Beispiel Drift Korrektur Nach 4D Konfokale Zeitraffer-Imaging

Die Zeitraffermikroskopie ermöglicht eine Visualisierung der Entwicklungs-, Wachstums- oder Driftprozesse der Probe, die über dieses Bild erfolgen. Die Akquisition kann dazu führen, dass die Zellbewegungen nicht verfolgt oder verfolgt werden können, das folgende Protokoll. Wir verwenden Open-Source-Software zur Bildverarbeitung, um die dreidimensionale Drift im Laufe der Zeit zu korrigieren.

Die Erfassung einer Reihe von optischen Schnitten in verschiedenen Fokusebenen ermöglicht die Erstellung eines dreidimensionalen Modells der Probe. Dies kann auf vier Dimensionen erweitert werden, indem eine Zeitrafferreihe von 3D-Datensätzen erstellt wird. In Langzeit-Zeitrafferexperimenten ist es üblich, Probenbewegungen zu beobachten.

Dies kann durch Gleitgenauigkeiten in der Hardware-Steuerstufe und Fokuspositionen verursacht werden, während in anderen Fällen Drifter als Ergebnis von Bewegungen, die durch Probenwachstum oder Flexibilität innerhalb des Eindeckmediums induziert werden, Verfahren zur Kompensation existieren, um diese Bewegungen mit vielen Verbesserungen an Hardware-Fokussierungssystemen und der erhöhten Steifigkeit des Einbettmediums zu begrenzen. Diese Ansätze können jedoch in vielen Fällen nicht angewendet werden, da der Bildgebungsaufbau erforderlich ist, um geeignete Bedingungen für die Wartung und das Wachstum der Proben zu schaffen. Für die Probendrift haben wir ein Plugin entwickelt, um die Open-Source-Bildgebungsplattform von Fidschi zu nutzen.

Unser korrektes 3D-Drift-Plugin ist in der Lage, eine Phasenkorrelationsregistrierung zu bilden, um Bewegungen zu korrigieren, die in dreidimensionalen Zeitrafferexperimenten in Mehrkanalexperimenten als Rollen- oder Probendrift auftreten. Das richtige 3D-Drift-Plugin verwendet einen Kanal, um die erforderliche Korrektur zu bestimmen. Diese Korrektur wird dann auf alle zusätzlichen Kanäle angewendet, die zur Registrierung des Datensatzes "Die vier D" führen.

Das kostenlose Open-Source-Webpaket. Fiji ist ein Distributionsfork, das Image J-Programm, das vorinstallierte Plugins enthält, um zahlreiche Prozesse mit Daten durchzuführen, die bei Mikroskopie-Experimenten gesammelt wurden. Fiji bietet eine einfachere Plugin-Architektur und ist in der Standardinstallation enthalten.

Eine Kopie der korrekten drei EG-Plugins, die wir für diese Analyse verwenden werden, wenn die Installation abgeschlossen ist Open Fiji. Fiji unterstützt den Import einer Vielzahl von proprietären Mikroskopie-Bildformaten. Dies kann durch Drag & Drop oder durch die Benutzer, die offene Mikroskopie-Umgebung, erreicht werden.

Plugin zum Importieren von Bioformaten. Wenn der Datensatz die Größe des auf Ihrem System installierten Arbeitsspeichers überschreitet, öffnen Sie die Image-Datei als virtuellen Stack und mit der Option Speicherverwaltung. Der Datensatz, den wir in dieser Analyse verwenden werden, wurde aus einem dreidimensionalen Zeitreihenexperiment des ACTA einen, GFP-transgenen Zebrafisches, generiert, bei dem das GFP im Skelettmuskel exprimiert wird.

Um die Kerne zu visualisieren, wurde diese transgene Linie mit der nukleolokalisierenden M-Kirsche injiziert, um diese Fluor-Böden besser darzustellen. Wir können die Nachschlagetabellen für jeden dieser Kanäle unter dem Farbkanal-Tool ändern. Im Laufe der gesammelten Zeitreihen scheint es, dass die Probe des Reißverschlussfisches im Sichtfeld driftete. Sie korrigierte diese Drift und öffnete das richtige 3D-Drift-Plugin im Registrierungs-Untermenü der in Fidschi installierten Plugins.

Verkäufermarker, die entweder innerhalb einer Stichprobe weit verbreitet sind oder nicht an den Marketingereignissen während der Bildaufnahme beteiligt sind, bieten die beste Quelle für die Driftkorrektur. In diesem Beispiel, der ACTA-Fluoreszenz, GFP-Fluoreszenz im ersten Kanal. Wenn der Arbeitsspeicher auf Ihrem System begrenzt ist, wählen Sie die Option "Virtueller Stack" und lassen Sie das Plugin "Correct 3D drift" ausführen.

Das korrigierte Dataset hat im Vergleich zum Original eine größere Leinwandgröße. Berücksichtigung der Bewegung der Probe. Die Erzeugung von maximalen Projektionsbildern der optischen Schnitte ermöglicht den Vergleich der Drift, die von der korrigierten Probe entfernt wurde.

Mit der Projektion für maximale Intensität wird die Dimension aus dem Dataset entfernt, dies ist jedoch ein nützlicher Ansatz, um die Ergebnisse der Abweichungskorrektur schnell zu untersuchen. Hier sehen wir die maximalen Projektionsbilder für jeden Verknüpfungspunkt in ihren korrigierten und unkorrigierten Datensätzen. Wenn dieses Zeitrafferexperiment als einzelnes Bild projiziert wird, wird deutlich, wie stark die Drift auch bei einem kurzen Zeitrafferexperiment auftreten kann.

Die Korrekturen, die durch das Registrieren der Drift eines Kanals Ihres Samples vorgenommen werden, werden auch auf alle anderen Kanäle angewendet, die in diesem Bildstapel enthalten sind. Das Verfahren für die Drift-Korrektur, wenn der Speicher auf Ihrem System begrenzt ist, wurde leicht geändert. Wählen Sie die Option Verwendeter virtueller Stack sowohl im Menü "Kaufformat" als auch im Menü "Importieren" und im Popup-Menü des richtigen 3D-Drift-Plug-ins aus.

Wenn Sie Diese Option auswählen, werden Sie aufgefordert, einen Speicherort auszuwählen, an dem ein Plug-in einzelne Bilddateien für jeden Kanalausschnitt und jeden Zeitpunkt Ihres Zeitrafferexperiments exportieren kann. Der generierte virtuelle Stack enthält die gleiche Drift-Korrektur wie unser vorheriges Beispiel. Wenn wir den ausgewählten Speicherort öffnen, sehen wir die resultierenden einzelnen Bildsequenzdateien Generiert.

Um diese Sammlung von Dateien zu öffnen, verwenden Sie das Werkzeug zum Importieren von Bildsequenzen. Die resultierende Datei trennt keine Kanäle, optischen Abschnitte oder Zeitpunkte. Um diese Funktionen zu visualisieren, konvertieren Sie den Stack mithilfe der Daten aus der Protokolldatei in einen Hyper-Stack, geben Sie die Anzahl der Kanäle, die optischen Slices und die Verknüpfungspunkte ein, die in der Wir können die Nachschlagetabellen erneut ändern, um die angezeigte Farbe unseres Zeitrafferexperiments anzupassen.

Dieses Protokoll korrigiert Abweichungen, die zwischen Zeitpunkten auftreten Abweichungen, die innerhalb der Erfassung eines einzelnen Zeitpunkts auftreten, können von diesem Protokoll nicht korrigiert werden. Es wird empfohlen, dass die für die Bildaufnahme verwendeten Parameter die Zeit reduzieren, die für jeden zu erfassenden Zeitpunkt benötigt wird. Die Fähigkeit, die Drift in der Nachbearbeitungssoftware zu korrigieren, ermöglicht es, Zellbewegungen zu analysieren und zu messen, die sonst durch die Drift der zu analysierenden Probe zu verstehen und zu messen wären.