Name: Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T21:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie fibrinbasierte Gewebekonstrukte mit Myofibroblasten erstellt werden, um Kollagen-Reorganisation in Echtzeit zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht zerstörungsfreie Analysen für die Geweberegeneration.

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Diese Studie wurde im Rahmen des Forschungsprogramms der biomedizinischen Materialien (BMM) Institut durchgeführt. BMM wird vom niederländischen Ministerium für Wirtschaft, Landwirtschaft und Innovation kofinanziert. Der finanzielle Beitrag der Nederlandse Hartstichting gedankt.

1. Kultur der Menschenrechte Vena Saphena Cells <ol><li> Isolieren von Zellen, die Vena saphena magna, von einem Spender gemäß den Richtlinien für die Weiterverwendung Material erfasst, gemäß dem Protokoll von Schnell et al. 9 und speichert diese in flüssigem Stickstoff. Aus dem Teil der Vena saphena magna von einem Spender-Zuschnitte von 2 x 2 mm zur Kultur in einem Sechs-Well-Platte. Verwenden Sie 2 Stück pro Vertiefung. Im Allgemeinen genügend Zellen erhalten werden, um etwa 3 Ampullen mit 0,25 x 10 6 Zellen in flüssigem Stickstoff zu füllen. HVSCs als Myofibroblasten gekennzeichnet, durch die die Expression von Vimentin, keine Expression von Desmin und eine Subpopulation exprimieren α Glattmuskelaktin 10. Weiter starten Sie das Protokoll, um die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff aufgetaut, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen. </li><li> Legen Sie die Zellen aus einem Fläschchen in eine T75 Zellkulturflasche und fügen Wachstumsmedium (GM), bestehend aus Erweiterte DMEM, 50 ml fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin /Streptomycin und 5 ml L-Glutamax. Ändern Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Zellen wachsen etwa nach 14 Tagen konfluent. Shop 0,5 x 10 6 Zellen in einem Fläschchen in flüssigem Stickstoff, die als Durchgang 1. </li></ol> Hinweis: Das Einfrieren der Zellen ist nicht notwendig, wenn die Ernte HVSCs, ist aber ausschließlich für die Lagerung verwendet. <ol start="4"><li> Legen Sie die HVSCs aus einem Fläschchen in eine T175 Zellkulturflasche und fügen GM. Ändern Medium alle 2-3 Tage. Zellen wachsen nach ca. 7 Tage konfluent. Shop 3 x 10 6 Zellen in einem Fläschchen in flüssigem Stickstoff, die so genannte Passage 2. </li><li> Legen Sie die Zellen aus einem Fläschchen in eine rollerbottle und fügen GM. Ändern Medium alle 2-3 Tage. Zellen wachsen etwa nach 8 Tagen konfluent. Eine rollerbottle enthält etwa 20-30 x 10 6 Zellen. Kultur-Zellen bis zu Kanal 6. Verwenden Sie keine Zellen einer Passage über Kanal 9, da Zellphänotyp ändern kann. </li></ol&gt; 2. Engineering Fibrin-basierten Tissue Konstrukte <ol><li> Bereiten Silikonkleber durch Mischen des Elastomers mit dem Härter (10:1). Cut 7 x 3 mm rechteckige Segmente Klettverschluss. Kleben Sie das Klettband in einem 6-Loch-Zellkulturplatten mit flexiblen Membranen, eine Flanke zu bilden und einen eckigen Raum von 3 mm zwischen den Klettbändern verlassen. </li></ol> Hinweise: Verwenden Sie nur die weiche Seite des Velcro und das Gesicht dieser Seite nach oben. Beim Verkleben der Klettverschluss, decken nur den Klettverschluss mit Silikon kleben, kleben nicht im ganzen gut verteilt. Da die Kultur Platten Siliconmembran Böden haben, verwenden Sie etwas unterhalb des Well-Platte zur Verstärkung der flexiblen Membranen, leicht zu kleben, um die Platte zu gewährleisten. <ol start="2"><li> Trocknen der Silikonkleber über Nacht in einem Ofen bei 60 ° C, um Härtung des Klebers zu erreichen. Sterilisieren durch Zugabe von 70% EtOH in die Vertiefungen und Inkubation für 30 min. Spülen 3x mit PBS und entfernen Sie alle PBS aus der wells und der Klettverschluss. Setzen Sie unter UV für 30 min und bis zur Verwendung steril zu halten. </li><li> Bereiten Tissue Engineering Medium (TM), bestehend aus GM und 130 mg L-Ascorbinsäure-2-Phosphat. </li><li> 1 mg / ml ε-Aminocapronsäure (ACA) an die TM. ACA ist für den ersten 7 Tagen der Kultur verwendet, um das Fibrin aus erniedrigender 11 zu verhindern. Alternativ kann Aprotinin verwendet werden. </li><li> Um Klumpenbildung zu verhindern, erlauben Fibrinogen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen zu erreichen. Ohne Klumpen Fibrinogen wird leichter aufzulösen. Lösen Fibrinogen in einer Konzentration von 10 mg tatsächlichen Protein / ml TM 7 mit ACA ergänzt. Sterilfilter der Fibrinogen-Lösung, vielleicht mehrere Filter benötigt werden. Lagern auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> Hinweis: Um Fibrinogen vorsichtig mischen auflösen zu viel Schaumbildung verhindern. <ol start="6"><li> Lösen Thrombin in einer Konzentration von 10 IU / ml TM 7 mit ACA ergänzt. Lagern auf Eis bis zum Gebrauch. </li> &lt;/ Ol&gt; Hinweis: Lagerung auf Eis benötigt wird, um früh Gelierung von Thrombin und Fibrinogen zu verhindern. <ol start="7"><li> Trypsinize die Zellen, in GM und zählen erneut zu suspendieren. </li><li> Mit 15 x 10 6 Zellen / ml für die Aussaat die Fibrin-basierten Gewebe Konstrukte (Konzentration auf Methoden für das Tissue Engineering Herzklappen 7 basiert). Eine einzelne Gel besteht aus 100 ul gof el und damit von 1,5 x 10 6 Zellen. Setzen 1,5 x 10 6 Zellen in einem Zentrifugenröhrchen, was in vielen Zentrifugenröhrchen wie die Anzahl der Gele, die vorgenommen werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 xg für 7 min und den Überstand verwerfen. Die Zellen in 50 ul Thrombin. In 4 ul blau fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln zu dieser Suspension. Setzen Sie 50 ul von Fibrinogen in einem Fläschchen. Verwenden Sie eine Pipette zur Aufnahme der 50 ul Thrombin mit Zellen. Erhöhen Sie die Lautstärke der Pipette zu 100 ul. Pipettieren Sie die 50 ul Lösung von Thrombin mitZellen in das Fläschchen mit Fibrinogen zu mischen die Thrombin und Fibrinogen, und nehmen die 100 ul Mischung. </li></ol> Hinweis: Das fluoreszierende Polystyrol-Mikrokügelchen als interne Referenz-Markierungen zur Bildanalyse verwendet wird. Beim Mischen von Thrombin und Fibrinogen, verhindern die Bildung von Luftblasen durch vorsichtiges Pipettieren der Mischung. Luftblasen in Löcher im Fibringel führen. <ol start="10"><li> Pipettieren Sie die Gel-Gemisch in und zwischen den Klettbändern. Die typische Gelierzeit für die Fibrin-Gelen, wenn die Komponenten gemischt werden, ist in der Größenordnung von 20 Sekunden. </li></ol> Anmerkungen: Tun Sie dies so schnell wie möglich, um die Gelierung zu verhindern, bevor die Mischung in der Well-Platte pipettiert. Üben Sie vor Verwendung von Zellen und Perlen. <ol start="11"><li> Inkubieren Suspensionen für 30 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 95% Luft / 5% CO 2-Inkubator, um die Gelierung bevor Kultur TM mit ACA ermöglichen. </li><li> Ersetzen TM mit ACA alle 2-3 Tage für die ersten 7 Tage. Gele sind stabil genug, nach einer Woche ohne ACA kultiviert werden. Nach der ersten Woche ersetzen TM alle 2-3 Tage. In 6 ml TM pro Vertiefung. Am Tag 12 Zellen haben genügend Kollagen zur Visualisierung erzeugt. </li></ol> 3. Anwenden von Stamm und Inducing Änderungen in Stamm und Constraints <ol><li> Statische Belastung wird von den Zellen direkt durch Zellen Traktion und Verdichtung 12 angelegt. Um Kollagen Reorganisation zu induzieren, schneiden das Gewebe konstruieren lose aus zwei Klettbändern in eine Richtung. Dies führt zu Einschränkungen unidirektionalen (1A). Führen Sie diese am Tag 12, da das Konstrukt dann stabil genug und Kollagen abgelagert worden. </li><li> Anwenden zyklischen Beanspruchung durch Anlegen eines Vakuums an die Unterseite der Kulturplatten mit flexiblen Membranen unter Verwendung der Flexcell FX4000T System. Legen Sie die Platten auf einer Grundplatte, auf der Oberseite des Ladens Beiträge (die sind ein Teil der the zyklischer Belastung Gerät). Die Pumpe gilt ein Vakuum auf die Membran und damit zieht die Membran über dem rechteckigen Beitrag darunterliegenden. Durch die kreuzförmige Anhängen des Gewebes konstruiert, um die Membran (über den Klettverschluss) und die rechteckigen Beitrag die angelegte Spannung zyklisch uniaxial (1B). </li><li> Zunächst verwenden statischer Kultur für 5 Tage zu anfänglichen mechanischen Integrität zu erreichen, vor dem Aufbringen der zyklischen Belastung beginnend am 6. Tag. Programm ein cyclisches Fleck Protokoll in der Steuerung für die Vakuumpumpe. Zum Beispiel mit einem vorher festgelegten intermittierenden zyklischen Belastung Protokoll, mit einachsigen Richtung 13. Diese besteht aus einer intermittierenden Dehnung einer Sinuswelle mit 1 Hz, Pressen von 0 bis 5% Dehnung für die Dauer von 3 Stunden bei 3 h Ruheperioden abwechseln. Führen Sie diese zyklische Belastung Protokoll für 7 Tage, Induktion einer Organisation ausgerichtet Kollagen. </li><li> Typischerweise nach 12 Tagen HVSCs haben eine ausgerichtete Kollagen produziert organisaton. Nach einer ausgerichteten Kollagen Organisation erreicht wird, ändern die einachsigen zyklischen Belastung Richtung senkrecht zu der ursprünglichen Stamm Richtung. Tun Sie dies, indem Sie die rechteckigen Beiträge von 90 °. </li></ol> 4. Visualisierung von Zellen und Collagen <ol><li> Um eine aktive Echtzeit-Kollagen Umbau, Label Proben mit Sonden, die nicht mit der Lebensfähigkeit der Zellen oder die Bildung von Kollagen nicht stören zu visualisieren. Verwenden Sonden fluoreszierend Fleck Zytoplasma der Zelle und Kollagen. </li><li> Alternativ Erzeugung der zweiten Harmonischen mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet werden, um Kollagen-Strukturen mit Autofluoreszenz 14, mit einer Anregung bei 780 nm und Detektion zwischen 500-550 nm zu visualisieren. </li><li> Entfernen Sie die Kultur Platten aus dem Setup und dem Inkubator, der zyklisch gespannten Proben während der 3 Stunden Ruhezeit, und transportieren sie zu einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, um Zellen und Kollagen zu visualisieren. </li></ol>

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<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cellular+mechanotransduction+to+biologically+inspired+engineering%3A+2009+Pritzker+Award+Lecture%2C+BMES+Annual+Meeting+October+10%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das beschriebene Modell System der Zelle besiedelten Fibrin-Konstrukte hat ein großes Potenzial für die Untersuchung von Zell-und Kollagen (Re-) Organisation (de Jonge et al. 15), z. B. für das Tissue Engineering verwendet werden. Durch die Verwendung von Fibrin als anfängliche Zellträgers nach Fibrinabbauprodukten wird ein Gewebe mit Zellen und endogenen Matrix nur erstellt. Auf diese Weise werden die Zellen stimuliert, um auf Stress reagieren, entweder statisch oder zyklischer Natur, indem...

Herz-Kreislauf-Gewebe haben einen prominenten tragende Funktion. Insbesondere werden Inhalte und Organisation der Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix zu den tragenden Eigenschaften beitragen und dominieren insgesamt Gewebefestigkeit 1. In Tissue Engineering mechanische Konditionierung des Konstrukts verwendet wird - in der Regel bestehend aus (zyklisch) belasten Regimen - um Gewebe Organisation und mechanischen Eigenschaften 2,3 verbessern. Volles Verständnis von Stamm-induzierte Kollagen Organisation in komplexen Geometrien Gewebe zu Gewebe mit vordefinierten Kollagen Architektur zu schaffen, hat noch nicht erreicht worden. Dies ist vor allem aufgrund unseres begrenzten Wissens von Kollagen Umbau in entwickelnde Gewebe. Bestehende Modelle vor allem Aufschluss über die endgültige Nettoergebnis von Kollagen Umbau mit der Nutzung der statischen Belastung 4-6. Hier bieten wir eine sehr abstimmbaren Modellsystem, das die Studie von Kollagen (Re-) Organisation ermöglicht in einer Echtzeit-Mode, in 3D, unter dem Einflussstatische oder zyklische Belastung. Die Gewebe Konstrukte sind Fibrin-basierte, sicherzustellen, dass alle Kollagen in dem Konstrukt endogenen ist. Zell-und Kollagen-Organisation in den Konstrukten wird visualisiert, und eine interne Referenz-System ermöglicht es uns, Zellen und Kollagen-Strukturen für Zeitraffer-Analyse zu verlagern. In diesem Protokoll werden wir beschreiben die Verwendung des Modells für humane Vena Saphena Cells (HVSCs), da diese Zellen für ihre erhöhte extrazelluläre Matrix-Produktion und die Fähigkeit, die Matrix und unseren etablierten Einsatz in engineered kardiovaskulärem Gewebe 7 renovieren, sind bekannt auf der Arbeit von de Jonge et al. 8

<table><tbody><tr><td>Kulturkunststoff</td><td>Greiner</td><td></td><td>Enthält Kulturflaschen und Pipetten</td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer und Härter</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Velcro</td><td>Regulärer Laden</td><td>Sie können dies in einem regulären Geschäft kaufen, verwenden Sie nur die weiche Seite</td>Bioflex Kulturplatten Flexcell Int BF-3001U Unbehandelte L-Ascorbinsäure 2-Phosphatase Sigma A8960&epsilon;-Aminocaproinsäure Sigma-Aldrich D7754 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderthrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Rinderfibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>0,45 Spritzenfilter</td><td>Whatmann (Schleicher und Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>Blau fluoreszierend, 10 &mu; m Durchmesser</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>Enthält rechteckige Ladepfosten</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen Molekulare Sonden</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td> Mit <td>freundlicher Verfügung gestellt vom Labor für Makromolekulare und Organische Chemie, Department of Biomedical Engineering, Universität Eindhoven</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta Laser-Scanning-Mikroskop und Zwei-Photon-LSM-Modus</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Wird für die Zellisolierung benötigt</td></tr></tbody></table>

ingenieurwesen fibrin-basierten tissue konstrukte von myofibroblasten und anwendung von constraints und abseihen to cell und collagen (re) organisation induce

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen Inhalt und Organisation bei der Entwicklung kollagenen Gewebe kann durch lokale Stämme Gewebe und Gewebe Einschränkung beeinflusst werden. Tissue-Ingenieure sind bestrebt, diese Prinzipien zu verwenden, um Gewebe mit vordefinierten Kollagen Architekturen erstellen. Ein vollständiges Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse genauen Umbau von Kollagen, um die endgültige Architektur Gewebe steuern, jedoch fehlen. Insbesondere ist über die (Re-) Ausrichtung der Kollagenfasern in Reaktion auf Veränderungen im Gewebe mechanischen Beanspruchungen bekannt. Wir entwickelten ein in vitro-Modell, bestehend aus biaxial eingeschränkten myofibroblast ausgesät Fibrin-Konstrukte, die weitere Aufklärung Kollagen (re) Orientierung in Reaktion auf i) Rückgriff auf zweiachsigen einachsigen statischen Lastbedingungen und ii) zyklische einachsige Belastung des biaxial eingeschränkt Konstrukte vor und nach einer Änderung der Belastungsrichtung, unter Verwendung des Flexcell FX4000T Ladevorrichtung. Zeitraffer-konfokale Bildgebung verwendet wird, um visualize Kollagen (re) Orientierung in einer zerstörungsfrei. Zell-und Kollagen-Organisation in den Konstrukten können in Echtzeit visualisiert und eine interne Referenz-System ermöglicht es uns, Zellen und Kollagen-Strukturen für Zeitraffer-Analyse zu verlagern. Verschiedene Aspekte des Modells kann eingestellt werden, wie Zellquelle oder Verwendung von gesunden und kranken Zellen. Additive können zur weiteren aufzuklären zugrunde liegenden Kollagen Umbau werden, zum Beispiel durch Zugabe von MMPs oder Sperrung Integrine. Form und Größe des Konstrukts kann leicht an spezifische Bedürfnisse angepasst werden, was zu einer sehr abstimmbaren Modellsystem zur Zelle und Kollagen (Re-) Organisation zu studieren.

Dieses Modell ermöglicht zum Kultivieren Myofibroblasten ausgesät Fibringele. 1A zeigt ein Gewebe zunächst unter statischen Bedingungen biaxial kultiviert. Tissue-Einschränkungen werden durch Schneiden der Fibringel aus zwei Einschränkungen freigegeben, um statische einachsige Zwänge schaffen und Gewebe verdichtet und danach umbaut (Abbildung 1A). Für zyklische Belastung wird das Gewebe unter statischen Bedingungen kultiviert biaxial sowie. Nach 5 Tagen cyclischen uniaxiale Verformung a...

Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden.

Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus Fibrin bestehende Konstrukte herzustellen, die zur Untersuchung der Reorganisation von Zellen und Kollagen verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst humanes venöses Safenvenengewebe aus Spendergewebe isoliert und die Zellen in der Kultur vermehrt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Klettbandstreifen auf flexible Membranen zu kleben.Erstellen Sie am Boden von Sechs-Loch-Platten ein quadratisches Feld in der Mitte, das den Konstrukt hält. Anschließend wird eine Mischung aus Fibrinogen, Thrombin, Zellen und fluoreszenzmarkierten Kügelchen in den Bereich zwischen den Klettbandstreifen gegeben und zur Polymerisation in ein Gel überführt. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu konditionieren und eine orientierte Matrixbildung zu induzieren, indem entweder eine einachsige zyklische Dehnung auf den Konstrukt ausgeübt oder eine statische Dehnung abgebaut wird.Indem das Fibrin-Gel in einer einzigen Richtung von den Klettband-Ösen abgeschnitten wird. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der zellulären und kollagenen Neuausrichtung beschreiben, indem die Konstrukte mittels konfokaler Mikroskopie über die Zeit verfolgt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kollagen-Umbildung zu beantworten, insbesondere bezüglich der Geschwindigkeit der Kollagenbildung und -neuausrichtung durch verschiedene Zelltypen.Beginnen Sie damit, menschliches Spendergewebe aus der Vena saphena magna gemäß den Richtlinien für die sekundäre Verwendung von Material zu gewinnen. Isolieren Sie anschließend die humanen venösen Saphenazellen (H VSCs) aus dem Gewebe gemäß dem Protokoll von Schnell et al. und lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff. Wenn erforderlich, vermehren Sie die Zellen, indem Sie eine Ampulle mit 250.000 schnell aufgetauten H VSCs in einen T-75-Flasken mit 15 Milliliter vorgewärmtem Wachstumsmedium geben.Medium, bestehend aus 440 Milliliter Advanced DMEM, 50 Milliliter fötales Kälberserum, fünf Milliliter 100 X Pen/Strep und fünf Milliliter 200 Millimolar L-Glutamax. Wechseln Sie das Wachstumsmedium alle zwei bis drei Tage über einen Zeitraum von etwa zwei Wochen, bis die Zellen konfluent sind.Wenn sie konfluent sind, ernten und teilen Sie die Zellen bis zum Passagen.Nine unter Verwendung von Trypsin, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen für das geplante Experiment vorliegt. Für jeden Konstrukt werden ungefähr 1,5 Millionen Zellen benötigt.Wenn eine ausreichende Anzahl von Zellen gezüchtet wurde, ernten Sie diese bei 90 % Konfluenz und suspendieren Sie die Zellen in Wachstumsmedium mit 15 Millionen Zellen pro Milliliter. Stellen Sie sie bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie Silikonkleber vor, indem Sie das Elastomer und das Härtemittel im Verhältnis 10 zu 1 mischen.Verwenden Sie diesen Klebstoff, um sieben Millimeter mal drei Millimeter große Streifen, die von der weichen Seite des Klettbands abgeschnitten wurden, auf der flexiblen Membran von Flex-Cell-Platten anzubringen. Um eine Kreuzform mit offenem Zentrum zu erzeugen, trocknen Sie den Silikonklebstoff über Nacht bei 60 °C im Ofen, um eine vollständige Aushärtung des Klebstoffs sicherzustellen. Sterilisieren Sie anschließend die Platte, indem Sie fünf Milliliter 70 %igen Ethanol in jedes Loch geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit steriler PBS. Anschließend entfernen Sie die PBS aus den Vertiefungen sowie die Klettverschluss-Streifen. Stellen Sie die Platte ungefedert unter die UV-Lampe eines Zellkulturhauben für 30 Minuten, um die Oberflächen zu sterilisieren.Nach Fertigstellung die Platte abdecken und bis zur Verwendung steril aufbewahren. Als Nächstes das Gewebeingenieur-Medium herstellen, indem 130 Milligramm Allicinsäure und zwei Phosphat zu 500 Milliliter Wachstumsmedium während der ersten sieben Tage der Kultur hinzugefügt werden. Außerdem 1 Milligramm pro Milliliter Epsilon-Aminocapronsäure hinzufügen, um den Abbau von Fibrin zu verhindern, und Fibrinogen unter vorsichtigem Mischen auf eine Konzentration von 10 Milligramm tatsächlichem Protein pro Milliliter des mit Aminocapronsäure ergänzten Gewebeingenieur-Mediums auflösen.Dann steril. Filtern Sie die Fibrinogenlösung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie anschließend die Thrombinlösung vor, indem Sie das Thrombin-Stammgemisch in Gewebeengineering-Medium, das mit Aminocapronsäure ergänzt ist, auf eine Endkonzentration von 10 internationalen Einheiten pro Milliliter verdünnen, und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis.Als Nächstes 100 µL der zuvor hergestellten Zellsuspension für jeden herzustellenden Gewebe-Construct in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Die Zellen bei 350 × g für sieben Minuten zentrifugieren, anschließend den Überstand verwerfen, die Zellen in 50 µL der Thrombinlösung resuspendieren und vier µL blaue fluoreszierende Polystyrol-Mikrokügelchen, die als interne Referenzmarker dienen, hinzufügen. Danach 50 µL der Fibrinogenlösung in eine Pipettenspitze aufziehen.Erhöhen Sie das Volumen der Pipette auf 100 Mikroliter und pipettieren Sie dann die 50-Mikroliter-Lösung aus Fibrinogen in das Zentrifugenröhrchen. Mit der Thrombin- und Zellmischung mischen Sie vorsichtig Thrombin und Fibrinogen, indem Sie die 100-Mikroliter-Mischung aufsaugen, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Sobald die Lösung gründlich vermischt ist, pipettieren Sie das Gelgemisch schnell in und zwischen die Klettbandstreifen, da die typische Gelierzeit für Fibrin-Gels nach dem Mischen in der Größenordnung von 20 Sekunden liegt. Inkubieren Sie die Konstrukte 30 Minuten lang bei 37 °C in einem feuchten, mit 5 % Kohlendioxid gepufferten Inkubator, damit sie gelieren können.Gegeben Sie anschließend sechs Milliliter Gewebeengineering-Medium mit Aminocapronsäure in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage während der ersten sieben Tage. Nach einer Woche entfernen Sie die Aminocapronsäure-Zusatzsubstanz aus dem Medium und kultivieren die Gele weiterhin mit dem Gewebeengineering-Medium.Tauschen Sie das Medium weiterhin alle zwei bis drei Tage während der ersten fünf Tage der Kultur aus und lassen Sie die Konstrukte unter statischer Belastung kompakt werden und sich umorganisieren, wodurch sich Kollagenfasern bi-axial bilden, bedingt durch die Faserbeschränkungen, um unter statischen Bedingungen eine Umorganisation des Kollagens in eine einzige Richtung zu induzieren. Kultivieren Sie die Zellen zunächst für eine zusätzliche Woche bis zum Tag 12, schneiden Sie das Gewebekonstrukt dann in einer einzigen Richtung von zwei Klettverschluss-Streifen los. Dies führt zu einer Belastung in entgegengesetzter Richtung, während sich das Fibrin verdichtet.Alternativ können für zyklische Belastungen die Platten am sechsten Tag auf eine Reihe von Belastungsstiften in einer Flex-Cell-Basisplatte mit Dichtung platziert werden. Die Belastungsstifte stützen dann die flexible Membran der Vertiefungen und ermöglichen, dass die Basis der Stifte nach unten gezogen wird, um eine einachsige Dehnung zu erzeugen. Anschließend wird das Softwareprotokoll eingerichtet, um eine zyklische Dehnung auf den Konstrukt zu applizieren. Das hier gezeigte Programm erzeugt eine intermittierende, sinuswellenartige Belastung, bei der der Konstrukt für jeweils drei Stunden von null auf 5 % Dehnung bei einer Frequenz von einem Hertz belastet wird, abwechselnd mit dreistündigen Ruhephasen.Wenn das Programm vorbereitet ist, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und starten Sie das Programm. Die Steuerung reguliert die Vakuumstärke im System, wodurch die Membranen um die Stützpfosten herabgezogen werden, um den Konstrukten gemäß dem Programm zyklische Dehnung auszuüben. Führen Sie das Programm eine Woche lang durch und wechseln Sie dabei alle zwei bis drei Tage das Medium. Nach einer Woche Konditionierung induzieren Sie eine Neuausrichtung des Kollagens, indem Sie den rechteckigen Pfosten um 90 Grad drehen, um die Dehnungsrichtung für drei Tage zu ändern.Um eine aktive Echtzeit-Kollagenremodellierung sichtbar zu machen, geben Sie Cell Tracker Orange hinzu. Verwenden Sie eine Konzentration von vier Mikromolar, um das Zytoplasma anzufärben, und CNA 35 OG 4 88. Verwenden Sie eine Konzentration von einem Mikromolar, um die Kollagenfasern sichtbar zu machen.Diese Sonden beeinträchtigen weder die Zellviabilität noch die Kollagenbildung. Anschließend die Zellen eine Stunde lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Kulturplatte aus dem Inkubator nehmen und zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie bringen, um Zellen und Kollagen sichtbar zu machen.Nehmen Sie Bilder der Gele an der Oberfläche und bis zu etwa 60 Mikrometer in das Gerüst hinein auf, um die Veränderungen der Organisation auf diesen Ebenen im Zeitverlauf zu verfolgen. Danach bringen Sie die Platte zurück in die mechanische Belastungseinrichtung innerhalb des Inkubators. Wiederholen Sie dieses Verfahren alle paar Tage, um den Fortschritt der zellulären Neuausrichtung als Reaktion auf die Stimuli zu überwachen.Die fluoreszierenden Mikrokügelchen, die der Fibrinogenmischung vor der Polymerisation hinzugefügt wurden, sind in das Fibrinnetzwerk eingeschlossen und eignen sich gut als Referenzmarkierungen, um unter statischen Kultivierungsbedingungen und bei Befestigung an allen vier Stiften die Visualisierung desselben Bereichs zu verschiedenen Zeitpunkten sicherzustellen. Drei Tage nach dem Durchtrennen von zwei der Stiftenverbindungen ist keine wirkliche Orientierung von Fasern oder Zellen erkennbar. Die uniaxiale Dehnung, verursacht durch Kontraktion, hat die grün dargestellten Kollagenfasern ausgerichtet.Hier werden humane venöse Safenvenen-Zellen gezeigt, die eine Woche lang zyklisch in eine einzige Richtung gedehnt wurden, und zwar an der Oberfläche des Konstrukts sowie 60 Mikrometer tief im Gel. Als die Dehnungsrichtung um 90 Grad gedreht wurde, erwies sich die zelluläre Reaktion nach drei Tagen an der Oberfläche als schneller als im Kern des Gewebes. Sobald die Technik beherrscht ist, können diese auf FI basierenden Gewebekonstrukte innerhalb von etwa zwei Stunden hergestellt werden.

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