Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine reine Adhäsionskarte der Zellpartikeladhäsion aus einem einzigen Experiment unter Verwendung synthetischer mikrovaskulärer Netzwerke zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst das mikrofluidische Gerät mit dem Protein beschichtet wird, das in diesem Fall Avadon von Interesse ist. In einem zweiten Schritt werden biotinylierte Partikel mit physiologischen Scherraten in das Gerät injiziert, die sich mit unterschiedlichen Mustern in Abhängigkeit von den lokalen Scherraten an das avadonbeschichtete Gerät binden.

Als nächstes wird die Anzahl der gebundenen Partikel gezählt, um eine reine Adhäsionskarte der Partikel unter Verwendung einer rechnerisch erstellten Datenbank mit Schergeschwindigkeitswerten im Netzwerk zu erstellen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine reine Adhäsionskarte aus einem einzigen Experiment erhalten werden kann, was zu einer erheblichen Einsparung von Zeit und Reagenzien im Vergleich zu herkömmlichen parallelen Plattenströmungskammern führt. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. linearen Strömungskanälen, besteht darin, dass wir aus einem einzigen Experiment gemeinsam genutzte Karten erstellen können, was zu einer erheblichen Kosten- und Zeitersparnis führt.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Wirkstoffverabreichung zu beantworten, wie z. B. die Fähigkeit der Wirkstoffverabreichungsvehikel, an die gewünschten Ziele zu binden. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir Paddelplatten-Strömungskammern verwendeten, um zellspezifische Läsionen zu verstehen. Unter flüssigen Bedingungen liegt der Schwerpunkt dieses Assays jedoch darauf, grundlegende Einblicke in die Adhäsion von Partikeln und Zellen zu liefern.

Die syn-vivo-Plattform kann auf eine Vielzahl anderer Systeme angewendet werden, z. B. auf Krebs und ZNS-Verabreichung, Infektions- und Entzündungsthrombosen sowie Mikrozirkulationsstörungen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des mikrofluidischen Geräts schwer zu erlernen sind, da man sich an kleine Probenvolumina gewöhnen muss und die Best Practices zur Vermeidung von Blasenbildung visuell besser vermittelt werden. Das Verfahren wird von Ashley Smith, einer Forscherin aus unserem Labor, demonstriert.

Das mikrofluidische Gerät SynVivo SMN besteht aus zwei Sätzen paralleler Anschlüsse, von denen einer für das Einströmen von Oberflächenbeschichtungen, Einheiten und/oder Zellen zum Sitzen und der andere zum Ausführen des Assays verwendet wird. Tauchen Sie das Gerät zunächst vollständig in eine Petrischale mit sterilem entionisiertem Wasser und stellen Sie die Schale in ein Vakuum. Trockenen lassen Sie die Trockenheit laufen, bis die gesamte Luft aus den Kanälen des Geräts entfernt wurde.

Dies sollte etwa 15 Minuten dauern, bevor das Gerät aus dem Wasser genommen wird. Verwenden Sie eine Pinzette mit feiner Spitze, um mit Wasser grundierte Tigon-Schläuche in jeden Anschluss des Geräts zu stecken. Der Schlauch sollte etwa einen Zoll lang sein.

Das Gerät kann nun mit einer Pipette oder Spritze aus dem Wasser entnommen werden. Geben Sie einen Tropfen Wasser um den Boden eines Einlassschlauchs. Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch.

Der Wassertropfen verhindert, dass Luft in das Gerät eindringt. Bereiten Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Spritze vor, die mit Avadon in einer Konzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter beladen ist. Verbinden Sie die Spritze mit einer 24-Gauge-Nadel und einem Schlauch aus Edelstahl Klemmen Sie die Einlassöffnung, die nicht verwendet wird, mit einer Backenklemme.

Stecken Sie den Schlauch in den Einlassanschluss des Geräts. Injizieren Sie Avadon 10 Minuten lang mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute, um eine vollständige Perfusion des Geräts zu ermöglichen. Am Ende der Fließzeit.

Klemmen Sie alle Schläuche mit Backenklemmen fest und stellen Sie das Gerät über Nacht auf vier Grad auf. Lassen Sie das Gerät auf Raumtemperatur kommen. Stellen Sie das Gerät dann auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das mit einem motorisierten Tisch und einer Hochleistungskamera ausgestattet ist.

Bereiten Sie eine Lösung aus zwei Mikron biotinylierten Partikeln in einer Konzentration von 5 Millionen Partikeln pro Milliliter in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder PBS vor. Laden Sie die Partikel in eine Ein-Milliliter-Spritze. Bereiten Sie eine zweite Ein-Milliliter-Spritze PBS vor.

Laden Sie nur jede Spritze auf eine Spritzenpumpe und verbinden Sie sie dann mit einer Pipettierspritze mit Nadel und Schlauch. Geben Sie einen Tropfen Wasser um den Boden des Einlassanschlusses und entfernen Sie vorsichtig den Schlauch, mit dem das Gerät beschichtet wurde. Führen Sie die Schläuche für biotinylierte Partikel und für PBS vorsichtig in jede der Einlassöffnungen ein.

Beginnen Sie dann mit der Injektion von biotinylierten Partikeln mit einer Durchflussrate von 2,5 Mikrolitern pro Minute. Überwachen Sie die Einlassöffnung am Mikroskop bei den ersten Anzeichen von Partikeln. Starten Sie den Timer, und setzen Sie den Fluss drei Minuten lang fort.

Stoppen Sie nach Ablauf der drei Minuten den Fluss der biotinylierten Partikel und starten Sie gleichzeitig den Fluss von PBS mit einer Durchflussrate von 2,5 Mikrolitern pro Minute. Lassen Sie PBS drei Minuten lang im Gerät fließen, um ungebundene Partikel abzuwaschen. Um mit der Erfassung zu beginnen, verwenden Sie die Funktion "Große Bilder scannen" in der Bildgebungssoftware, um das Bild des gesamten Geräts zu erfassen, nummerieren Sie dann nacheinander die Verzweigungen im Gerät und erstellen Sie einen kreisförmigen Interessenbereich mit dem doppelten Durchmesser der Kanäle.

Legen Sie in diesem Fall den Durchmesser des Interessenbereichs auf 200 Mikrometer fest, da der Kanaldurchmesser 100 Mikrometer beträgt. Verwenden Sie die automatische Zählfunktion in der Bildgebungssoftware, um die Anzahl der Partikel in jedem interessierenden Bereich in eine Tabelle zu exportieren. Verwenden Sie ebenfalls die Funktion "Automatisiertes Konto", um die Anzahl der Partikel im gesamten Gerät zu exportieren.

Es werden CFD-Simulationen durchgeführt und die Ergebnisse zur weiteren Analyse in einer Datenbank gespeichert. Die in den Ergebnissen enthaltenen Informationen umfassen Wandscherraten, Geschwindigkeit, Partikelfluss und Adhärenz am Gerät. Die Informationen hier werden verwendet, um die Anzahl der Partikel zu bestimmen, die an jedem interessierenden Bereich anhaften, wenn eine definierte Eingabe einer Partikelkonzentration

Um eine Schubhaftungskarte zu erstellen, berechnen Sie als letzten Schritt den Prozentsatz der Haftung, wie im Textprotokoll beschrieben. Plotten Sie die Karte der reinen Adhäsion anhand der Scherungsrate bei jeder Bifurkation der Netzwerke und der prozentualen Adhäsionswerte. Dieses Bild zeigt ein typisches Avidan beschichtetes syn vivo SMN-Bauelement nach der Bindung von zwei biotinylierten Mikronpartikeln.

Beachten Sie, dass Partikel bevorzugt in der Nähe der Bifurkationen im Netzwerk haften. Die nummerierten Bifurkationen im syn vivo SMN-Netzwerk sind hier zu sehen. Dieses Bild ist die Beispiel-Wandscherkarte, die vom CFD-Modell des Geräts generiert wurde.

Die Scherrate variiert im Gerät und reicht von 250 inversen Sekunden bis 15 inversen Sekunden, wie sie in der Mikrovaskulatur in vivo beobachtet wird. Beachten Sie, dass diese unterschiedlichen Scherraten in linearen mikrofluidischen Kanälen nicht gleichzeitig erreicht werden können, da sie für jede Durchflussrate eine konstante Scherrate liefern. Das hier gezeigte Diagramm der Werte der Scherrate an jeder der Bifurkationen des Netzwerks zeigt, dass die Scherratenmuster komplex sind und im Gegensatz zu linearen Strömungskanälen nicht mit einer einfachen analytischen Beziehung erhalten werden können.

Darüber hinaus sind mehrere Bifurkationen im Netzwerk vorhanden, die in denselben Mülleimer fallen. Dies erhöht die statistische Zuverlässigkeit der gezeigten Daten. Hier sind beispielhafte Ergebnisse der CFD-Analyse für Teilchenflüsse im Netzwerk, die zur Berechnung der Teilchenflüsse in den Verzweigungen und Bifurkationen des experimentellen Netzwerks verwendet werden.

Die reine Adhäsionskarte, die aus einem einzelnen syn vivo SMN-Experiment berechnet wurde, folgt der umgekehrten Beziehung, wie sie aus reinen Adhäsionskarten aus linearen Kanalexperimenten beobachtet wurde. Bei Verwendung eines SynVivo-Assays ermöglicht jedoch ein einzelnes Experiment die Erzeugung dieser reinen Karte, während mehrere experimentelle Durchläufe aus den linearen Kanälen erfasst werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie SynVivo SMN-Geräte verwenden, um die gemeinsame Adhäsion aus einem einzigen Experiment zu erzeugen.

Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, daran zu denken, dass das mikrofluidische Gerät SynVivo SMN nach seiner Entwicklung keine Blasen einbringt. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entzündung, die Interaktion von Leukozyten-Endothel mit unterschiedlichen Raten in einem einzigen Experiment zu untersuchen. In der nächsten Generation von Geräten können Forscher die Adhäsion und Migration von Leukozytenrollen in einem einzigen Assay untersuchen, was derzeit nicht möglich ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden zur Untersuchung der Adhäsion von Arzneimitteln, Wirkstoffträgervehikeln und Zellen durchgeführt werden, um Fragen wie die physiologische Wirkung der Strömung auf die Adhäsion von Zellzellen, Zellwirkstoffen und Wirkstoffvehikeln zu untersuchen.