Shock Wave Anwendung auf Zellkulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ablenkende physikalische Effekte während einer in-vitro-Schockwellenbehandlung zu vermeiden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Zellkulturfläschchen vollständig mit Kulturmedium gefüllt und anschließend in ein beheiztes Wasserbad gestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine großzügige Menge Ultraschallgel zu verwenden, um den Applikator an das Wasserbad anzukoppeln.

Danach wird der Applikator horizontal gegen die Membran des Wasserbades angebracht. Der letzte Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Stoßwellenquelle mit der Mitte des Zellkulturfläschens ausgerichtet ist, damit sich die Zellen im Fokus der Welle befinden. Abschließend kann eine Analyse Ihrer Zellen beispielsweise mittels Echtzeit-PCR und einem Zytokin-Array durchgeführt werden, um Veränderungen in den Genen und Zytokinen von Interesse nachzuweisen.

Die Idee für dieses Modell entstand zunächst, als wir feststellten, dass bei bestehenden Methoden zur direkten Anwendung kurzer Wellen auf Zellkulturen der Effekt der Wellenreflexion an der Grenzfläche vom Kulturmedium zur umgebenden Luft nicht berücksichtigt wird. Die Durchführung des Verfahrens wird Dr. Chante, Doktorandin meiner Forschungsgruppe, demonstrieren. Zum Beginn erwärmen Sie 3,5 Liter Leitungswasser auf 37 Grad Celsius.

Danach das erhitzte Wasser in das Wasserbad umfüllen. Der Wasserstand sollte drei Zentimeter unterhalb der Oberkante des Wasserbades liegen und die Membran vollständig bedecken. Anschließend den Temperatursensor mit einer Stromversorgung verbinden und den Temperatursensor in die Halterung an der Rückwand des Wasserbades einsetzen.

Dann, während das Wasser gerührt wird, den Heizer kontinuierlich mit einer Stromversorgung verbinden und das Wasser auf eine stabile Temperatur von 37 Grad Celsius erwärmen. Unter sterilen Bedingungen. Zellen in T-25-Kulturflaschen ansiedeln.

Sie erreichen so nach einer Übernachtinkubation eine Konfluenz von 90 %. Danach die Flaschen senkrecht stellen und mit Kulturmedium bis zum Ansatz des Flaschenhalses füllen, um Kontaminationen zu vermeiden. Das Medium darf weder den Flaschenhals noch die Verschlusskappe berühren.

Schließen Sie die Kolben danach mit einem festen Verschluss ohne Filter, um eine Kontamination durch das Wasser im Wasserbad zu verhindern. Versiegeln Sie die Verschlüsse anschließend mit Parafilm. Befestigen Sie die versiegelten Kolben in einem Stativ.

Danach die fixierten Kolben in das Wasserbad einsetzen und die Mitte des Zellkulturkolbens mit der Mitte der Membran des Stoßwellenapplikators ausrichten. Reichlich Ultraschallleitgel auf den Stoßwellenapplikator und die Membran des Wasserbades auftragen. Anschließend den Applikator mit der Membran verbinden und sicherstellen, dass sich keine Luftblasen dazwischen befinden.

Als Nächstes halten Sie den Stoßwellenapplikator in der Mitte der Membran und stellen Sie sicher, dass er horizontal und vertikal mit dem Zellkulturkolben ausgerichtet ist, um eine Behandlung des gesamten Zellwachstumsbereichs zu gewährleisten. Führen Sie anschließend ein Vorversuch durch, um den idealen Abstand zwischen dem Stoßwellenapplikator und dem Kulturkolben sowie die korrekten Behandlungsparameter zu bestimmen. Achten Sie darauf, den Kulturkolben und den Applikator während der Aktivierung des Stoßwellengeräts in einer stabilen Position zu halten.

Nachdem ein idealer Abstand bestimmt wurde, führen Sie das Experiment unter den gewünschten Stoßwellenbehandlungsparametern durch. Nach Abschluss der Stoßwellenbehandlung entfernen Sie die Zellkulturflasche aus dem Wasserbad, trocknen sie mit Papiertüchern ab und desinfizieren die Außenfläche der Flasche. Überführen Sie anschließend das Medium aus der Flasche in ein Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen unter normalen Zentrifugationsbedingungen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern Zellkulturmedium und überführen Sie die Zellsuspension anschließend in den Kolben mit fünf Millilitern Zellkulturmedium. Kultivieren Sie die Zellen bis zur erforderlichen Konfluenz für zelluläre Analyseexperimente. Die Echtzeit-PCR-Analyse von humanen Nabelvenenendothelzellen zeigte eine Hochregulation der tie2-mRNA-Spiegel nach der Stoßwellenbehandlung.

Dies deutet darauf hin, dass eine Stoßwellenbehandlung die Proliferation von Endothelzellen und die Angiogenese verstärkt. Die Zytokinspiegel in der Nabelvene wurden mittels eines Zytokinarrays quantifiziert.

Es wurde ebenfalls eine signifikante Zunahme der beiden entzündlichen Zytokine IL-6 und IL-8 festgestellt, die beide an der Entzündung beteiligt sind, die den angiogenetischen Prozess nach seiner Entstehung begleitet. Diese Technik ebnete zahlreichen Forschern auf dem Gebiet der Grundlagenforschung zu Stoßwellen den Weg, um Effekte an einzelnen Zelltypen in In-vitro-Experimenten zu untersuchen. Wir hoffen, noch mehr Forscher davon überzeugen zu können, dieses Modell zu nutzen, um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse in der Stoßwellenforschung zu erzielen.