Eine Methode, um die Auswirkungen der Chemisch-induzierte Ovarialinsuffizienz on Exercise Cardiac Kapazität und Anpassung in Mäusen untersucht

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den natürlichen Prozess der follikulären Atresie in den Eierstöcken zu beschleunigen, wodurch ein Ovarialversagen, ein Abbau von Östrogen und eine nicht zyklische weibliche Person entstehen – ein Zustand, der der Menopause stark ähnelt. Dies wird erreicht, indem zunächst 15 bis 20 aufeinanderfolgende Tage lang die beruflich relevante chemische Substanz Vinylcyclohexendioxid oder VCD verabreicht wird, die nachweislich gezielt kleine primäre und primordiale Eierstockfollikel angreift und zerstört, indem sie deren natürlichen Atresieprozess beschleunigt. Der zweite Schritt besteht darin, den Östruszyklus und die Ovarialzyklizität mittels Vaginalzytologie zu bestimmen, die etwa sechs Wochen nach Beginn der VCD-Injektionen beginnt.

Um den Verlust des Zyklus und ein Ovarialversagen zu bestätigen, müssen 15 bis 20 Tage anhaltender Diöstrus oder Nicht-Zyklus mittels vaginaler Zytologie überprüft werden. Der letzte Schritt besteht darin, eine Intervention durchzuführen, die von der Menopause oder dem Übergang zur Menopause beeinflusst werden könnte, wie beispielsweise freiwillige Laufradaktivität im Käfig oder kardiale Anpassung. Letztendlich wird die freiwillige Laufradaktivität im Käfig und die kardiale Anpassung genutzt, um zu zeigen, ob die Menopause die Laufradaktivität im Käfig verringert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ovariectomy besteht darin, dass die Ovariectomy ein chirurgisches Verfahren ist, das zu einer plötzlichen Abnahme des Östrogens führt, was sich von dem natürlichen, progressiven Östrogenverlust unterscheidet, wie er während des Übergangs von der Prä- zur Postmenopause auftritt. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei postmenopausalen Frauen, da postmenopausale Frauen im Vergleich zu prämenopausalen Frauen besonders anfälliger für das metabolische Syndrom und die damit verbundenen Komorbiditäten, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen, sind. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Vaginalzytologie schwer zu erlernen sind, weil sorgfältig auf die korrekte Ausstrichtechnik und die Identifizierung des EST-Zyklus geachtet werden muss.

Vier, Vinylcyclindioxid oder VCD wird bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Um VCD für das Injektionsprotokoll vorzubereiten, geben Sie 0,587 Milliliter VCD in ein sauberes Dosierfläschchen und stellen Sie das Endvolumen auf 10 Milliliter mit Sesamöl ein, decken und versiegeln Sie mit Parafilm und mischen Sie durch vorsichtiges Umstülpen. Lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zu sieben Tage lang.

Um das VCD-Injektionsprotokoll zu beginnen, wiegen Sie zwei Mäuse im Alter von zwei Monaten an 20 aufeinanderfolgenden Tagen, verabreichen Sie täglich intraperitoneale Injektionen von VCD bei Raumtemperatur in einer Dosis von 160 Milligramm pro Kilogramm unter Verwendung einer 27-Gauge-Nadel während des Injektionszeitraums. Versuchen Sie, die Injektionsstellen abzuwechseln, um die Wahrscheinlichkeit einer lokalen Infektion auf ähnliche Weise zu verringern. Injizieren Sie Kontrollmäuse nach Abschluss des Injektionszeitraums mit der Trägerlösung Sesamöl in einem Volumen von 2,5 Milliliter pro Kilogramm.

Überwachen Sie den Östruszyklus täglich durch Entnahme von Vaginalabstrichen. Einer der entscheidenden Faktoren für den Erfolg dieser Studie ist die Gewinnung hochwertiger Vaginalabstriche zur zytologischen Bestimmung. Fixieren Sie die Mäuse mithilfe der Nackenfellschlaufen-Methode.

Fügen Sie einen Pipettenkopf mit 0,2 Milliliter steriler Kochsalzlösung in die Vaginalöffnung bis zu einer Tiefe von 0,5 Zentimetern ein. Mischen Sie die injizierte Kochsalzlösung dreimal mit der Pipette und geben Sie anschließend einen Tropfen auf einen leeren Objektträger. Untersuchen Sie jede Probe unverzüglich mikroskopisch mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung, um einen Ovarialversagen zu bestätigen.

Anschließend werden die durch VCD induzierten menopausalen Mäuse für die Trainingsversuche verwendet. Die Laufradvorrichtung besteht aus einem Rad mit einem Durchmesser von 11,5 Zentimetern und einer fünf Zentimeter breiten Lauffläche, die mit einem digitalen magnetischen Zähler ausgestattet ist, der durch die Radrotation aktiviert wird. Kalibrieren Sie das Käfiglaufrad vor jedem Laufradtest gemäß den Herstelleranweisungen.

Messen Sie den Innendurchmesser des Laufrads. Berechnen Sie den Umfang und geben Sie diesen Wert als Radgröße in den digitalen Zähler ein, um das Rad an der Käfigseite anzubringen. Führen Sie das Rad durch die obere Verdrahtung des Tierkäfigs.

Befestigen Sie den Laufradständer mit Kabelbindern am Käfiggitter. Die Binder sollten sich oben am Gitter befinden, weg von dem Tier. Führen Sie den Computer-Teil und jedes zusätzliche Kabel durch das Gitter des Käfigs.

Platzieren Sie den Computer und ein überschüssiges Kabel so, dass das Tier nicht darauf zugreifen kann. Dies kann erreicht werden, indem eine mittelgroße, plastische Wiegeschale auf die Verkabelung des Käfigs gestellt wird, um den Computer und das überschüssige Kabel zu fixieren. Befestigen Sie anschließend den Computerteil des digitalen magnetischen Zählers an der Laufradhalterung.

Befestigen Sie mit Klebeband den freien Magneten des digitalen Magnetzählers an der zentralen Stange auf der gleichen Seite wie das Magnetkabel zum Computer. Kleben Sie erneut ausreichend, um den Magneten vor Beschädigungen durch Kauen zu schützen. Der Magnet sollte so positioniert sein, dass jede Umdrehung des Rades vom Computer erfasst wird, ohne dass eine Störung oder Behinderung einer vollständigen Radumdrehung auftritt.

Befestigen Sie das Laufrad an dem Rad, indem Sie die Ständerpfosten in die Befestigungslöcher an den zentralen Stäben des Rads einsetzen. Stellen Sie sicher, dass sich das Rad frei drehen kann.

Die Anlage sollte täglich auf Beschädigungen durch Nagen überprüft und bei Bedarf für die Dauer des Experiments repariert werden. Sieben Monate alte, inzüchtige C57, schwarze Sechs- und B6C3F1-weibliche Mäuse aus einem bestimmten Wurf werden zufällig entweder dem Trainingsprogramm oder der sitzenden Kontrollgruppe zugewiesen. Wie werden die Versuchstiere einzeln gehalten? In einem 47 × 26 × 14,5 cm großen Käfig mit ungehinderter Nutzung eines Laufrades für 28 Tage. Kontrolltiere werden gemeinsam in einem Käfig ohne Rad gehalten.

Stellen Sie allen Tieren Wasser und standardmäßiges Hartfutter für Nagetiere zur Verfügung. Fügen Sie Lido manuell hinzu und notieren Sie täglich die vom magnetischen Zähler angegebenen Werte für die gelaufene Distanz und die gesamte Laufzeit. Erfassen Sie Distanz- und Zeitwerte stets innerhalb desselben einstündigen Zeitfensters, um über die gesamte 28-tägige Trainingsdauer hinweg genaue und konsistente Werte zu erhalten. Löschen Sie nach jeder täglichen Aufzeichnung den magnetischen Zähler, um am folgenden Tag genaue Messwerte sicherzustellen.

Am Ende der bestimmten Trainingsphase werden die Körpergewichte der euthanasierten Tiere vor der Gewebeentnahme aufgezeichnet. Um das Herz zu präparieren, führen Sie einen medianen Schnitt an der ventralen Seite durch, öffnen das Zwerchfell und visualisieren das Herz rasch. Entfernen Sie das Herz an der Basis und legen Sie es in kalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um verbleibendes ventrikuläres Blut ausreichend auszuwaschen. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe am Herzen, wiegen Sie das gesamte Herz ab und tiefgefrieren Sie es gegebenenfalls augenblicklich in flüssigem Stickstoff.

Sammlen Sie zusätzliche Exzisate, waschen Sie diese mit einer modifizierten eiskalten phosphatgepufferten Kochsalzlösung, schockfrieren Sie sie und kühlen Sie sie in Isopentan, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. In dieser Studie wurde ein Ovarialversagen durch eine VCD-Behandlung induziert und durch mikroskopische Untersuchung von Vaginalabstrichen bestätigt. Der Stadium im Östruszyklus wird anhand des Anteils epithelialer Zellen bestimmt, wobei quantifizierte epitheliale Zellen und Leukozyten in PROEs kernhaltige epitheliale Zellen überwiegen.

Hier zeigen die Pfeile nukleierte Zellen, während während der Östrophasen überwiegend nicht nukleierte, quantifizierte plattenepitheliale Zellen vorliegen. Das Mastrum zeichnet sich durch eine Mischung von Zelltypen mit einer Vorherrschaft von Leukozyten aus. Das Diestrus wird von Leukozyten dominiert.

Der Östrogenzyklus bei Mäusen dauert normalerweise vier Tage, bevor VCD injiziert wird. Tiere wurden nach 15 Tagen anhaltender Diöstrus als azylisch betrachtet. Diese Abbildung zeigt die durchschnittliche Dauer in Tagen des östrogenen Zyklus der mit Fahrzeugmittel und VCD behandelten Gruppen.

Ein Zyklus wird vom ersten Tag der ES bis zum ersten Tag der nächsten Periode gemessen. Die vaginale Zytologie begann in der ES etwa sechs Wochen nach Beginn der Injektionen. Es wurde beobachtet, dass die Östrogenzyklen der mit VCD behandelten Tiere im Vergleich zu den mit Vehicle behandelten Tieren unregelmäßig wurden und nach 12 Östrogenzyklen die Zytologie aller mit VCD behandelten Tiere am Ende des VCD-Injektionsprotokolls nicht mehr auf einen zyklischen Verlauf hindeutete. Die H- und E-Färbung von Querschnitten des Ovarialgewebes zeigte eine signifikante Atrophie des mit VCD behandelten Ovarialgewebes im Vergleich zu den Kontrollen.

Bei einer Vergrößerung von 20x bei 200facher Vergrößerung wurde eine vollständige Ausschöpfung der primären und primordialen Follikel im mit VCD behandelten Gewebe beobachtet. Im Gegensatz zum mit Vehicle behandelten Gewebe wurde der Effekt eines VCD-induzierten Ovarialversagens auf die sportliche Leistung bei sieben Monate alten Mäusen zweier Stämme getestet, denen VCD bzw. Vehicle verabreicht worden war; die täglichen Werte für Käfigradlauf wurden über einen Zeitraum von vier Wochen für Zeit und Distanz für jedes trainierende Tier aufgezeichnet. Diese Abbildung zeigt die wöchentlichen Durchschnittswerte der täglichen Laufleistungen bezüglich Distanz, Zeit und Geschwindigkeit.

Bei C57BL/6-Mäusen, die entweder mit Vehicle oder VCD behandelt wurden, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der körperlichen Leistungsfähigkeit, gemessen an der täglichen durchschnittlichen Laufdistanz und der Zeit, die auf dem Laufrad verbracht wurde, zwischen den mit VCD und den mit Vehicle behandelten Gruppen – weder bei der C57BL/6- noch bei der B6C3F1-Mausrasse. Dies deutet darauf hin, dass die Auswirkung des durch VCD induzierten Ovarialversagens auf die freiwillige Laufradaktivität mindestens zwei Mausrassen überdauert, und zwar über die gesamte Dauer des Protokolls zur freiwilligen Käfiglaufradaktivität hinweg. Körperliche Morphometrie-Daten wurden erfasst, und die Herzen wurden rasch entnommen und gewogen, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt.

Kardiomegalie als Reaktion auf Laufradtraining, gemessen anhand des absoluten Herzgewichts und des auf die Schienbeinlänge normalisierten Herzgewichts, wurde beobachtet. Obwohl die absolute Herzmasse sowie das Verhältnis von Herzgewicht zur Schienbeinlänge bei mit Fahrzeuglösung und VCD behandelten Mäusen im Vergleich zu inaktiven Tieren signifikant höher waren, zeigten sich keine messbaren Unterschiede bezüglich der kardialen Hypertrophie zwischen der Kontrollgruppe und der durch VCD induzierten Ovarialinsuffizienz. Mäuse nach freiwilligem Laufradtraining wurden abschließend einer erzwungenen Laufbandbelastung unterzogen, um die Leistungsfähigkeit bei intensiver und leichter körperlicher Belastung zu bestimmen.

Beim Hochintensitätsprotokoll wurde die durchschnittliche Laufbandgeschwindigkeit schrittweise alle 10 Minuten erhöht, bis die Mäuse Anzeichen von Erschöpfung zeigten. Im Durchschnitt betrug die maximale Geschwindigkeit bei mit Vehicle behandelten Mäusen 26,7 ± 0,95 Meter pro Minute und die maximale Geschwindigkeit bei mit VCD behandelten Mäusen 28 ± 1,4 Meter pro Minute vor der Erschöpfung. Eine niedrigere Laufintensität von 20 Metern pro Minute wurde verwendet, um die Ausdauerleistungsfähigkeit zu bestimmen.

Im Durchschnitt betrug die maximale Laufzeit der mit Vehicle behandelten Mäuse 28,3 ± 1,3 Minuten und die der mit VCD behandelten Mäuse 29,7 ± 1,4 Minuten vor der Erschöpfung. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Belastungsfähigkeit bei hoher oder niedriger Intensität zwischen den mit Vehicle und VCD behandelten Gruppen gefunden, was darauf hindeutet, dass die durch VCD induzierte Ovarialinsuffizienz keinen Einfluss auf die körperliche Leistungsfähigkeit der Mäuse hatte. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen der zellulären, molekularen und physiologischen Wissenschaften, um die Rolle der Menopause bei Nagetieren zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die korrekten VCD-Injektionen durchführt, die vaginale Zytologie ausführt und eine physiologische Intervention durchführt.