Name: In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Lernen Sie In-vitro-Zellmigration und Invasion mit Wundheilungs- und Transwell-Assays für Krebs- und Immunforschung. Diese Methoden ermöglichen die detaillierte Analyse von Zellmotilität und Invasionsmechanismen.

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Die Autoren danken Mike Myles, Sam Saunders und C.W. Elton von den ECU Multimedia & Technology Services für ihre Unterstützung bei der Videoproduktion. Wir danken für die Unterstützung durch das North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, den Brody Brothers Endowment Fund, die American Heart Association und den ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. und M.J.R.).

1. Zellkultur Wundverschluss Assay <ol><li> Nehmen Zellen aus dem Gewebekulturplatte mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung. Pellet-Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen in Kulturmedien. Platte die entsprechende Anzahl von Zellen in einer 6-Well-Platte für 100% Konfluenz in 24 Stunden. Hinweis: Tests erforderlich sein, um die Zeit und die Anzahl der Zellen zu 100% Konfluenz durch den Zelltyp und der Größe der auch verwendet erzielen zu bestimmen (beispielsweise werden 1 x 10 6 B16F10-Melanomzellen in einer Vertiefung einer ausgesät 6-Well-Platte 24 Stunden vor der Wunde Generation). Alternativ kann 12-Well-oder 24-Well-Platten verwendet werden. Hinweis: Falls verfügbar, können Zellen in eine Kultur-Insert (von ibidi LLC) auf einer behandelten Gewebekulturplatte machen die Wunde vor, gegossen ausgesät werden. Ein Kultur-Einsatz kann die Oberfläche der Gewebekulturplatte vor Schäden zu schützen, indem der Pipettenspitze. Wenn eine Kultur-Insert weglassen Schritt verwendet1.2. </li><li> In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosicherheit Kapuze) verwenden einen 200 ul Pipettenspitze fest an der Spitze der Gewebekulturplatte drücken und schnell einen vertikalen Wunde durch die Zellschicht nach unten zu machen. Eine andere große Pipettenspitze verwendet werden, um die Wundgröße, die gewünscht wird zu machen. Verwenden Sie keine übermäßige Kraft auf die Gewebekulturplatte mit der Pipettenspitze, da sie die Oberfläche beschädigen. Wenn die Wunde vorgegossen, kann dieser Schritt weggelassen werden. </li><li> Vorsichtig absaugen Medien-und Zelltrümmer. Langsam genug, Kulturmedien gegen die Wand, um auch die Unterseite der gut decken und vermeiden Abnehmen zusätzliche Zellen. Nach der Erzeugung und Prüfung der Wunde ein Anfangsbild bestimmt werden können. Legen Sie die Gewebekulturplatte im Brutschrank bei der entsprechenden Temperatur und CO 2-Konzentration festgelegt (in der Regel 37 ° C und 5% CO 2). </li><li> Zu verschiedenen Zeitpunkten, z. B. alle 3 Stunden, entfernen Sie die Platte aus dem INCUBAToder und legen Sie es unter einem inversen Mikroskop, um eine Momentaufnahme zu nehmen und für den Wundverschluss zu überprüfen. Wenn Zeitraffer-Mikroskopie ist, nehmen Sie ein Foto jedes X Anzahl der Minuten (in der Regel beginnend mit je 5 Minuten) für jede Zeitdauer in einem Temperatur-und CO 2-gesteuerten Kammer. Je nach Zelltyp kann Wundverschlusszeit variieren. </li><li> Um die Ergebnisse des Snapshot-Bilder analysieren, messen Sie den Abstand von einer Seite der Wunde auf die andere mit einem Maßstab. Analysieren und eine klare Wundverschluss im Laufe der Zeit mit einem Streudiagramm oder ein Balkendiagramm zB Abbildung 1. </li><li> Um die Zeitrafferaufnahmen analysieren, importieren Sie die Bilder in der ImageJ Software (frei verfügbar http://rsb.info.nih.gov/ij/), um ein Video zu machen. Um diesen offenen ImageJ tun, klicken Sie auf Datei, Importieren und Bildsequenz. Suchen Sie die Datei mit Bildern; klicken Sie auf das erste Foto in der Datei. Sparen Sie Video, indem Sie Datei, Speichern unter, und AVI. Einzel wandernden Zellen kann beobachtet werden characterize gerichtete Bewegung. Ferner können morphologische Merkmale wie lamellipodia Bildung und Hinterkante sowie Rückzugssucht werden (Fig. 2 und zusätzlichen Video). </li></ol> 2. Transwell-Zellmigration und Invasion Assay <ol><li> In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosafety-Haube) lösen Zellen aus dem Gewebekulturplatte mit einer nicht-enzymatischen Zell Dissoziation Puffer oder 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, Pellet-Zellen durch Zentrifugation, und saugen Sie die vorhandene Medien verlassen die pelletierten Zellen. Resuspendieren Zellen in serumfreiem Zellkulturmedium, enthaltend 0,1% BSA (Rinderserumalbumin). Hinweis: Je nach Zelllinie untersucht, 0,25% Trypsin-EDTA kann die Zellmigration und Invasion durch die Spaltung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche 17 beeinträchtigen. Anmerkung: Die Anzahl der Zellen pro ml, hängt von der Größe der Zellen. Weitere Tests erforderlich sein, um eine Aussaatdichte, die pro findenVides die besten Ergebnisse. In der Regel 1 x 10 6 Zellen / ml ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Zelltypen bei der Verwendung der 24-Well-Transwell einfügen. Es gibt eine Reihe von Transwell Plattengrößen und dementsprechend sollte die Anzahl der Zellen zugegeben eingestellt werden. </li><li> Platte 100 ul Zelllösung auf der Filtermembran in einem Transwell-Einsatz und Inkubation für 10 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2, damit die Zellen, sich niederzulassen. Hinweis: Das bestimmte Porengröße der Transwell-Membran verwendet wird, hängt von der jeweiligen Größe der Zellen in der Probe. Zum Beispiel, wenn die Zellen zu klein sind, können sie durch die Poren, ohne die Notwendigkeit der Migration zu erleichtern oder übergeben, wenn sie zu groß sind, können sie nicht durch die Poren zu passen. Es gibt mehrere Transwell-Einsätzen mit Porengrößen zwischen 3 &amp;mgr; m reichen, 5 &amp;mgr; m und 8 &amp;mgr; m für die Zellmigrationsassays. Die Transwell-Einsätze sind von Firmen wie Corning im Handel erhältlich. Hinweis: Die Transwell migration Test kann leicht modifiziert, um die Zellinvasion Assay durchzuführen. Um dies zu tun, fügen extrazellulären Matrix (ECM)-Materialien auf der Oberseite des Transwell-Membran und fügen Zellen auf der ECM. Zum Beispiel wird Matrigel aufgetaut und auf Eis verflüssigt und dann 30-50 &amp;mgr; l Matrigel ist eine 24-Well Transwell zugegeben einfügen und verfestigt, in einem 37 ° C Inkubator für 15-30 Minuten, um eine dünne Gelschicht bilden. Zell-Lösung wird auf der Oberseite der Beschichtung zugegeben Matrigel Invasion durch die extrazelluläre Matrix zu simulieren. Hinweis: Es gibt deutliche Unterschiede zwischen dem Transwell-Zellmigration und Zellinvasion der Transwell-Assays. Die Transwell-Zellmigration Test misst die Fähigkeit von Zellen chemotaktisch zu einer Chemo-Lockstoff. Die Transwell-Zellinvasionstest, jedoch werden sowohl die Chemotaxis und die Invasion von Zellen durch die extrazelluläre Matrix, ein Verfahren, das häufig bei der Krebsmetastasierung oder der Embryonalentwicklung gefunden wird. </li><li> Mit einer Pipette sehr CAREFUlly hinzufügen 600 ul der gewünschten chemo-Lockstoff in den Boden der unteren Kammer in einer 24-Well-Platte. Fügen Sie die chemo-Lockstoff, ohne den Transwell-Einsatz und Erzeugen von Blasen zu vermeiden. Sicherstellen, dass der Chemo-Lockstoff Flüssigkeit am Boden und in Kontakt mit der Membran in dem oberen und einen chemotaktischen Gradienten bilden. Inkubationszeit hängt vom Zelltyp und der chemo Lockstoff verwendet werden. Hinweis: Weitere Tests erforderlich sein, um die Inkubationszeit zu bestimmen. Anmerkung: Für adhärente Zellen, werden die migrierten Zellen auf die andere Seite der Membran 1,8 befestigen. Die Quantifizierung der migrierten Zellen folgende Schritte 2,4 bis 2,8 (2,4-2,8 Schritte müssen nicht in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden) durchgeführt werden. Für nicht-adhärente Zellen werden die gewanderten Zellen in das Medium in der unteren Kammer fallen. Die Anzahl der migrierten Zellen kann durch die Verwendung Hämozytometers oder gezählt werden Durchflusszytometer 5. </li><li> Entfernen Sie die Transwell-Einsatz von der Platte. Verwenden Sie ein Wattestäbchen so oft wie nötig, um vorsichtig die Medien und die übrigen Zellen, die nicht von der Spitze der Membran ohne es zu beschädigen migriert haben. </li><li> In 600-1.000 ul 70% Ethanol in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Platzieren Sie den Transwell-Einsatz in das 70% Ethanol für 10 Minuten, um Zellfixierung zu ermöglichen. Entfernen Transwell-Einsatz aus der 24-Well-Platte und mit einem Wattestäbchen, um die verbleibende Ethanol aus der Oberseite der Membran zu entfernen. Lassen Sie die Transwell-Membran (in der Regel 10-15 Minuten) trocknen. </li><li> In 600-1.000 ul von 0,2% Kristallviolett in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Position der Membran in das für die Färbung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Kristallviolett von der Oberseite der Membran mit einer Pipettenspitze oder Wattestäbchen. Ganz vorsichtig, um zu vermeiden, Abwaschen fixierten Zellen, tauchen die Membran in destilliertem Wasser so oft wie nötig, um das überschüssige Kristall viole entfernent. Damit die Transwell-Membran zu trocknen. </li><li> Ansicht unter einem Umkehrmikroskop und die Anzahl von Zellen in unterschiedlichen Sicht auf eine durchschnittliche Summe der Zellen, die durch die Membran in Richtung des chemo Lockstoff migriert und auf der Unterseite der Membran (Fig. 3) befestigt haben, zu erhalten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zellmigration ist ein wichtiger Aspekt in der Krebsforschung untersuchen und es kann auch auf Entwicklungs-, immunologische und Wundheilungsstudien eingesetzt werden. Die Zellkultur-Assay Wundverschluss und die Transwell-Zellmigration und Invasion Assays zeigen detaillierte Informationen von Zellmigrationsverhalten und können verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der Zellmigration 1,2,10,14 untersuchen. Unsere Studie verwendet diese Zellbeweglichkeit Tests, um die Migrationsgeschwindigkeit und Inva...

Beweglichkeit ist ein wesentliches Merkmal von lebenden Zellen. Die Zellmigration wird in der Konzeption des Lebens, Embryonalentwicklung, Immunantwort und vielen pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Entzündungen 9.1 beteiligt. Daher sind Verfahren zur Zellmigrationsverhalten zu studieren sind sehr nützlich, Forschungsinstrumente für ein breites Spektrum von Disziplinen in den biomedizinischen Wissenschaften, Biologie, Biotechnologie und verwandten Bereichen. Die Untersuchung der Zellmigration in der Krebsforschung von besonderem Interesse ist, wie die Hauptursache für Tod bei Krebspatienten ist metastasierendem Progression stehen. Um für Krebs zu verbreiten und im ganzen Körper verbreiten, müssen Krebszellen wandern und dringen durch die extrazelluläre Matrix (ECM), intravasate in den Blutkreislauf, bringen zu einem entfernten Ort, und schließlich extravasieren in ferne 1,10-12 Herde bilden. Verschiedene biologische Verfahren eingesetzt werden, um diese Ereignisse im Detail zu untersuchen. Die Zellkultur Wundverschluss eind. die Transwell Migration und Invasion Assays sind weit verbreitet in der wissenschaftlichen Gemeinschaft 1,10 verwendet. Diese Tests können die erforderlichen Daten, die für ein Verständnis dafür, wie gut ein bestimmter Zelltyp kann spontan migrieren oder reagieren auf eine Chemo-Lockstoff und gerichtet auf sie zu migrieren lassen können vorsehen. Mehrere wandernde Phänotypen wurden beschrieben. Zellen können in einer einzelnen Zelle Form, wie in mesenchymalen oder amöbenartige Bewegung oder mehrzelligen kollektive Bewegung oder Migration Zelle Streaming-13 markierten gesehen migrieren. Die Methode der Bewegung in bewegliche Zellen verwendet werden, können leicht beobachtet werden, mit Hilfe der Zellkultur Wundverschluss-Assay. Unter den vielen Möglichkeiten, um Zellmigration zu untersuchen, ist die Zelle Wundverschluss Assay eine der einfachsten. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Migrationsfähigkeit der gesamten Zellmassen zu bestimmen. Wenn ein Schritt weiter kann es verwendet werden, um morphologische Merkmale einzelnen Zelle während der Migration 14 zu beobachten. Nach der Analyse der Wundverschluss viele Phänotypen offenbar werden. Die Messung des geschlossenen Abstand im Laufe der Zeit, wenn im Vergleich zu einer Kontrolle kann die spezifische Migration Änderungen oder eine gestörte Migrations Phänotyp, die bisher unbekannt war, zu offenbaren. Darüber hinaus können einzelne Zelle Lamellipodium Bildung, Schwanz Rückzug und gerichtete Bewegung Anhaltspunkte für das, was kann beeinträchtigt oder verstärkt werden in den Zellen von Interesse 14 zu geben. Die Transwell-Migration und Invasion Assays können verwendet werden, um die Fähigkeit von einzelnen Zellen gerichtet auf verschiedene Chemolockstoffe antworten, ob sie Chemokine, Wachstumsfaktoren, Lipide, Nukleotide oder 4,5,8,15,16 sind zu analysieren. Ferner kann es Differentialmigrationsfähigkeit aufgrund der Überexpression des Rezeptors 1,14. Diese Assays können auch zur Identifizierung und Charakterisierung der wichtigsten Regulatoren der Zellmigration, wie der Rho-Familie von GTPasen 2 werden. Nach dieser kurzen und leicht zugänglichlich Tests, der Art der Zellmigration und die Fähigkeit einer Zelle, die in ein 3-D-Matrix eindringen kann auch bestimmt werden.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td> In <td>Wasser gelöst bei 0,2 %</td></tr><tr><td>Zelldissoziationspuffer</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Modell # 3145</td></tr><tr><td>SterilGARD Biosicherheitshaube</td><td>The Baker Company, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Modell # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl inverses Mikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Modell # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Katalognummer variiert je nach Art der Kulturplatte</td></tr><tr><td>Corning Transwell Einsatz</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Katalognummer variiert je nach Porengröße der Membran</td></tr></tbody></table>

in-vitro-zellmigration und invasion assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration ist eine Schlüsseleigenschaft lebender Zellen und entscheidend für die normale Entwicklung, Immunantwort und Krankheitsprozesse wie Krebsmetastasen und Entzündungen. Methoden zur Untersuchung der Zellmigration sind sehr nützlich und wichtig für ein breites Spektrum der biomedizinischen Forschung wie Krebsbiologie, Immunologie, Gefäßbiologie, Zellbiologie und Entwicklungsbiologie. Hier nehmen wir die Migration und Invasion von Tumorzellen als Beispiel und beschreiben zwei verwandte Assays, um die häufig verwendeten, leicht zugänglichen Methoden zur Messung dieser Prozesse zu veranschaulichen. Die erste Methode ist der Zellkultur-Wundverschluss-Assay, bei dem ein Kratzer auf einer konfluenten Zellmonoschicht erzeugt wird. Die Geschwindigkeit des Wundverschlusses und der Zellmigration kann quantifiziert werden, indem Schnappschüsse mit einem regulären inversen Mikroskop in mehreren Zeitintervallen aufgenommen werden. Detaillierteres Zellmigrationsverhalten kann mit dem Zeitraffermikroskopie-System dokumentiert werden. Die zweite Methode, die in dieser Arbeit beschrieben wird, ist der Transwell-Zellmigrations- und Invasionsassay, der die Kapazität der Zellmotilität und Invasivität gegenüber einem Chemo-Lockstoff-Gradienten misst. Unser Ziel ist es, diese Methoden so gut wie möglich zu beschreiben, damit die Verfahren auch mit grundlegenden zellbiologischen Einrichtungen erfolgreich in Forschungslabors durchgeführt werden können.

Der Wundverschluss und die Transwell-Assay Zellmigrationsassay hier vorgestellt wurden mit Maus B16F10 Melanom-Zellen als Modellsystem. In der Wundverschluss Assay wurden B16F10-Zellen in einer 6-Well-Gewebekulturplatte ausgesät und bis 100% Konfluenz von 24 Stunden gezüchtet. Eine Wunde von etwa 700 um breit wurde mit einer Pipettenspitze und der Wundverschluss (Zellwanderung) wurde mit der Zeitraffer-Mikroskopie aufgenommen erzeugt. Alternativ kann auch durch Wundverschluss unter Snapshot-Bilder zu verschiedenen Zeitp...

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Die Zellmigration ist ein äußerst dynamischer Prozess. Sie ist wichtig für zahlreiche physiologische Funktionen wie die normale embryonale Entwicklung, die Immunantwort sowie Krankheitsprozesse. Beispiele hierfür sind Krebsmetastasierung und Entzündung.Die Untersuchung der Zellmigration ist wichtig für ein breites Spektrum biomedizinischer Wissenschaften wie die Krebsbiologie, Immunologie, Zellbiologie und Entwicklungsbiologie. Die Zellmigration kann in vier mechanisch getrennte Schritte unterteilt werden: Ausstülpung, Bildung neuer Adhäsionen, Kontraktion des Zellkörpers und schließlich Ablösung des Zellendes. Hier beschreiben wir zwei einfache Methoden, um die dynamische Natur der Zellmigration *in vitro* sorgfältig zu untersuchen.Die erste Methode ist ein Zellkultur-Einschluss-Assay. Dieser Assay wird häufig verwendet und ist für Labore mit grundlegendster Ausstattung gut zugänglich. Beim Zellkultur-Einschluss-Assay wird mit einer Pipettenspitze ein Kratzer in eine konfluente Zellschicht eingeführt, und im Laufe der Zeit schließt die konfluente Zellschicht die zuvor erzeugte Wunde.Die Dynamik der Zellmigration kann detailliert mithilfe von Zeitrafferaufnahmen oder Einzelbildaufnahmen untersucht werden. Die zurückgelegte Distanz kann gemessen und daraus die Geschwindigkeit berechnet werden, mit der sich die Zellen bewegt haben. Die zweite verwandte Methode, der Transwell-Zellmigrations- und Invasionsassay, ist ebenfalls gut geeignet, um die Migration nach dem Ansäen von Zellen auf eine Transwell-Membran zu verfolgen.Auch allgemein als Boyden-Kammer bekannt. Ihre Migrationsfähigkeit entlang eines Chemoattractant-Gradienten kann gemessen werden. Beide dieser leicht zugänglichen experimentellen Verfahren sind in vielen Forschungsbereichen äußerst wertvoll.Kapitel zwei, Zellkulturgehäuse, Assay. Hallo, mein Name ist Calvin Justice. Ich bin Doktorand im Labor von Dr. Yang aus der Abteilung für Onkologie an der Brody School of Medicine der East Carolina University.Heute werde ich zwei Verfahren demonstrieren, die die Migrations- und Invasionsfähigkeit von Zellen in vitro messen. Beginnen wir nun mit der Zellkultur. Versuch Die in der Zellkultur verwendeten Zellen.Der Assay kann in Zellkulturschalen unter Verwendung herkömmlicher Zellkultivierungstechniken angezüchtet werden. Um zu beginnen, das Wachstumsmedium, das zum Kultivieren der Zellen verwendet wurde, abpipettieren, einmal mit PBS waschen, dann zwei Milliliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung zur Schale hinzufügen und diese für drei Minuten in den Inkubator stellen. Die Schale aus dem Inkubator nehmen und drei Milliliter DMM ergänzt mit 10 % FBS hinzufügen.Entfernen Sie das Medium von der Platte und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Konikalröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1500 U/min. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern DMM, ergänzt mit 10 % FBS.Anschießend die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Nach Beendigung der Zählung eine Zellanzahl impfen, die innerhalb von 24 Stunden konfluent wird. Die Platte 24 Stunden lang in den Inkubator stellen, um die Zellanheftung und -ausbreitung zu ermöglichen.Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Platte zu 100 % konfluent ist. Danach erzeugen Sie im Biosicherheitswerkbank mithilfe einer Pipettenspitze vorsichtig, ohne die Zellkulturplatte zu beschädigen, eine Wunde von der Oberseite der Vertiefung bis zur Unterseite. Nachdem die Wunde mit der Pipettenspitze erzeugt wurde, aspirations das Medium und waschen Sie vorsichtig mit zwei Millilitern Wachstumsmedium. In diesem Fall DMEM mit 10 % FES ergänzen, um eventuell vorhandene Rückstände zu entfernen, und erneut das Medium abpipettieren. Schließlich zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen und, falls verfügbar, die Probe in eine temperatur- und CO2-gesteuerte Kammer unter dem Mikroskop einsetzen. Eine Zeitrafferaufnahmefunktion ist in diesem Fall erforderlich.Die Zeitrafferkapazität ist nicht verfügbar. Machen Sie ein erstes Bild der Markierungsposition und der Vertiefung und stellen Sie die Platte in den Inkubator. Falls Zeitrafferaufnahmen möglich sind, richten Sie die Zeitrafferkapazitäten am Mikroskop ein.Wir stellen unsere Zeitrafferaufnahme auf 16 Stunden ein. Nachdem alle fünf Minuten ein Bild aufgenommen wurde, kann die Platte nach 16 Stunden aus der Kammer entfernt werden und die während der gesamten Versuchsdauer aufgezeichneten Bilder können auf einem USB-Stick gespeichert werden. Stecken Sie den USB-Stick in den Computer und öffnen Sie das Image-J-Programm.Klicken Sie auf Datei. Importieren Sie eine Bildsequenz. Suchen Sie die Bilder, die während des Experiments aufgenommen wurden.Klicken Sie auf die erste Datei und anschließend auf „Öffnen“. Daraufhin werden Optionen für die nächste Sequenz angezeigt. Wählen Sie das erste Bild aus Ihrer Liste von Fotos aus und geben Sie die erforderlichen Inkremente für das Video ein.Jetzt sehen Sie die Optionen für einen VI-Reader. Wählen Sie die am besten geeignete Option, experimentieren Sie und klicken Sie auf „Okay“. Das Image-J-Programm erstellt nun ein Video, speichert das Video, klicken Sie auf Datei und speichern Sie es als VI oder in einem anderen Format, das für Ihr Experiment geeignet ist.Das Video kann anschließend in der Zellstudie auf Migrationsmerkmale hin analysiert werden, die von Interesse sein könnten. Mögliche Merkmale, die untersucht werden können, sind die lamellipodiale Ausstülpung, die Kontraktion des Zellkörpers und die Ablösung des Zellendes. Falls keine Zeitrafferaufnahmen vorliegen, kann die Platte, die nach dem ersten Bild 12 bis 16 Stunden lang in den Inkubator gestellt wurde, entnommen werden.Der ursprünglich fotografierte Bereich sollte erneut fotografiert und mit einem Maßstabsbalken zur weiteren Ausmessung versehen werden. Nachdem die anfängliche Breite der in dem ersten Foto erzeugten Wunde gemessen wurde, sollte die in Pixeln gemessene Breite unter Verwendung des Maßstabsbalkens in Mikrometer umgerechnet werden. Anschließend sollte die Breite der Wunde auf den endgültigen Bildern an derselben Stelle wie zuvor in Pixeln gemessen und erneut mithilfe des Maßstabsbalkens in Mikrometer umgerechnet werden.Der letzte Schritt besteht darin, die endgültige Breite von der Anfangsbreite zu subtrahieren, um die gesamte Breite zu erhalten, um die die Wunde innerhalb des vorgegebenen Zeitraums geschlossen wurde. Die gemessene endgültige Migrationsdistanz sollte durch die vorgegebene Zeit dividiert werden, um die Einschlussgeschwindigkeit in Mikrometern pro Stunde zu erhalten. Die Schnappschussmethode kann in zahlreichen Vertiefungen unterschiedlicher Größe wiederholt werden, um eine quantitativere Analyse der Zellmigration durchzuführen, Kapitel drei, Trans-Well-Zellmigration- und Innovationsassay.Zunächst müssen Sie die Zellen von Interesse für das Verfahren in einer Zellkulturplatte kultivieren. Anschließend waschen Sie einmal mit PBS und lösen die Zellen von Interesse mithilfe eines Zell-Dissociationspuffers oder Trypsin von der Zellkulturplatte ab. Außerdem empfehlen wir, die Literatur über die Auswirkungen von Trypsin auf die von Ihnen untersuchten Zellen zu lesen, da dessen Verwendung Ihre Ergebnisse beeinflussen könnte.Nach der Abtrennung zentrifugieren Sie mit 1500 U/min für fünf Minuten, entfernen und aspirations das vorhandene Medium und resuspendieren die Zellen in 0,1 % BSA. Öffnen Sie die Verpackung des Transwell-Inserts und setzen Sie es in die Vertiefung ein, die für seine jeweilige Größe vorgesehen ist. Falls Sie zuerst den Transwell-Invasionsassay durchführen, geben Sie Matrigel auf die Oberseite des Inserts und inkubieren Sie es 30 Minuten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.Plattieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension auf der Transwell-Membran. Inkubieren Sie 10 Minuten lang, um den Zellen Zeit zum Absinken zu geben. Die Anzahl der plattierten Zellen hängt von der Zellart ab und gegebenenfalls sind nachfolgende Experimente erforderlich.Um diese Zahl zu bestimmen, geben Sie mit einer Pipette vorsichtig das gewünschte Chemoattraktans unter den Insert auf den Boden der Vertiefung. Versuchen Sie, den Insert nicht zu entfernen. Die Inkubationszeit hängt von der Zellart ab.Entfernen Sie die Transwell-Einlage nach der Inkubation und verwenden Sie so oft wie nötig einen Wattestäbchen, um vorsichtig das überschüssige Medium und die Zellen, die nicht in die Membran eingewandert sind, von der Oberseite der Membran zu entfernen. Achten Sie darauf, die Membran nicht zu beschädigen. Geben Sie 600 bis 1000 Mikroliter 70 %igen Ethanol in die untere Kammer einer leeren Einlage.Platzieren Sie den Insert in die Vertiefung mit 70 % Ethanol und inkubieren Sie 10 Minuten lang, um die Zellfixierung zu ermöglichen. Entfernen Sie mithilfe eines Wattestäbchens so oft wie nötig den restlichen Ethanol von den Zellen, die von der Membranoberseite nicht in die Membran eingewandert sind. Geben Sie 600 bis 1000 Mikroliter einer bis zu 0,2 %igen Kristallviolett-Lösung in eine Vertiefung und stellen Sie den Insert zur Zellfärbung hinein.10 Minuten inkubieren. Im Allgemeinen überschüssige Kristallviolett-Farbstoffreste von der Oberseite der Membran entfernen. Dann die Membran, unter großer Vorsicht, um migrierte Zellen nicht abzuwaschen, so oft wie nötig in destilliertes Wasser eintauchen, bis das verbleibende Kristallviolett entfernt ist.Lassen Sie die Membran trocknen, um die Zellen unter dem Mikroskop zu betrachten. Die Membran kann vorsichtig mit dem Skalpell entfernt und auf einen Glasdeckel gelegt werden, oder Sie können die Zellen direkt in den Inserten im Gewebebecher betrachten. Mit einem invertierten Mikroskop sollten mehrere Aufnahmen aus verschiedenen Blickfeldern angefertigt werden.Um eine gute Darstellung der Anzahl migrierter Zellen zu erhalten, kann die Anzahl der Zellen mithilfe des Zählwerkzeugs in Adobe Photoshop bestimmt werden. Die gesammelten Daten können zur optimalen Darstellung Ihrer Ergebnisse in ein Balkendiagramm eingetragen werden. Kapitel vier, repräsentative Ergebnisse.Danach zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse aus dem Zellkultur-Einschluss-Assay und dem Transwell-Zell-Migrations-Assay. Zwei verwandte Methoden zur Untersuchung der Zellmotilität, wie in diesem Video beschrieben. Wir beginnen mit dem Zellkultur-Einschluss-Assay. Hier zeigen wir Momentaufnahmen, die nach 0, 4, 8 und 12 Stunden aufgenommen wurden.Wie Sie sehen können, können nach der Erzeugung der Wunde Bilder aufgenommen werden und im Zeitverlauf kann der Abstand der Wundschließung gemessen werden. Unsere Daten stellen wir mithilfe eines Streudiagramms dar und mit der zuvor erörterten Methode bestimmen wir die Geschwindigkeit der Wundschließung über die Zeit. Darüber hinaus kann auch die Einzelzellmigration detailliert mittels Zeitrafferaufnahmen untersucht werden.In diesem Fall zoomen wir während des Wundverschlusses auf einzelne Zellen, verfolgen ihre Migration im Zeitverlauf und beobachten ihre Bewegungsmerkmale. Dazu zählen beispielsweise die Ausbildung einer führenden Kante, die Retraktion des Zellendes und die allgemeine Fortbewegung, die detailliert untersucht werden können. Im Folgenden werden einige Ergebnisse des Querzell-Migrationsassays betrachtet. Hier zeigen wir zwei Bilder, die nach dem Transwell-Zell-Migrationsassay von der Membran aufgenommen wurden.Das erste Bild zeigt die Ergebnisse ohne Chemoattraktant, bei denen kaum bis keine Zellmigration durch die Membran stattfand. Das zweite Bild zeigt die Ergebnisse mit Chemoattraktant, bei denen eine erhöhte Zellmigration zur Membran beobachtet wurde. Rechts zeigen wir die quantitativen Ergebnisse unseres Experiments anhand eines Balkendiagramms mit Fehlerbalken, die den Standardfehler darstellen.Kapitel fünf, Schlussfolgerung: Die Daten, die nach dem Zellkulturverschluss-Assay im transversalen Zellwanderungs- oder Invasionstest gesammelt werden, zeigen die Migrationsfähigkeit von Zellen in einer 2D- oder 3D-Umgebung auf. Diese Ergebnisse können mit anderen Ergebnissen verglichen werden, um möglicherweise zuvor unbekannte Daten offenzulegen, und sie können außerdem mit anderen biochemischen Tests korrelieren. Diese beiden miteinander verwandten, häufig verwendeten Tests sind wertvoll und für die grundlegendsten Einrichtungen der Zellbiologie leicht zugänglich.Wir danken Ihnen, dass Sie sich uns heute angeschlossen haben, und wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren zukünftigen wissenschaftlichen Vorhaben.

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