In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

Die Zellmigration ist ein hochdynamischer Prozess. Es ist wichtig für verschiedene physiologische Funktionen wie die normale Embryonalentwicklung, die Immunantwort sowie Krankheitsprozesse. Zum Beispiel Krebsmetastasen und Entzündungen.

Die Erforschung der Zellmigration ist wichtig für ein breites Spektrum biomedizinischer Wissenschaften wie Krebsbiologie, Immunologie, Zellbiologie und Entwicklungsbiologie. Die Zellmigration kann in vier mechanisch getrennte Schritte unterteilt werden: die Verlängerung, die Bildung neuer Adhäsionen, die Kontraktion des Zellkörpers und schließlich die Schwanzablösung. Im Folgenden beschreiben wir zwei einfache Methoden, um die dynamische Natur der Zellmigration in vitro sorgfältig zu untersuchen.

Die erste Methode ist eine Zellkultur oder ein Enclosure-Assay. Dieser Assay wird häufig verwendet und ist für Labore mit den grundlegendsten Laboreinrichtungen leicht zugänglich. Der Zellkultur-of-Enclosure-Assay ist ein Assay, bei dem unter Verwendung einer Pipettenspitze und Kratzer, die auf einer konfluenten Monoschicht von Zellen erzeugt werden, die konfluente Zellmonoschicht im Laufe der Zeit die zuvor hergestellte Wunde schließt.

Die Dynamik der Zellmigration kann mit Hilfe von Time-Ops-Fotografie oder mit Hilfe von Schnappschüssen detailliert untersucht werden. Die Entfernung kann gemessen werden, und im Laufe der Zeit kann die Geschwindigkeit, mit der sich die Zellen bewegt haben, berechnet werden. Die zweite verwandte Methode, der Transwell-Zellmigrations- und Invasionsassay, ist ebenfalls leicht zugänglich, da sie die Beschichtung von Zellen auf eine Transwell-Membran verfolgt.

Auch allgemein bekannt als Boyden-Kammer. Ihre Migrationsfähigkeit in Richtung Chemo-Lockstoffgradient kann gemessen werden. Diese beiden leicht zugänglichen experimentellen Verfahren sind in vielen Bereichen der Forschung von großem Wert.

Zweites Kapitel, Zellkulturgehäuse, Assay. Hallo, mein Name ist Calvin Justice. Ich bin Doktorandin in Dr. Yangs Labor in der Abteilung für Onkologie an der Brody School of Medicine an der East Carolina University.

Und heute werde ich zwei Verfahren demonstrieren, mit denen die Migrations- und Invasionsfähigkeiten von Zellen in vitro gemessen wurden. Beginnen wir nun mit der Einschließung der Zellkultur. Essay Die Zellen, die im Zellkulturgehäuse verwendet werden.

Der Assay kann in Gewebekulturplatten unter Verwendung herkömmlicher Zellkulturtechniken gezüchtet werden. Um mit dem Aspirieren des Wachstumsmediums zu beginnen, das zum Züchten der Zellen verwendet wird, waschen Sie es einmal mit PBS, geben Sie dann zwei Milliliter zu 0,25% Tripsin EDTA in die Platte und geben Sie es für drei Minuten in den Inkubator. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie drei Milliliter DMM hinzu, die mit 10 % FES ergänzt sind.

Nehmen Sie das Medium von der Platte und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang mit 1500 U/min. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in zwei Millilitern DMM, ergänzt mit 10 % FES, wieder suspendiert.

Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Wenn Sie mit dem Zählen fertig sind, wird eine Anzahl von Zellen plattiert, die innerhalb von 24 Stunden zusammenfließen. Legen Sie die Platte für 24 Stunden in den Inkubator, damit sich die Zellen anheften und ausbreiten können.

Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und betrachten Sie sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Platte zu 100 % konfluent ist. Machen Sie dann in der Biosicherheitshaube vorsichtig mit der Pipettenspitze, ohne die Gewebekulturplatte zu beschädigen, eine Wunde von der Oberseite der Vertiefung nach unten. Nachdem Sie die Wunde mit der Pipettenspitze erzeugt haben, aspirieren Sie das Medium und waschen es vorsichtig mit zwei Millilitern Wachstumsmedium.

In diesem Fall wird DMEM, ergänzt mit 10 % FES, um alle vorhandenen Ablagerungen wegzuspülen, das Medium erneut abgesaugt. Zum Schluss fügen Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu und geben Sie, falls verfügbar, das Spiel in eine temperatur- und CO2-kontrollierte Kammer unter dem Mikroskop. Eine Zeitraffer-Fotofunktion im Koffer.

Die Zeitrafferfunktion ist nicht verfügbar. Machen Sie ein erstes Foto von der Markierungsposition und der Vertiefung und legen Sie die Platte in den Inkubator. Wenn Zeitrafferfotografie verfügbar ist, richten Sie die Zeitrafferfunktionen am Mikroskop ein.

Wir stellen unseren Zeitraffer auf 16 Stunden ein. Mit einem Bild, das alle fünf Minuten nach 16 Stunden aufgenommen wird, kann die Platte aus der Kammer entfernt und die Bilder, die während der Dauer des Experiments aufgenommen wurden, können auf einem Flash-Laufwerk gespeichert werden. Schließen Sie den USB-Stick an den Computer an und öffnen Sie das Image J-Programm.

Klicken Sie auf Datei. Importieren Sie eine Bildsequenz. Suchen Sie die Bilder, die während des Experiments aufgenommen wurden.

Klicken Sie auf die erste Datei und dann auf Öffnen. Die nächsten Sequenzoptionen werden angezeigt. Wählen Sie das erste Bild in Ihrer Fotoliste aus und geben Sie die Schritte ein, die Sie für das Video benötigen.

Jetzt sehen Sie die Optionen für ein VI-Lesegerät. Wählen Sie aus, was am besten geeignet ist, experimentieren Sie und klicken Sie. Okay. Das Programm Image J erstellt nun ein Video, speichert das Video, klickt auf Datei, speichert als VI oder eine andere Option, die für Ihr Experiment geeignet ist.

Das Video kann dann in der Zellstudie auf Migrationsmerkmale analysiert werden, die von Interesse sein könnten. Mögliche Merkmale, die untersucht werden können, sind die Ausdehnung des La Malo Podus, die Kontraktion des Zellkörpers und die Ablösung des Schwanzes. In Ermangelung von Zeitverlustfotos kann die Platte, die 12 bis 16 Stunden nach dem ersten Bild in den Inkubator gelegt wurde, entfernt werden.

Der Bereich, der ursprünglich fotografiert wurde, sollte erneut fotografiert werden und für weitere Messungen muss ein Maßstabsbalken hinzugefügt werden. Nach dem Messen der anfänglichen Breite der Wunde, die auf dem ersten Foto erzeugt wurde, sollte die in Pixel gemessene Breite mit Hilfe eines Maßstabsbalkens in Mikrometer umgerechnet werden. Als nächstes sollte die Wundbreite des endgültigen Bildes in Pixeln im gleichen Bereich wie zuvor gemessen und mit der Maßstabsleiste wieder in Mikrometer umgerechnet werden.

Der letzte Schritt besteht darin, die endgültige Breite von der ursprünglichen Breite zu subtrahieren, um die Gesamtbreite zu erhalten, die die Wunde innerhalb des zugewiesenen Zeitraums geschlossen hat. Die endgültige gemessene Migrationsstrecke sollte durch die Zeit geteilt werden, die der Geschwindigkeit des Gehäuses und Mikrometern pro Stunde zugewiesen ist. Die Snapshot-Methode kann in zahlreichen Vertiefungen anstelle von Vertiefungen unterschiedlicher Größe wiederholt werden, um eine quantitativere Analyse der Zellmigration zu ermöglichen, Kapitel drei, trans Well Zellmigration und Innovation Assay.

Zu Beginn müssen Sie zunächst die interessierenden Zellen in einer Gewebekulturplatte für den Eingriff züchten. Waschen Sie sich anschließend einmal mit PBS und lösen Sie die interessierenden Zellen von der Gewebekulturplatte mit der Zelldissoziation, dem Puffer oder dem Trypsin. Wir empfehlen Ihnen auch, die Literatur darüber zu lesen, wie Trypsin die Zellen beeinflussen kann, die Sie untersuchen, da seine Verwendung Ihre Ergebnisse beeinflussen kann.

Nach der Ablösung eine Zentrifuge von 1500 U/min für fünf Minuten durchführen, das vorhandene Medium entfernen und absaugen, dann die Zellen und 0,1 % BSA resuspendieren. Öffnen Sie die Verpackung des Transwell-Einsatzes und legen Sie ihn in die Vertiefung, die für seine jeweilige Größe vorgesehen ist. Wenn Sie zuerst den Transwell-Invasions-Assay durchführen, geben Sie Matrigel auf die Oberseite des Einsatzes und inkubieren Sie es 30 Minuten lang, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Platte 100 Mikroliter Zelllösung auf die Transwell-Membran legen. Inkubieren Sie 10 Minuten lang, damit sich die Zellen beruhigen können. Die Anzahl der plattierten Zellen hängt vom Zelltyp ab und es können weitere Experimente erforderlich sein.

Um diese Zahl zu bestimmen, geben Sie mit einer Pipette vorsichtig den gewünschten Chemo-Lockstoff unter dem Einsatz am Boden der Vertiefung an. Versuchen Sie, den Einsatz nicht zu entfernen. Die Inkubationszeit ist abhängig vom Zelltyp.

Entfernen Sie den Transwell-Einsatz nach der Inkubation und verwenden Sie einen Wattestäbchenapplikator so oft wie nötig, um die überschüssigen Medien und Zellen, die nicht in die Membran migriert sind, vorsichtig von der Oberseite der Membran zu entfernen. Achten Sie darauf, die Membran nicht zu beschädigen. Geben Sie 600 bis 1000 Mikroliter 70%iges Ethanol in die untere Kammer eines leeren Behälters.

Setzen Sie den Ole-Einsatz mit 70 % Ethanol in die Vertiefung ein und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang, um eine Zellfixierung zu ermöglichen. Verwenden Sie auch hier so oft wie nötig einen Wattestäbchen-Applikator, um das restliche Ethanol in Zellen zu entfernen, die nicht von der Oberseite der Membran in die Membran migriert sind. Geben Sie 600 bis 1000 Mikroliter bis zu 0,2 % Kristallviolett in eine Vertiefung und positionieren Sie den Einsatz für die Zellfärbung darin.

10 Minuten inkubieren. Entfernen Sie im Allgemeinen den überschüssigen kristallvioletten Farbstoff von der Oberseite der Membran. Tauchen Sie die Membran dann so oft wie nötig in das destillierte Wasser, um das restliche Kristallviolett zu entfernen, um ein Abwaschen der migrierten Zellen zu vermeiden.

Lassen Sie die Membran trocknen, um die Zellen mit einem Mikroskop zu betrachten. Die Membran kann vorsichtig mit dem Skalpell entfernt und auf ein gläsernes Deckglas gelegt werden, oder Sie können die Zellen mit den noch im Testament befindlichen Einsätzen betrachten. Mit einem inversen Mikroskop sollte ein Bild von mehreren Gesichtsfeldern aufgenommen werden.

Um eine gute Darstellung der Anzahl der migrierten Zellen zu erhalten, kann die Anzahl der Zellen mit dem Zählwerkzeug von Adobe Photoshop gezählt werden. Die gesammelten Daten können in ein Balkendiagramm eingefügt werden, um die Ergebnisse bestmöglich darzustellen. Viertes Kapitel, repräsentative Ergebnisse.

Als Nächstes führen wir Sie durch einige repräsentative Ergebnisse des Zellkultur-of-Enclosure-Assays und des Transwell-Zellmigrationsassays. Zwei verwandte Methoden zur Untersuchung der Zellmotilität, wie in diesem Video beschrieben, beginnen wir mit dem Zellkultur-of-Enclosure-Assay. Hier zeigen wir Schnappschüsse, die um 0 4 8 in 12 Stunden aufgenommen wurden.

Wie Sie sehen können, können nach der Generierung der Wunde Bilder gemacht werden und im Laufe der Zeit kann der Abstand des Wundverschlusses gemessen werden. Wir stellen unsere Daten mit Hilfe eines Streudiagramms dar und bestimmen mit der zuvor besprochenen Methode die Geschwindigkeit des Wundverschlusses über die Zeit. Darüber hinaus kann die Migration einzelner Zellen auch mit Hilfe von Zeitrafferaufnahmen im Detail untersucht werden.

In diesem Fall zoomen wir während des Wundverschlusses in einzelne Zellen hinein, verfolgen ihre Wanderung über die Zeit und beobachten ihre Bewegung. Merkmale wie eine Vorderkantenverlängerung, das Zurückziehen des Schwanzes und die allgemeine Bewegung können im Detail untersucht werden. Im Folgenden gehen Sie auf einige Ergebnisse des transversalen Zellmigrationsassays ein. Hier zeigen wir zwei Bilder, die von der Membran und nach dem Transwell-Zellmigrationsassay aufgenommen wurden.

Das erste Bild zeigt die Ergebnisse ohne Chemolockstoff, bei denen es wenig bis keine Zellmigration durch die Membran gab. Das zweite Bild zeigt die Ergebnisse mit Chemotraktoren, bei denen es zu einer erhöhten Zellmigration zur Membran kam. Auf der rechten Seite zeigen wir die Quantifizierungsergebnisse unseres Experiments mit einem Balkendiagramm mit Fehlerbalken an, die den Standardfehler darstellen.

Kapitel fünf, Schlussfolgerung Die Daten, die nach dem Zellkultur-Enclosure-Assay im transversalen Zellmigrations- oder Invasionsassay gesammelt werden, zeigen die Migrationsfähigkeiten von Zellen in einer 2D-Umgebung oder einer 3D-Umgebung. Diese Ergebnisse können mit anderen Ergebnissen verglichen werden, um möglicherweise Daten zu enthüllen, die bisher unbekannt waren, und sie können auch mit anderen biochemischen Tests korrelieren. Diese beiden verwandten, häufig verwendeten Tests sind wertvoll und für die grundlegendsten zellbiologischen Laboreinrichtungen leicht zugänglich.

Wir danken Ihnen, dass Sie heute bei uns sind, und wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren zukünftigen wissenschaftlichen Unternehmungen.