Name: Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Scherhaft-Karten mit SynVivo synthetischen mikrovaskulären Netzwerken aus einem einzigen Experiment erzeugen. Diese Methode spart Zeit und Reagenzien im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.

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SynVivo Technologie wurde unter dem Förder # 2R44HL076034 vom NHLBI entwickelt.

1. Auffüllen der SynVivo-SMN Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Jeder Port (Einlass / Auslass) der Vorrichtung besteht aus zwei parallelen Ports umfaßt - eine für Oberflächenbeschichtungseinheiten fließt (Adhäsionsmoleküle, Wachstums Matrizen, etc.) und / oder Zellen zum Impfen und die andere für die Testdurchführung (1A ). </li><li> Komplett Tauchen Sie das SynVivo-SMN Mikrofluidik-Vorrichtung (Abbildung 1B) in einer Petrischale sterilem deionisiertem (DI), das Wasser und die Schale in einen Vakuumtrockenschrank. Erlauben der Exsikkator ausgeführt, bis die gesamte Luft aus den Kanälen der Vorrichtung entfernt. Dies sollte etwa 15 Minuten dauern. </li><li> Bevor Sie das Gerät aus dem Wasser, legen Tygon-Schlauch (OD von 0,06 &quot;und ID von 0,02&quot;) mit Wasser vorbereitet in jedes Port des Gerätes mit feinen Punkt Pinzette. Der Schlauch sollte etwa 1 cm lang sein. Das Gerät kann nun aus dem Wasser entfernt werden. 1C zeigt Bild des DevicE mit dem Schlauch. </li></ol> 2. Beschichtung der mikrofluidischen Vorrichtung mit gewünschten Protein (z. B. Avidin) <ol><li> Mit einer Pipette einen Tropfen Wasser (etwa 100 ul), um die Basis des einen Einlaßanschlußschlauch. Den Schlauch mit dem Gerät verwendet prime vorsichtig entfernen. Der Wassertropfen wird Luft in das Gerät zu verhindern. </li><li> Bereiten einer 1 ml Spritze mit Avidin beladen in einer Konzentration von 20 ug / ml. Schließen Sie die Spritze zu einer 24 G Nadel aus Edelstahl und Schläuche. Stecken Sie den Schlauch an einer der Einlassöffnungen des Gerätes. Klemmen Sie die Einlassöffnung nicht mit einem Backenschelle eingesetzt. </li><li> Injizieren Avidin bei einer Flussrate von 1 &amp;mgr; l / min für 10 Minuten, um eine vollständige Perfusion der Vorrichtung zu ermöglichen. Am Ende des Durchflusszeit, klemmen Sie den Schlauch mit dem Kieferklemme und stellen Sie das Gerät bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 3. Mitteln des biotinylierten Partikel Haftung für Experimente <ol><li> Lassen Sie das Gerät anauf Raumtemperatur kommen. Stellen Sie das Gerät auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne und einem Hochleistungs-Kamera ausgestattet. </li><li> Eine Lösung von 2 um biotinylierten Partikel in einer Konzentration von 5 x 10 6 Partikeln / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Laden der Teilchen in einer 1 ml-Spritze. Bereiten Sie eine zweite 1-ml-Spritze von nur PBS. Legen Sie jede Spritze auf eine Spritzenpumpe und eine Verbindung zu Nadel und Schläuche. </li><li> Mit einer Pipette einen Tropfen Wasser (etwa 100 ul), um die Basis des Einlasses Schläuche. Den Schlauch zu beschichten das Gerät verwendet, vorsichtig entfernen. Der Wassertropfen wird Luft in das Gerät zu verhindern. </li><li> Vorsichtig den Schlauch für biotinylierten Teilchen und PBS aus Schritt 3.2 in jede der Einlassöffnungen. 2A zeigt Bild von der Set-up. </li><li> Einspritzen beginnen biotinylierten Partikel mit einer Durchflussrate von 2,5 ml / min. Überwachung der Einlaßöffnung auf dem Mikroskop. Beim ersten Anzeichenvon Partikeln, beginnen Sie den Timer und Fluss weiterhin für 3 min. </li><li> Am Ende der 3 min, Auslaufen des biotinylierten Partikel, während gleichzeitig die Strömung des starren PBS bei einer Flussrate von 2,5 ml / min. Lassen PBS in der Einrichtung für 3 min fließen zu waschen ungebundene Partikel. </li></ol> 4. Erwerb von Bildern und Erstellen Area of ​​Interest (AOI) Messungen mit Imaging-Software (NIKON Elements) <ol><li> Mit der Funktion &quot;Scan-große Bild&quot; in der Imaging-Software, um das Bild der gesamten Einrichtung zu erwerben. </li><li> Nacheinander die Anzahl Gabelungen im Gerät und eine kreisförmige AOI mit der doppelten Durchmesser der Kanäle. In diesem Fall den AOI Durchmesser bis 200 um, da die Kanaldurchmesser beträgt 100 um. </li><li> Verwenden Sie die automatisierte Zählung Funktion in der Bildbearbeitungssoftware, um die Anzahl der Teilchen in jedem AOI in eine MS Excel-Tabelle exportieren. </li><li> Ebenso nutzen die automatisierte Zählung-Funktion, um die Anzahl der Teilchen in der gesamten exportierenGerät. </li></ol> 5. Particle Flux Analyse mit Computational Fluid Dynamics (CFD) Modelle <ol><li> CFD-Simulationen werden mit kommerziell erhältlicher Software (CFD-ACE +, Inc. ESI) für den SynVivo-SMN Gerätetopologie laufen. Die Ergebnisse werden in einer Datenbank zur Analyse von experimentellen Beobachtungen gespeichert. Die Simulationsergebnisse speichern Informationen über Wandscherraten, Geschwindigkeit, Partikelfluss und Haftung im Gerät. </li><li> Die Simulationsergebnisse werden verwendet, um die Anzahl der Partikel, die in jeder AOI basierend auf einem gegebenen Eintrittspartikelkonzentration zu bestimmen. </li></ol> 6. Genescherhaft Karte <ol><li> Berechnen% der Adhäsion durch Dividieren der anhaftenden Teilchen in der Gabelung von den in der Verzweigung, wie in Gleichung 6.1 gezeigt fließenden Teilchen. <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" /> wobei die Anzahl der Partikel haftet und den fließenden Teilchen aus p erhaltenrotocol Schritte 4.3 und 5.2 auf. </li><li> Zeichnen Sie die Scherfestigkeit Karte mit der Scherrate bei jeder Gabelung der von der Datenbank in Schritt (5.1) erhalten Netze und die aus Gleichung 6.1% erhalten Haftwerte. </li></ol>

<ol><li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li>
<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li>
<li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li>
<li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li>
<li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+distribution+during+sepsis%3A+an+experimental+study+on+the+interdependence+of+cell+activation%2C+shear+stress+and+endothelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury.</a> Crit Care. 14, 201(2010).</li>
<li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li>
<li>Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-selectin+binding+by+polyacrylamide-based+conjugates+under+defined+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions.</a> Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+significance+of+adhesion+molecules+on+cultured+endothelial+cells+in+response+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation.</a> Microcirculation. 8, 355-364 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunology. 2, 9(2001).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+cell+adhesion+by+combination+of+surface+chemistry+and+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography.</a> Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).</li>
<li>Qian, T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro%2Fnano-fabrication+technologies+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Micro/nano-fabrication technologies for cell biology.</a> Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).</li>
<li>Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+top-down+and+bottom-up+surface+nanofabrication%3A+techniques%2C+applications+%26+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects.</a> Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).</li>
<li>Rosano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcations%3A+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li>
</ol>

Veröffentlichungsgebühr für diesen Artikel von CFD Research Corporation gesponsert.

Parallelplattenflusskammer und bietet wesentliche Erkenntnisse über Zell-Zell-und Zell-Teilchen-Wechselwirkungen, leiden unter mehreren Einschränkungen wie hoher Verbrauch an Reagenzien und die Notwendigkeit für mehrere Versuchsdurchläufe, um eine Scherhaft Karte zu erzeugen. Die Verwendung von synthetischen Mikrovaskuläre SynVivo-Netzwerke (SynVivo-SMNS) ermöglicht die Erzeugung einer Scherhaft Karte aus einem einzigen Experiment unter Bedingungen in vivo-Bedingungen nachahmen. Zusätzlich wird deutliche Einspa...

Aktuelle Assays auf Zell-Zell-und Zell-Teilchen-Wechselwirkungen untersuchen typischerweise statische Well-Plattenformat, in welchem ​​Teilchen oder Zellen auf Protein-Matrices oder adhärente Zellen inkubiert. Am Ende der angegebenen Inkubationszeit werden die Zahlen der anhaftenden Teilchen oder Zellen unter Verwendung von 1-Mikroskopie quantifiziert. Auch wenn diese Untersuchungen liefern wichtige Einblicke in die biochemischen Prozesse hinter dieser Wechselwirkungen ist eine wesentliche Einschränkung, der Mangel an physiologischen Flüssigkeitsstrom (typisch für die Mikrozirkulation) und ihre Auswirkungen auf die Partikelhaftung. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden in-vitro-Strömungskammern in den letzten Jahren entwickelt worden. Ein gemeinsames Element dieser Strömungskammern ist ein transparentes Gerät bei niedrigen Reynolds-Zahlen an der Wand der Blutgefäße in vivo 2 beobachtet Scherraten entsprechen durchblutet. Die Behälterwand wird entweder durch Beschichtung von Biomolekülen oder das Wachstum von Zellen auf einer Oberfläche des Strömungs c modelliertHamber 3. Partikel oder Zellen 4-7 8-16 werden dann flossen bei gewünschten Durchsatzbereich, die Anzahl der anhaftenden Partikeln unter verschiedenen Scherraten zu quantifizieren. Jedoch ist die Verwendung von parallelen Plattenströmungskammern zu studieren und zu validieren die biochemische Phänomene ziemlich teuer und zeitaufwendig. Dies ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass mehrere Versuche benötigen, um zum Erzeugen einer Karte von der Fluidscher gegen die Anzahl der Partikel / Zellen haften geführt werden. Außerdem Platte Strömungskammern erfordern große Mengen von Reagenzien aufgrund ihrer Größe (Höhe&gt; 250 um und einer Breite von&gt; 1 mm). Schließlich sind diese Geräte nicht genau modellieren geometrische Merkmale (zB Bifurkationen) und Durchflussbedingungen (z. B. gegen konvergierenden divergierenden Ströme), die in vivo vorhanden sind. Jüngste Fortschritte in der Lithographie Mikro 17-19 haben den Bereich der Lab-on-a-Chip beschleunigtGeräte 20-21. Diese Geräte waren maßgeblich an der Entwicklung eines miniaturisierten Version der Parallelplattenlaufkammer mit Abmessungen im Mikrometerbereich. Die Reduzierung der Dimension ergibt auch erhebliche Vorteile in Bezug auf die Mengen von Reagenzien, Zellen oder Partikel für die Experimente erforderlich. Eine wesentliche Einschränkung, die derzeit erhältlichen Vorrichtungen ist jedoch die Verwendung von linearen Kanälen Mikrogefäßen, die den in vivo beobachteten komplexen Mikrogefäß nicht zu imitieren ist modellieren. Wir haben kürzlich ein neues Verfahren zur Wieder mikrovaskulärer Netzwerke auf Einweg-Kunststoffsubstraten, was zu synthetischen Darstellung der in vivo-Bedingungen entwickelt. Diese Geräte bezeichnet SynVivo-Synthetic mikrovaskuläre Networks (SMN) werden mit PDMS-basierte Soft-Lithographie-Prozess entwickelt. SynVivo SMN-Geräte können verwendet werden, um die Scherhaft Karte von Zell / Partikelhaftung 22 zu erhalten, Studien gezielten Wirkstofftransport und 23 have gegen in-vivo-Daten 24-25 validiert. In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll, dass die Erzeugung der Schubhaft Karte aus einem einzigen Experiment in Volumen so klein wie 1-5 ul was zu erheblichen Einsparungen von Ressourcen und Zeit ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>SynVivo-SMN</td><td>CFD Research</td><td>SMN-001</td><td>Exklusiv bei CFDRC</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>Jede Avidin Quelle ist für diesen Assay geeignet</td></tr><tr><td>Biotinylierte Partikel</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>Jede Quelle für biotinylierte Partikel ist für den Assay geeignet</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>Die Größe ist typisch für die Verwendung mit SynVivo-SMN</td></tr><tr><td>NIKON Elements</td><td>NIKON Instruments</td><td>N/A</td><td>Jede andere Bildgebung Software kann verwendet werden</td></tr></tbody></table>

erzeugung von scherhaft karte mit synvivo synthetische mikrovaskuläre networks

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Handy / Partikelhaftung Tests sind entscheidend für das Verständnis der biochemischen Interaktionen in Krankheit Pathophysiologie beteiligt und haben wichtige Anwendungen in der Suche nach der Entwicklung neuartiger Therapeutika. Tests mit statischen Bedingungen nicht um die Abhängigkeit der Haftung auf Scher erfassen, was ihre Korrelation mit in vivo-Umgebung. Parallelplattenflusskammern, die die Haftung unter physiologischen Fluidstrom zu quantifizieren müssen mehrere Experimente zur Erzeugung einer Scherhaft Karte. Darüber hinaus müssen sie nicht unbedingt die in vivo-Skala und Morphologie und erfordern große Volumina (~ ml) Reagenzien für die Experimente. In dieser Studie zeigen wir die Erzeugung von Scherhaftung Karte aus einem einzigen Experiment unter Verwendung einer mikrovaskulären Netzwerk basierend Mikrofluidikvorrichtung SynVivo-SMN. Das Gerät erstellt die komplexen in vivo Gefäßsystem einschließlich geometrischen Maßstab, morphologische Elemente, Strömungsmerkmale und zellulären Interaktionen in einIn-vitro-Format, wodurch eine biologisch realistische Umgebung für grundlegende und angewandte Forschung in Zellverhalten, Drug Delivery und Drug Discovery. Der Test wurde durch die Untersuchung der Wechselwirkung der 2 um Biotin-beschichteten Teilchen mit Avidin-beschichteten Oberflächen der Mikrochip gezeigt. Der gesamte Bereich der Scherung in der Mikrovaskulatur beobachtet in einem einzelnen Assay ermöglicht Adhäsion gegenüber der Scher Karte für die Partikel unter physiologischen Bedingungen erhalten wird.

1A zeigt eine schematische und eine helle Bildfeld SynVivo SMN-Gerät. 1B zeigt die SynVivo SMN-Gerät auf einem Glasträger montiert. 1C zeigt das Gerät mit folgenden Rohr im Vakuumtrockenschrank Grundierung mit Wasser. 2A zeigt ein Bild der Versuchs-Einrichtung. 2B zeigt eine typische Avidinbeschichtete SynVivo SMN-Gerät nach der Bindung von 2 um biotinylierten Partikel. Beachten Sie, dass Partikel bevorzugt ...

Strömungskammern, die in Adhäsionsexperimenten verwendet werden, bestehen typischerweise aus linearen Strömungswegen und erfordern mehrere Experimente mit unterschiedlichen Durchflussraten, um eine Scherhaftungskarte zu erzeugen. SynVivo-SMN ermöglicht die Erstellung einer Scheradhäsionskarte mit einem einzigen Experiment unter Verwendung von Mikrolitervolumen, was zu erheblichen Einsparungen bei Zeit und Verbrauchsmaterialien führt.

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe synthetischer mikrovaskulärer Netzwerke eine reine Adhäsionskarte der Zellpartikeladhäsion aus einem einzigen Experiment zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst das mikrofluidische Gerät mit dem gewünschten Protein – in diesem Fall Avadon – beschichtet wird. Im zweiten Schritt werden biotinylierte Partikel bei physiologischen Scherraten in das Gerät injiziert, die je nach lokalen Scherraten in unterschiedlichen Mustern an das mit Avadon beschichtete Gerät binden.Anschließend wird die Anzahl der gebundenen Partikel gezählt, um mithilfe einer computergenerierten Datenbank von Scherratenwerten im Netzwerk eine Scheradhäsionskarte der Partikel zu erstellen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Scheradhäsionskarte aus einem einzigen Experiment gewonnen werden kann, was im Vergleich zu herkömmlichen Parallelplatten-Flusskammern eine erhebliche Einsparung an Zeit und Reagenzien bedeutet. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden, wie linearen Flusskanälen, liegt darin, dass wir aus einem einzigen Experiment gemeinsame Karten generieren können, was zu erheblichen Einsparungen bei Kosten und Zeit führt.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelabgabe beantworten, beispielsweise die Fähigkeit der Arzneimittelabgabesysteme, an die gewünschten Zielstrukturen zu binden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Paddelplatten-Flusskammern verwendeten, um zelluläre Läsionen zu untersuchen. Im vorliegenden Assay liegt der Schwerpunkt jedoch darauf, grundlegende Einblicke in die Adhäsion von Partikeln und Zellen unter Flüssigkeitsbedingungen zu gewinnen.Die Syn-vivo-Plattform kann auf eine Vielzahl weiterer Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Krebs- und ZNS-Transport, Infektion und Entzündung, Thrombose sowie Mikrozirkulationsstörungen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte mit dem mikrofluidischen Gerät schwer zu erlernen sind, die Gewöhnung an kleine Probenvolumina sowie die bewährten Verfahren zur Vermeidung von Blasenbildung visuell besser vermittelt werden können. Die Durchführung der Methode demonstriert Ashley Smith, eine Wissenschaftlerin aus unserem Labor.Die mikrofluidische Vorrichtung SynVivo SMN besteht aus zwei Sätzen paralleler Anschlüsse, von denen einer zum Zuführen von Oberflächenbeschichtungen, Molekülen und/oder Zellen zum Ansiedeln dient und der andere für die Durchführung des Assays verwendet wird. Beginnen Sie damit, die Vorrichtung vollständig in eine Petrischale mit steriler entionisierter Wasser zu tauchen, und stellen Sie die Schale in ein Vakuum. Trocknen Sie sie, indem Sie das Trocknen so lange laufen lassen, bis die gesamte Luft aus den Kanälen der Vorrichtung entfernt ist.Das sollte etwa 15 Minuten dauern, bevor das Gerät aus dem Wasser genommen wird. Verwenden Sie feine Pinzette, um Tigon-Schläuche, die mit Wasser vorgefüllt sind, in jeden Anschluss des Geräts einzuführen. Die Schläuche sollten etwa einen Zoll Länge haben.Das Gerät kann nun mit einer Pipette oder Spritze aus dem Wasser entfernt werden. Geben Sie einen Tropfen Wasser um die Basis eines Einlassport-Schlauchs. Entfernen Sie den Schlauch vorsichtig.Der Wassertropfen verhindert, dass Luft in das Gerät gelangt. Bereiten Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze vor, die mit Avadon in einer Konzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter gefüllt ist. Verbinden Sie die Spritze mit einer 24-Gauge-Edelstahlnadel und klemmen Sie den nicht verwendeten Einlassanschluss mit einer Backenklemme ab.Schieben Sie den Schlauch in die Einlassöffnung des Geräts. Injizieren Sie Avadon mit einer Flussrate von einem Mikroliter pro Minute für 10 Minuten, um eine vollständige Perfusion des Geräts zu ermöglichen. Am Ende der Flusszeit.Blockieren Sie alle Schläuche mit Klemmen und stellen Sie das Gerät über Nacht auf vier Grad. Lassen Sie das Gerät auf Raumtemperatur anwärmen. Anschließend platzieren Sie das Gerät auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop, das mit einem motorisierten Objekttisch und einer Hochleistungskamera ausgestattet ist.Stellen Sie eine Lösung aus zwei Mikrometer großen biotinylierten Partikeln mit einer Konzentration von 5 Millionen Partikeln pro Milliliter in Phosphatpufferlösung oder PBS her. Füllen Sie die Partikel in eine Ein-Milliliter-Spritze. Bereiten Sie eine zweite Ein-Milliliter-Spritze mit PBS vor.Befüllen Sie jede Spritze nur, setzen Sie sie in eine Spritzenpumpe ein und verbinden Sie sie anschließend mithilfe einer Pipettierspritze mit Nadel und Schlauch. Geben Sie einen Tropfen Wasser um die Basis des Eingangsschlauchs und entfernen Sie vorsichtig den Schlauch, der zum Beschichten des Geräts verwendet wurde. Führen Sie den Schlauch für biotinylierte Partikel und den für PBS vorsichtig in jeden Eingangsanschluss ein.Danach beginnen Sie mit der Injektion biotinylierter Partikel mit einer Flussrate von 2,5 Mikrolitern pro Minute. Überwachen Sie den Einlassanschluss am Mikroskop, sobald die ersten Partikel sichtbar werden. Starten Sie die Stoppuhr und führen Sie den Fluss weitere drei Minuten lang fort.Am Ende der drei Minuten stoppen Sie den Fluss der biotinylierten Partikel, während gleichzeitig der Fluss von PBS mit einer Flussrate von 2,5 Mikrolitern pro Minute gestartet wird. Lassen Sie PBS drei Minuten lang durch das Gerät fließen, um nicht gebundene Partikel abzuwaschen. Um die Aufnahme zu beginnen, verwenden Sie die Funktion „Großes Bild scannen“ in der Bildgebungssoftware, um ein Bild des gesamten Geräts aufzunehmen, nummerieren Sie anschließend nacheinander die Verzweigungen im Gerät und erstellen Sie einen kreisförmigen interessierenden Bereich mit dem doppelten Durchmesser der Kanäle.Stellen Sie in diesem Fall den Durchmesser des interessierenden Bereichs auf 200 Mikrometer ein, da der Kanaldurchmesser 100 Mikrometer beträgt. Verwenden Sie die automatische Zählfunktion in der Bildverarbeitungssoftware, um die Anzahl der Partikel in jedem interessierenden Bereich in eine Tabellenkalkulation zu exportieren. Nutzen Sie ebenso die automatische Zählfunktion, um die Anzahl der Partikel im gesamten Gerät zu exportieren.CFD-Simulationen werden durchgeführt, und die Ergebnisse werden zur weiteren Analyse in einer Datenbank gespeichert. Die in den Ergebnissen enthaltenen Informationen umfassen Wandschergeschwindigkeiten, Geschwindigkeitspartikelstrom und Adhärenz an der Vorrichtung. Mithilfe dieser Informationen wird die Anzahl der Partikel bestimmt, die sich bei einer definierten Eingabe einer Partikelkonzentration in jedem interessierenden Bereich anlagern.Um eine Scherhaftkraftkarte zu erstellen, berechnen Sie als letzten Schritt den Prozentsatz der Adhäsion, wie im Textprotokoll beschrieben. Zeichnen Sie die Scherhaftkraftkarte unter Verwendung der Scherrate an jeder Verzweigung der Netzwerke und der Prozentsatz-Adhäsionswerte auf. Dieses Bild zeigt ein typisches Avidin-beschichtetes syn-vivo-SMN-Gerät nach Bindung zweimikroniger biotinylierter Partikel.Beachten Sie, dass Partikel bevorzugt in der Nähe der Verzweigungen im Netzwerk haften. Die nummerierten Verzweigungen im syn-vivo-SMN-Netzwerk sind hier zu sehen. Diese Abbildung zeigt die Beispiel-Wandschubspannungsverteilung, die durch das CFD-Modell des Geräts erzeugt wurde.Die Schergeschwindigkeit variiert in der Vorrichtung zwischen 250 inversen Sekunden und 15 inversen Sekunden, wie sie in der Mikrozirkulation in vivo beobachtet wird. Beachten Sie, dass diese unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten in linearen mikrofluidischen Kanälen nicht gleichzeitig erzielt werden können, da letztere für jede Durchflussrate eine konstante Schergeschwindigkeit liefern. Der hier dargestellte Plot der Schergeschwindigkeitswerte an jeder Verzweigung des Netzwerks zeigt, dass die Muster der Schergeschwindigkeit komplex sind und sich im Gegensatz zu linearen Strömungskanälen nicht durch eine einfache analytische Beziehung beschreiben lassen.Außerdem sind mehrere Verzweigungen im Netzwerk vorhanden, die in dieselbe Scherratenklasse fallen, was die statistische Aussagekraft der dargestellten Daten erhöht. Hier sind beispielhafte Ergebnisse der CFD-Analyse für Teilchenströme im Netzwerk, die zur Berechnung der Teilchenströme in den Ästen und Verzweigungen des experimentellen Netzwerks verwendet werden.Die aus einem einzigen syn vivo SMN-Experiment berechnete Scheradhäsionskarte folgt der inversen Beziehung, die auch bei Scheradhäsionskarten aus linearen Kanalexperimenten beobachtet wird. Mit einem SynVivo-Assay ermöglicht jedoch ein einzelnes Experiment die Erstellung dieser Scherkarte, während mehrere experimentelle Durchläufe für die linearen Kanäle erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man SynVivo-SMN-Geräte verwendet, um die geteilte Adhäsion aus einem einzigen Experiment zu erzeugen.Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, darauf zu achten, keine Bläschen in das SynVivo SMN-Mikrofluidikgerät einzubringen, nachdem es entwickelt wurde. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Entzündungsforschung den Weg, um die Interaktion zwischen Leukozyten und Endothel bei unterschiedlichen Scherraten in einem einzigen Experiment zu untersuchen. In der nächsten Gerätegeneration können Forscher die Wälzadhäsion und Migration von Leukozyten in einem einzigen Assay untersuchen, was derzeit noch nicht möglich ist.Mit dieser Methode können weitere Verfahren zur Untersuchung der Adhäsion von Wirkstoffen, Wirkstoffträgern und Zellen durchgeführt werden, um Fragen wie den physiologischen Einfluss von Strömung auf die Zell-Zell-, Zell-Wirkstoff- und Wirkstoffträger-Adhäsion zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer bildgeführten, laserbasierten Hydrogeldegradation zur Herstellung von vaskulär abgeleiteten, biomimetischen mikrofluidischen Netzwerken, die in Poly(ethylenglykol)-diacrylat (PEGDA) Hydrogele eingebettet sind. Diese biomimetischen mikrofluidischen Systeme können für Tissue-Engineering-Anwendungen, die Generierung von In-vitro-Krankheitsmodellen und die Herstellung fortschrittlicher "On-a-Chip"-Geräte nützlich sein.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung und volumetrische Analyse von vaskularisierten menschlichen Hautäquivalenten unter Verwendung zugänglicher und einfacher Techniken für die Langzeitkultur zu beschreiben. Soweit möglich, wird die Begründung für die Schritte beschrieben, um den Forschern die Möglichkeit zu geben, sich an ihre Forschungsbedürfnisse anzupassen.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

Die Keimangiogenese, die für Entwicklung und Krankheit von grundlegender Bedeutung ist, umfasst komplexe molekulare und mechanische Prozesse. Wir präsentieren ein vielseitiges 2,5D-ex vivo-Modell , das das zelluläre Keimen aus Schweine-Halsschlagadern analysiert und dabei die steifigkeitsabhängige Angiogenese und die ausgeprägte Leader-Follower-Zellmechanik aufdeckt. Dieses Modell hilft bei der Weiterentwicklung von Tissue-Engineering-Strategien und Krebstherapieansätzen.

2.5D-Modell zur ex vivo mechanischen Charakterisierung der Keimangiogenese in lebendem Gewebe

Erfahren Sie, wie Sie Scherhaft-Karten mit SynVivo synthetischen mikrovaskulären Netzwerken aus einem einzigen Experiment erzeugen. Diese Methode spart Zeit und Reagenzien im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

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