Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe synthetischer mikrovaskulärer Netzwerke eine reine Adhäsionskarte der Zellpartikeladhäsion aus einem einzigen Experiment zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst das mikrofluidische Gerät mit dem gewünschten Protein – in diesem Fall Avadon – beschichtet wird. Im zweiten Schritt werden biotinylierte Partikel bei physiologischen Scherraten in das Gerät injiziert, die je nach lokalen Scherraten in unterschiedlichen Mustern an das mit Avadon beschichtete Gerät binden.

Anschließend wird die Anzahl der gebundenen Partikel gezählt, um mithilfe einer computergenerierten Datenbank von Scherratenwerten im Netzwerk eine Scheradhäsionskarte der Partikel zu erstellen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Scheradhäsionskarte aus einem einzigen Experiment gewonnen werden kann, was im Vergleich zu herkömmlichen Parallelplatten-Flusskammern eine erhebliche Einsparung an Zeit und Reagenzien bedeutet. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden, wie linearen Flusskanälen, liegt darin, dass wir aus einem einzigen Experiment gemeinsame Karten generieren können, was zu erheblichen Einsparungen bei Kosten und Zeit führt.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelabgabe beantworten, beispielsweise die Fähigkeit der Arzneimittelabgabesysteme, an die gewünschten Zielstrukturen zu binden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Paddelplatten-Flusskammern verwendeten, um zelluläre Läsionen zu untersuchen. Im vorliegenden Assay liegt der Schwerpunkt jedoch darauf, grundlegende Einblicke in die Adhäsion von Partikeln und Zellen unter Flüssigkeitsbedingungen zu gewinnen.

Die Syn-vivo-Plattform kann auf eine Vielzahl weiterer Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Krebs- und ZNS-Transport, Infektion und Entzündung, Thrombose sowie Mikrozirkulationsstörungen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte mit dem mikrofluidischen Gerät schwer zu erlernen sind, die Gewöhnung an kleine Probenvolumina sowie die bewährten Verfahren zur Vermeidung von Blasenbildung visuell besser vermittelt werden können. Die Durchführung der Methode demonstriert Ashley Smith, eine Wissenschaftlerin aus unserem Labor.

Die mikrofluidische Vorrichtung SynVivo SMN besteht aus zwei Sätzen paralleler Anschlüsse, von denen einer zum Zuführen von Oberflächenbeschichtungen, Molekülen und/oder Zellen zum Ansiedeln dient und der andere für die Durchführung des Assays verwendet wird. Beginnen Sie damit, die Vorrichtung vollständig in eine Petrischale mit steriler entionisierter Wasser zu tauchen, und stellen Sie die Schale in ein Vakuum. Trocknen Sie sie, indem Sie das Trocknen so lange laufen lassen, bis die gesamte Luft aus den Kanälen der Vorrichtung entfernt ist.

Das sollte etwa 15 Minuten dauern, bevor das Gerät aus dem Wasser genommen wird. Verwenden Sie feine Pinzette, um Tigon-Schläuche, die mit Wasser vorgefüllt sind, in jeden Anschluss des Geräts einzuführen. Die Schläuche sollten etwa einen Zoll Länge haben.

Das Gerät kann nun mit einer Pipette oder Spritze aus dem Wasser entfernt werden. Geben Sie einen Tropfen Wasser um die Basis eines Einlassport-Schlauchs. Entfernen Sie den Schlauch vorsichtig.

Der Wassertropfen verhindert, dass Luft in das Gerät gelangt. Bereiten Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze vor, die mit Avadon in einer Konzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter gefüllt ist. Verbinden Sie die Spritze mit einer 24-Gauge-Edelstahlnadel und klemmen Sie den nicht verwendeten Einlassanschluss mit einer Backenklemme ab.

Schieben Sie den Schlauch in die Einlassöffnung des Geräts. Injizieren Sie Avadon mit einer Flussrate von einem Mikroliter pro Minute für 10 Minuten, um eine vollständige Perfusion des Geräts zu ermöglichen. Am Ende der Flusszeit.

Blockieren Sie alle Schläuche mit Klemmen und stellen Sie das Gerät über Nacht auf vier Grad. Lassen Sie das Gerät auf Raumtemperatur anwärmen. Anschließend platzieren Sie das Gerät auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop, das mit einem motorisierten Objekttisch und einer Hochleistungskamera ausgestattet ist.

Stellen Sie eine Lösung aus zwei Mikrometer großen biotinylierten Partikeln mit einer Konzentration von 5 Millionen Partikeln pro Milliliter in Phosphatpufferlösung oder PBS her. Füllen Sie die Partikel in eine Ein-Milliliter-Spritze. Bereiten Sie eine zweite Ein-Milliliter-Spritze mit PBS vor.

Befüllen Sie jede Spritze nur, setzen Sie sie in eine Spritzenpumpe ein und verbinden Sie sie anschließend mithilfe einer Pipettierspritze mit Nadel und Schlauch. Geben Sie einen Tropfen Wasser um die Basis des Eingangsschlauchs und entfernen Sie vorsichtig den Schlauch, der zum Beschichten des Geräts verwendet wurde. Führen Sie den Schlauch für biotinylierte Partikel und den für PBS vorsichtig in jeden Eingangsanschluss ein.

Danach beginnen Sie mit der Injektion biotinylierter Partikel mit einer Flussrate von 2,5 Mikrolitern pro Minute. Überwachen Sie den Einlassanschluss am Mikroskop, sobald die ersten Partikel sichtbar werden. Starten Sie die Stoppuhr und führen Sie den Fluss weitere drei Minuten lang fort.

Am Ende der drei Minuten stoppen Sie den Fluss der biotinylierten Partikel, während gleichzeitig der Fluss von PBS mit einer Flussrate von 2,5 Mikrolitern pro Minute gestartet wird. Lassen Sie PBS drei Minuten lang durch das Gerät fließen, um nicht gebundene Partikel abzuwaschen. Um die Aufnahme zu beginnen, verwenden Sie die Funktion „Großes Bild scannen“ in der Bildgebungssoftware, um ein Bild des gesamten Geräts aufzunehmen, nummerieren Sie anschließend nacheinander die Verzweigungen im Gerät und erstellen Sie einen kreisförmigen interessierenden Bereich mit dem doppelten Durchmesser der Kanäle.

Stellen Sie in diesem Fall den Durchmesser des interessierenden Bereichs auf 200 Mikrometer ein, da der Kanaldurchmesser 100 Mikrometer beträgt. Verwenden Sie die automatische Zählfunktion in der Bildverarbeitungssoftware, um die Anzahl der Partikel in jedem interessierenden Bereich in eine Tabellenkalkulation zu exportieren. Nutzen Sie ebenso die automatische Zählfunktion, um die Anzahl der Partikel im gesamten Gerät zu exportieren.

CFD-Simulationen werden durchgeführt, und die Ergebnisse werden zur weiteren Analyse in einer Datenbank gespeichert. Die in den Ergebnissen enthaltenen Informationen umfassen Wandschergeschwindigkeiten, Geschwindigkeitspartikelstrom und Adhärenz an der Vorrichtung. Mithilfe dieser Informationen wird die Anzahl der Partikel bestimmt, die sich bei einer definierten Eingabe einer Partikelkonzentration in jedem interessierenden Bereich anlagern.

Um eine Scherhaftkraftkarte zu erstellen, berechnen Sie als letzten Schritt den Prozentsatz der Adhäsion, wie im Textprotokoll beschrieben. Zeichnen Sie die Scherhaftkraftkarte unter Verwendung der Scherrate an jeder Verzweigung der Netzwerke und der Prozentsatz-Adhäsionswerte auf. Dieses Bild zeigt ein typisches Avidin-beschichtetes syn-vivo-SMN-Gerät nach Bindung zweimikroniger biotinylierter Partikel.

Beachten Sie, dass Partikel bevorzugt in der Nähe der Verzweigungen im Netzwerk haften. Die nummerierten Verzweigungen im syn-vivo-SMN-Netzwerk sind hier zu sehen. Diese Abbildung zeigt die Beispiel-Wandschubspannungsverteilung, die durch das CFD-Modell des Geräts erzeugt wurde.

Die Schergeschwindigkeit variiert in der Vorrichtung zwischen 250 inversen Sekunden und 15 inversen Sekunden, wie sie in der Mikrozirkulation in vivo beobachtet wird. Beachten Sie, dass diese unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten in linearen mikrofluidischen Kanälen nicht gleichzeitig erzielt werden können, da letztere für jede Durchflussrate eine konstante Schergeschwindigkeit liefern. Der hier dargestellte Plot der Schergeschwindigkeitswerte an jeder Verzweigung des Netzwerks zeigt, dass die Muster der Schergeschwindigkeit komplex sind und sich im Gegensatz zu linearen Strömungskanälen nicht durch eine einfache analytische Beziehung beschreiben lassen.

Außerdem sind mehrere Verzweigungen im Netzwerk vorhanden, die in dieselbe Scherratenklasse fallen, was die statistische Aussagekraft der dargestellten Daten erhöht. Hier sind beispielhafte Ergebnisse der CFD-Analyse für Teilchenströme im Netzwerk, die zur Berechnung der Teilchenströme in den Ästen und Verzweigungen des experimentellen Netzwerks verwendet werden.

Die aus einem einzigen syn vivo SMN-Experiment berechnete Scheradhäsionskarte folgt der inversen Beziehung, die auch bei Scheradhäsionskarten aus linearen Kanalexperimenten beobachtet wird. Mit einem SynVivo-Assay ermöglicht jedoch ein einzelnes Experiment die Erstellung dieser Scherkarte, während mehrere experimentelle Durchläufe für die linearen Kanäle erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man SynVivo-SMN-Geräte verwendet, um die geteilte Adhäsion aus einem einzigen Experiment zu erzeugen.

Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, darauf zu achten, keine Bläschen in das SynVivo SMN-Mikrofluidikgerät einzubringen, nachdem es entwickelt wurde. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Entzündungsforschung den Weg, um die Interaktion zwischen Leukozyten und Endothel bei unterschiedlichen Scherraten in einem einzigen Experiment zu untersuchen. In der nächsten Gerätegeneration können Forscher die Wälzadhäsion und Migration von Leukozyten in einem einzigen Assay untersuchen, was derzeit noch nicht möglich ist.

Mit dieser Methode können weitere Verfahren zur Untersuchung der Adhäsion von Wirkstoffen, Wirkstoffträgern und Zellen durchgeführt werden, um Fragen wie den physiologischen Einfluss von Strömung auf die Zell-Zell-, Zell-Wirkstoff- und Wirkstoffträger-Adhäsion zu untersuchen.