Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellblätter zu verwenden, um ein Tissue-Engineering-Pflaster zu konstruieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellkulturoberfläche mit dem thermosensitiven Polymer Polypropylacrylamid, auch p nipam genannt, behandelt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die interessierenden Zellen in einer hohen Dichte auf der polymerbeschichteten Oberfläche zu kultivieren, um Zellfaltblätter zu erzeugen.

Als nächstes werden die Bleche angehoben, indem die Plattentemperatur gesenkt wird, wodurch sich die Zellen als Zellschicht von der Platte lösen können. Der letzte Schritt besteht darin, die intakten Zellfaltblätter zu bewegen, ohne sie für die Implantation auf ein Konstrukt zu zerreißen. Letztendlich kann eine einfache Lichtmikroskopie verwendet werden, um zu zeigen, dass das Zellblatt während seiner Manipulation erstellt und erhalten wurde, während ein implantierbares Tissue-Engineering-Material hergestellt wurde.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, bei denen Zellen wie Hydrogele in eine Matrix eingebettet werden, besteht darin, dass bei dieser Technik die lateralen Grenzen der Zellen wie ein funktionelles Gewebe erzeugt und erhalten werden können. Diese Methoden können auch weitere Studien im Bereich des Tissue Engineering ermöglichen. Zum Beispiel, wie gut überleben die Zellen nach einer Transplantation, wenn sie sich in diesem organisierten Zustand befinden?

Verfahren wird von Dr. William Turner, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Frau Snapshot Sand Do demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie 2,6 Gramm P nipam in zwei Millilitern einer 60%igen Toluol- und 40%igen Hexanlösung. Anschließend die Mischung 10 Minuten lang auf 60 Grad Celsius erhitzen und rühren, bis sich der P Nipam aufgelöst hat.

Schneiden Sie dann das Filterpapier in einen Kreis mit 60 Millimetern Durchmesser und legen Sie es in einen Buchner-Trichter. Die Lösung wird durch den Buchner-Trichter in ein vorgewogenes Glasbecherglas filtriert. Bewahren Sie das Becherglas und den Inhalt über Nacht in einem Glockenvakuum auf.

Wiegen Sie anschließend den Becher mit p nipam. Anschließend Isopropylalkohol zu P nipam hinzufügen, um eine Lösung mit einem Gewicht von 50 bis 50 zu erhalten. Geben Sie anschließend zwei Milliliter der Lösung auf die Oberfläche der Gewebekulturplatte und beschichten Sie sie fünf Minuten lang mit UV-Licht.

Waschen Sie die Platte dann zweimal mit zwei Millilitern warmem PBS, bevor Sie sie für die Zellkultur verwenden. Bei diesem Verfahren isolieren Sie zunächst die glatten Muskelzellen der Ratte, indem Sie die Zellen mit zwei Millilitern warmem PBS waschen. Geben Sie dann drei Milliliter Trypsin oder eine andere spaltende Dissoziationslösung in die Zellen und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Geben Sie dann drei Milliliter des Nährmediums oder PBS mit 10 % FBS zu den Zellen. Sammeln Sie danach die Zellen in einem konischen Röhrchen und zählen Sie sie. Drehen Sie anschließend die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 U/min.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium. Legen Sie dann das Medium mit den Zellen auf eine 35 Millimeter große thermoempfindliche Platte in einer Konzentration, die 100 % Konfluenz erreicht, und inkubieren Sie dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Zelladhäsion auf der Platte aufrechtzuerhalten. Sammeln Sie nun die Endothelzellen und verteilen Sie sie in eine Einzelzelllösung.

Die Verwendung von einem x Trypsin, Akuat- oder Zelldissoziationspuffer kann auch für die Einzelzelldispergierung verwendet werden. Als nächstes deaktivieren Sie das Trypsin-Enzym mit einer gleichen Menge Soja-Trypsin-Inhibitor oder 10% FBS in PBS. Sammeln Sie dann die Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie das Volumen, das für die Pflasterabmessungen für ein vier Millimeter Pflaster benötigt wird, danach werden 2 Millionen Endothelzellen verwendet, 2 Millionen Zellen extrahiert und in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen gegeben. Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang, saugen Sie den Überstand an und belassen Sie die Zellen als Pellet in dem konischen Röhrchen. Bereiten Sie nun das Hydrogel mit hohem Auringehalt gemäß dem Unternehmensprotokoll vor.

Mischen Sie Aurin mit hohem Auringehalt und flüssiger Gelatine im Verhältnis eins zu eins. Anschließend werden 80 % des gesamten Endvolumens in das konische Röhrchen mit dem Pellet überführt und die Endothelzellen in der Gelatinemischung mit hohem Auringehalt resuspendiert. Als nächstes überführen Sie die suspendierten Zellen in die faserige Matrix.

Fügen Sie 20 % des gesamten Endvolumens des Vernetzers hinzu und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie in diesem Schritt die 35 Millimeter P nypa behandelte Platte, die die Zellen enthält, aus dem Inkubator und legen Sie sie in eine Zellkulturhaube. Bei Raumtemperatur saugen Sie das Medium schnell aus den Zellen ab.

Geben Sie dann zwei Milliliter 37 Grad Celsius, 6% normale Gelatine auf die Platte, solange die Gelatine noch warm ist, legen Sie das Metallgitter in die Gelatine und tauchen Sie es unter die Oberfläche der normalen Gelatine. Danach den gesamten Teller fünf bis sieben Minuten lang auf Eis legen, damit die Gelatine aushärten kann. Trennen Sie nach sieben Minuten mit einem Spatel vorsichtig die Gelatineränder von der Seite des Tellers.

Heben Sie dann das Metallgitter mit einer Pinzette von der Platte an. Übertragen Sie das Zellblatt in die Schale und legen Sie es auf die Fasermatrix-Hydrogel-Kombination. Geben Sie zwei Milliliter 37 Grad Celsius heißes Medium in die Gewebekulturplatte und inkubieren Sie es über Nacht, damit die Zellschicht an der Hydrogeloberfläche haften kann.

Entfernen Sie in der Zwischenzeit das Metallgitter, nachdem sich die Lösung erwärmt hat. Hier wurden Zellen auf einer Pippa-beschichteten Oberfläche kultiviert und anschließend als Folie an die Oberfläche der faserigen Matrix gebracht. Frühe Versuche, die nicht mit dem Gelatinemetallgitter übertragen wurden, führten zu kleinen zerfledderten Flecken.

Dieses Bild stellt ein frühes Patch-Design-Kompositbild dar, das den Mito-Tracker, rot gefärbte glatte Muskelzellen der Ratten-Aorta, Kalzium- und grün fluoreszierende menschliche Nabelvenen-Endothelzellen und das Durchlichtbild kombiniert. Und das ist das Komposit aus Zellblatt in Kombination mit der stärkeren Kombination aus basischem Fasermatrix-Hydrogel. Dieses Kompositbild wurde von der Unterseite des Pflasters durch eine stärkere basische fibröse Matrix aufgenommen, und dieses Kompositbild der Zellschichten wurde über die basische fibröse Matrix aufgenommen.

Hydrogel-Kombinationszellen in der Folie bedecken die basische fibröse Matrix-Hydrogel-Kombination, die an den Rändern aufgrund der Bündelung der Zellen eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen. Dies ist ein Transmissionsbild des Konstrukts und die autofluoreszierende natürliche faserige Basismatrix in DPI ist hier zu sehen. Nach diesem Verfahren können andere Tissue-Engineering-Experimente andere Fragen beantworten, z. B. wie sich die Zellausrichtung und -kommunikation auf den Transplantationserfolg auswirken.

Diese Technik ermöglicht es Forschern im Tissue Engineering, komplexe Wege zur Transplantation mehrerer Zelltypen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen geeigneter Masken und chemischer Hauben, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.