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis.

Als nächstes werden 100 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Gewebekonstrukt vorbereitet, das hergestellt wird. Zentrifugieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei 350 mal G, verwerfen Sie dann den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern der Thrombinlösung und fügen Sie vier Mikroliter hinzu, eine blau fluoreszierende Polystyrol-Mikrosphäre, die als interne Referenzmarker verwendet wird. Als nächstes ziehen Sie 50 Mikroliter der Fibrinogenlösung in eine Pipettenspitze auf.

Erhöhen Sie das Volumen der Pipette auf 100 Mikroliter und pipettieren Sie dann die 50 Mikroliter Fibrinogenlösung in das Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie mit dem Thrombin-Zell-Gemisch Thrombin und Fibrinogen vorsichtig miteinander, indem Sie das 100-Mikroliter-Gemisch aufziehen, um Blasenbildung zu verhindern. Sobald die Lösung gründlich gemischt ist, pipettieren Sie die Gelmischung in und zwischen die Velcro-Streifen, wir sind schnell, wie die typische Gelierzeit für die Fibringele, sobald das Mischen in der Größenordnung von 20 Sekunden liegt, inkubieren Sie die Konstrukte für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-gepufferten Inkubator, damit sie gelieren können.

Geben Sie dann sechs Milliliter Tissue-Engineering-Medium mit Aminocapronsäure in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Tauschen Sie das Medium in den ersten sieben Tagen alle zwei bis drei Tage aus. Entfernen Sie nach einer Woche das Aminocapronsäure-Präparat aus dem Medium und fahren Sie mit der Kultivierung der Gele mit dem Tissue-Engineering-Medium fort.

Wenn es in den ersten fünf Tagen in Kultur immer noch alle zwei bis drei Tage ausgetauscht wird, können sich die Konstrukte unter statischer Belastung verdichten und reorganisieren und Kollagenfasern bilden, biaxial aufgrund der Faserbeschränkungen, um eine Kollagenreorganisation in eine einzige Richtung unter statischen Bedingungen zu induzieren. Kultivieren Sie die Zellen zunächst eine weitere Woche am Tag 12 und schneiden Sie das Gewebekonstrukt aus zwei Velcro-Streifen in eine Richtung ab. Dies führt zu einer Dehnung in die entgegengesetzte Richtung, da sich das Fibrin verdichtet.

Alternativ können Sie für eine zyklische Belastung die Platten auf einen Satz Ladepfosten in einer flexiblen Zellengrundplatte legen, die am sechsten Tag mit einer Dichtung ausgestattet ist. Die Ladepfosten stützen die flexible Membran der Vertiefungen und ermöglichen es, die Basis der Pfosten nach unten zu ziehen, um eine Dehnung in eine einzige Richtung zu erzeugen. Richten Sie als Nächstes das Softwareprotokoll so ein, dass eine zyklische Dehnung auf das Konstrukt angewendet wird. Das hier gezeigte Programm ist für eine intermittierende Dehnung, die einer Sinuswelle ähnelt, und spannt das Konstrukt von null auf 5 % Dehnung bei einem Hertz für Zeiträume von drei Stunden, abwechselnd mit drei Stunden Ruhe.

Schalten Sie bei vorbereitetem Programm die Vakuumpumpe ein und starten Sie das Programm. Der Regler regelt die Vakuumstärke im System, das an den Membranen um die Stützpfosten nach unten zieht, um die Konstruktionen gemäß dem Programm zyklisch zu belasten. Führen Sie das Programm eine Woche lang durch und achten Sie darauf, die Medien alle zwei bis drei Tage auszutauschen, nach einer Woche Konditionierung induzieren Sie eine Kollagenreorganisation, indem Sie den rechteckigen Stift um 90 Grad drehen, um die Richtung der Belastung für drei Tage zu ändern.

Um den aktiven Kollagenumbau in Echtzeit zu visualisieren, fügen Sie den Cell Tracker Orange hinzu. Eine Konzentration von vier Mikromolaren zur Färbung des Zytoplasmas und CNA 35 OG 4 88 zugeben. Fügen Sie eine Konzentration von einem Mikromolaren hinzu, um die Kollagenfasern sichtbar zu machen.

Diese Sonden beeinträchtigen weder die Lebensfähigkeit der Zellen noch die Kollagenbildung. Anschließend inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie nach der Inkubation die Kulturplatte aus dem Inkubator und transportieren Sie sie zu einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, um Zellen und Kollagen sichtbar zu machen.

Nehmen Sie Bilder der Gele an der Oberfläche und bis zu einem Durchmesser von etwa 60 Mikrometern in das Gerüst auf, um die Veränderungen in der Organisation auf diesen Ebenen im Laufe der Zeit zu sehen. Bringen Sie dann die Platte wieder in die mechanische Konditionierung im Inkubator zurück. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle paar Tage, um den Fortschritt der zellulären Reorganisation als Reaktion auf die Reize zu verfolgen.

Die fluoreszierenden Mikrosphären, die dem Fibrinogengemisch vor der Polymerisation zugesetzt werden, werden im Fibrinnetzwerk eingeschlossen und eignen sich gut als Referenzmarker, um die Visualisierung desselben Bereichs zu verschiedenen Zeitpunkten zu gewährleisten, wenn sie unter statischen Bedingungen kultiviert und an allen vier Stiften befestigt werden. Drei Tage nach dem Trimmen von zwei der Faserpfostenverbindungen ist keine echte Faser- oder Zellorientierung mehr zu sehen. Die durch die Kontraktion verursachte einachsige Dehnung hat die grün dargestellten Kollagenfasern ausgerichtet.

Humane venöse Stammzellen, die eine Woche lang zyklisch in eine einzige Richtung belastet wurden, sind hier an der Oberfläche des Konstrukts und 60 Mikrometer in das Gel hinein gezeigt. Wenn die Dehnungsrichtung um 90 Grad gedreht wurde, zeigte sich, dass die zelluläre Reaktion nach drei Tagen an der Oberfläche schneller war als im Kern des Gewebes. Sobald die Technik beherrscht ist, können diese FI-basierten Gewebekonstrukte in etwa zwei Stunden durchgeführt werden.