Name: Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Analyse der Zellmigration in mikrofabrizierten Kanälen mit PDMS-Chips und Fibronektin-Beschichtung. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Zellbewegung unter kontrollierten Bedingungen.

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Die Autoren erkennen die stark PICT IBiSA Plattform am Institut Curie (CNRS UMR144). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse finanziert: dem Europäischen Forschungsrat zu AM.LD (Strapacemi 243103), der Verband Nationale pour la Recherche (ANR-09-Piri-0027-PCVI), der InnaBiosanté Fundament (Micemico) zu MP und Uhr. LD und der ERC Nachwuchs Strapacemi Zuschuss AM.LD.

Wichtiger Hinweis: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Form, die die Form für die gewünschte Mikrokanälen wurde bereits gemacht. Weitere Informationen über die Herstellung der Form wurde bereits veröffentlicht 10. Dieses Protokoll setzt voraus, dass Knochenmark-DCs Kultur bekannt ist. 1. Chipfertigungs <ol><li> Mix PDMS Öl und Härter in einem Gewichtsverhältnis 10.01 Uhr in einem Plastikbecher. Das Vermischen der beiden Verbindungen gründlich. </li><li> Werfen Sie die Mischung über den Formlagermikrokanäle. Die Gesamthöhe muss zwischen 0,5-1 cm sein. </li><li> Luftblasen in einem Vakuumgefäß Glocke während 1 Stunde. </li><li> Harden PDMS in der Form durch Anordnen des letzteren in einem Ofen für 2 Stunden bei 65 ° C. </li><li> Sobald das PDMS ist bei Raumtemperatur ein großes Stück geschnitten, auf der Struktur mit einer chirurgischen Klinge und ziehen es aus der Form (Fig. 1A). </li><li> Löcher bohren, wo Zellen injiziert werden (typischerweise 2 mm) und die Größe des PDMSmit einem chirurgischen Messer, um die Größe zu Glasbodenschalen, in denen Migration bewertet werden (Abbildung 1B) passen. Bevor Sie fortfahren, entfernen Reststaub aus der Schüssel mit Linsenreinigungspapier. Dies begünstigt die Bindung von PDMS in Schritt 1.10 beschrieben Glas. </li><li> Reinigen Sie die Größe verändert PDMS-Chip enthält die Kanäle durch Festhalten und Peeling Klebeband auf den Struktur Seiten. </li><li> Beschallen der PDMS-Stücke 30 Sekunden in 70% Ethanol, um Staub und kleine PDMS Partikel zu entfernen. Trocknen Sie sie anschließend schnell durch Einblasen von sauberer Luft. </li><li> Aktivieren Sie die PDMS (Strukturen oben) und Kulturschalen von Luft (oder Sauerstoff) Plasma-Behandlung während 30 Sekunden bei 300 Torr. </li><li> Legen Sie beide aktivierten Oberflächen in Kontakt, um die PDMS dauerhaft halten Sie sich an das Substrat. Falls erforderlich, verwenden Sie Metallzange, um oben auf dem PDMS leicht drücken, um den Kontakt zwischen dem Polymer und dem Glas der Schale (Abbildung 1C) zu zwingen. </li><li> Inkubieren der Chip in dem Ofen bei 65 ° C for 1 Stunde die Bindung zu stärken. </li></ol> 2. Beschichtung von Mikrokanälen <ol><li> Aktivieren Sie die ganze Struktur, die durch Luft-Plasma bei 300 Torr für 1 min. Dadurch wird der Eintritt von Flüssigkeit in die Kanäle in dem nächsten Schritt zu fördern. </li><li> Füllen Sie schnell die Eintrittslöcher des Chips mit Fibronektin bei 10 ug / ml in Wasser. Andere Substrate, wie PEG verwendet werden, um die Zellhaftung an den Kanalwänden zu modifizieren. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit durch die gesamte Struktur ausbreitet. Dies kann leicht mit dem Auge unter normalen Licht oder mit einem normalen Hellfeld-Mikroskop überprüft werden. Hinweis: in sehr kleinen Strukturen, in denen die Diffusion härter Eintritt von Flüssigkeit in den Kanälen kann durch Anordnen der Struktur in einem Vakuumgefäß Glocke während mindestens 15 Minuten gezwungen. Um die Effizienz des Beschichtungs fluoreszierende Substrate verwendet werden (Fig. 2) zu überprüfen. </li><li> Inkubiere 1 h bei Raumtemperatur, um die Adsorption von Fibronektin oder andere Beschichtungs subst ermöglichenGeschwindigkeit an den Wänden der Kanäle. </li><li> Waschen Sie die Strukturen 3x mit PBS, um die nicht gebundenen Substrat zu entfernen. </li><li> Nach dem Waschen des Protokolls Nr. 3 fahren oder lagern Sie den Chip bei 4 ° C für eine spätere Verwendung (24 Stunden maximal). </li></ol> 3. Zell Loading <ol><li> Entfernen Sie die PBS von der Platte und füllen das Mikrosystem mit Zellmedium. Lassen Inkubation für 1 Stunde, um die Kanäle mit dem Medium zu sättigen. HINWEIS: Für Experimente mit Drogen wie molekularen Inhibitoren, ist es ratsam, die Kanäle mit einem Medium, das Medikament in der richtigen Konzentration vorinkubiert. Darüber hinaus neigen einige Medikamente in der PDMS-Struktur, die die effektive Konzentration reduziert lösen. Einige Lösungen vorgeschlagen worden, um dieses Problem zu 11-12 entgegenzuwirken. </li><li> Entfernen und wieder schwimm DCs halb adhärenten Zellen durch Spülen mit Kulturmedium. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. HINWEIS: Für die Zellkern-Bildgebung, eine Hoechst 33342-Färbung kann vorher durch dadurch erreicht werden,cubating 2 x 10 6 Zellen für 30 min mit dem Farbstoff bei 200 ng / ml in vollständigem Medium. Zweimal waschen durch Zentrifugation, um überschüssige Farbstoff bevor das Protokoll zu entfernen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g während 5 min (Zeit und Geschwindigkeit kann unterschiedlich sein, je nach Zelltyp) und entsorgen Sie das Medium. Verdünnt das Pellet eine Konzentration von 20 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Medium von der Platte und leeren die Eintrittslöcher in der PDMS-Struktur mit einer Mikropipette. Füllen Sie die Einträge mit 5 ul Zelllösung, einen Betrag von 1 x 10 5 Zellen in jedem Eingangsloch zu erreichen. HINWEIS: hohe Zelldichte erforderlich, um den Kontakt der Zellen mit den Kanälen zu begünstigen. Niedrige Zelldichte kann in geringen Anzahl von Zellen in Kanälen und Ausfall des Experiments führen. </li><li> Inkubieren des Mikrochips für 30 min bei 37 ° C im Brutschrank. 2 ml Vollmedium dem Experiment Schale. HINWEIS: Die ganze Struktur PDMS muss be um das Trocknen der Zellen während des Experiments zu vermeiden bedeckt. Wenn 2 ml ist nicht genug, fügen Sie mehr Medium, um die PDMS-Struktur vollständig zu bedecken. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Die externe Bodenfläche der Gerichte mit Linsenreinigungstuch reinigen, bevor die Platten unter dem Mikroskop. </li><li> Um die Migration in große Anzahl von Zellen zu analysieren, verwenden Sie 10-facher Vergrößerung und Weitfeldbeleuchtung in einem CO 2 und Temperatur ausgestattet Video-Mikroskop (Abbildung 3). Um die Zellverfolgung zu erleichtern, kann der Hoechst-Färbung und UV-Licht verwendet werden (siehe Schritt 3.2). Migration kann mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, um eine höhere Auflösung zellulärer Strukturen während der Migration erhalten auch analysiert. </li><li> Für Zeitraffer-Mikroskopie bei 10X, wählen Sie eine Zeit-Frequenz entsprechend der erwarteten Zellzahl (typischerweise 2 min für die Migration dendritischer Zellen mit einer Geschwindigkeit von 5 um / min). Hinweis: Die hier beschriebenen Protokoll funktioniert not zählen die Analyse der Zellmigration Parameter. Ein paar Punkte sind in der Diskussion, um die Leser auf, wie Sie vorgehen, um Informationen von Zeitraffer-Filmen extrahieren beraten aufgelistet. </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
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<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
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<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir ein Gerät von Mikrokanälen zusammengesetzt als eine Methode, um die Migrationseigenschaften der großen Anzahl von Zellen in einzelnen Experimenten zu untersuchen. Dieses experimentelle System ahmt die begrenzten Umweltauflagen im Gewebe durch endogene wandernden Zellen gefunden. Jedoch durch die Migration zwingt in einer einzigen Dimension, ermöglicht es die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von Messgrößen (Abbildung 5). Wir zeigen auch, dass unser Gerät ist mit Fluoresz...

Migration ist eine komplexe zelluläre Funktion, die wichtig für viele physiologische Prozesse in mehrzelligen Organismen, einschließlich der Entwicklung, Immunreaktionen und Geweberegeneration. Darüber hinaus können bestimmte pathologische Situationen wie der Tumorinvasion und Metastasenbildung beruhen auf Zellmotilität 1. Aus diesen Gründen hat die Zellwanderung zu einem wichtigen Feld der Studie im Rahmen der Grundlagen-und translationalen Forschung. In vivo werden die meisten Gewebe von einem reichen extrazellulären Matrix und hohe Zelldichte aus. Zellmigration daher unter physiologischen Bedingungen tritt in einer komplexen Umgebung beschränkt. Klassisch, wahrscheinlich aus historischen Gründen und technischen Grenzen, Zellmigration hat in flachen 2D-Systemen, die sich nicht fortpflanzen viele der Umgebungseigenschaften in Geweben, wie der Entbindung gefunden sucht. Außerdem Faktoren wie Zelladhäsion, die für Beweglichkeit in 2D sind, wurden kürzlich zeigte nicht necessa seinRily für die Migration in vivo oder in Gelen erforderlich, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen, die Zellbewegung in 2D und in anderen Umgebungen herrschen verschieden sind 2. Verschiedene Systeme wurden entwickelt, um die komplexen Eigenschaften der Gewebe, die bekanntesten sind Kollagengele, die an rekapituliert die Eigenschaften der extrazellulären Matrix 3 zielen imitieren. Hier schlagen wir Mikrokanäle als einfache ergänzende Methode, die die Untersuchung der Zellmigration in einer Dimension unter einer geschlossenen Umgebung ermöglicht. In diesem System Zellen wandern entlang Mikrokanäle, in die sie spontan ein. Wandernden Zellen erwerben dann die Form der Kanäle, die Annahme eine röhrenförmige Geometrie, die am ehesten verstärkt ihre Polarität. Die lineare Bewegung der Zellen in den Kanälen ermöglicht die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von quantitativen Parameter aus Experimenten. Aus technischer Sicht ist dieses System einfach und flexibel. Die coating der Kanalwände kann manipuliert werden, die Größe und die Form der Kanäle angepasst werden kann, und eine große Anzahl von Zellen kann in Einzelexperimenten untersucht werden. Dieses System kann auch skaliert-up werden bis mittleren Bereich Bildschirm Analyse von Molekülen in Zellbewegung beteiligt durchzuführen. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC) als ein zelluläres Modell standardisiert. Diese Zellen sind der Schlüssel für das Immunsystem, wie sie bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von spezifischen Immunantworten beteiligt 4. In vitro DCs wurde gezeigt, spontan in engen Umgebungen zu wandern und sind daher ein gutes Modell, um die Zellbeweglichkeit in Mikro 5,6 studieren . Wichtiger ist, kann das System erweitert werden, um die Migration von einem anderen beweglichen Zelltyp als T-Lymphozyten, Neutrophile, oder Tumorzellen 7-9 analysieren.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>GE Silicones</td><td>RTV615</td><td>Packung mit 90 % Silikonbasis und 10 % Härter</td></tr><tr><td>Kernprobenschneider</td><td>Ted Pella Int.</td><td>Harris Uni-Core</td><td>Durchmesser 2,5 mm</td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>WPI</td><td>Fluorodish FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>Branson 200</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32 G</td><td>Für kleine Proben (35 Schalen). Eine größere Version ist auch erhältlich</td></tr><tr><td>: Fibronektin aus Rinderplasma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>PolyLysin transplantiert PEG (Pll-g-PEG)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

studium der zellmigration in microfabricated kanäle

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Zellwanderung unter Einschluss in einer Dimension. Es basiert auf der Verwendung von mikrogefertigten Kanälen, die einen polarisierten Phänotyp Zellen durch physikalische Beschränkungen auferlegen basiert. Einmal in Kanäle, Zellen haben nur zwei Möglichkeiten: vorwärts oder rückwärts zu bewegen. Dies vereinfacht die Migration in dem Richtungs beschränkt erleichtert die automatische Verfolgung von Zellen und die Gewinnung von quantitativen Parameter für Zellbewegung beschreiben. Diese Parameter umfassen Zellgeschwindigkeit, Richtungsänderungen, und Pausen während der Bewegung. Mikrokanäle sind auch bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkern kompatibel und eignen sich daher zur Lokalisation von intrazellulären Organellen und Strukturen während der Zellmigration bei hoher Auflösung zu untersuchen. Schließlich kann die Oberfläche der Kanäle mit verschiedenen Substraten funktionalisiert werden, wodurch die Kontrolle der Klebeeigenschaften der Kanäle oder der Untersuchung von Haptotaxis. Zusammenfassend ist das System here beschrieben soll die Migration großer Zellzahlen unter Bedingungen, bei denen sowohl die Geometrie und die biochemische Beschaffenheit der Umgebung gesteuert analysieren, die Erleichterung der Normalisierung und Reproduzierbarkeit der unabhängigen Experimenten.

In jedem Experiment wird die Oberfläche des PDMS mit einem Molekül, das Interesse der Studie geeignet beschichtet. 2 zeigt Kanäle mit einem fluoreszierenden Molekül, PLL-g-PEG beschichtete vor und nach dem Waschen (Schritt 2.4). Ein solches Experiment ermöglicht die Steuerung der Homogenität der Beschichtung in den Kanälen. Nach Beladung der Zellen können Videomikroskopie durchgeführt, um Zellmigration zu folgen. Fig. 3A zeigt ein Beispiel eines DC Migration...

Ein quantitatives Verfahren zur spontanen Migration von Zellen in einem eindimensionalen beschränkt Mikro studieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil der mikrogefertigten Kanälen und kann verwendet werden, um die Migration der Vielzahl von Zellen unter verschiedenen Bedingungen in einzelnen Experimenten zu untersuchen.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mikrofabrizierte Kanäle zur Untersuchung der spontanen eingeschränkten Zellmigration herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Poly-Polymethyl-SUBOXAN- oder PDMS-Chip mit den Kanälen vorbereitet wird. In einem zweiten Schritt werden die Kanäle mit Fibronectin oder einem anderen Beschichtungssubstrat beschichtet, wodurch die Funktionalisierung der Vorrichtung ermöglicht wird.Nach mehreren Waschschritten werden dendritische Zellen in das Mikrosystem geladen, um die Zellmigration zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen Unterschiede in der Geschwindigkeit für verschiedene Zelltypen oder Behandlungen, basierend auf Mikroskopie und Bildanalyse. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie dem klassischen Zwei-Migrations-Test besteht darin, dass wir die Geometrie und Einschränkung der Zellen berücksichtigen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der erforderlichen Präzision bei jedem Arbeitsschritt. Zum Beginn gemischtes PDMS-Öl und Härter im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 in einem Plastikbecher gründlich verrühren, dann die Mischung gleichmäßig auf die Form mit Mikrokanälen auftragen. Die Gesamthöhe muss zwischen 0,5 und einem Zentimeter liegen.Entfernen Sie Luftblasen mithilfe eines Vakuumglockengefäßes für eine Stunde und härten Sie das PDMS im Formkörper, indem Sie es zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius in einen Ofen stellen. Nachdem das PDMS auf Raumtemperatur abgekühlt ist, schneiden Sie mit einem chirurgischen Skalpell ein großes Stück um die Struktur herum aus und lösen es vorsichtig von der Form. Bohren Sie anschließend Löcher an den Stellen, an denen Zellen injiziert werden sollen, und schneiden Sie das PDMS mit dem chirurgischen Skalpell so zurecht, dass es in Glasbodenkulturschalen passt, in denen die Migration untersucht wird. Reinigen Sie es.Der verkleinerte PDMS-Chip mit den Kanälen wird durch Anbringen und Abziehen von Klebeband an den Seitenstrukturen erhalten, um die PDMS-Stücke zu sonifizieren. 30 Sekunden in 70 %igem Ethanol, um Staub und kleine PDMS-Partikel zu entfernen, bevor Sie fortfahren. Entfernen Sie restlichen Staub von der Petrischale mit Objektträger-Reinigungspapier.Aktivieren Sie das PDMS und die Kulturschalen durch eine Luft-Plasmabehandlung für 30 Sekunden bei 300 Millitorr und bringen Sie beide aktivierten Oberflächen in Kontakt, um das PDMS gegebenenfalls dauerhaft auf dem Substrat zu befestigen. Verwenden Sie metallische Pinzette, um leicht auf das PDMS zu drücken und so den Kontakt zwischen dem Polymer und dem Glas der Schale sicherzustellen. Inkubieren Sie den Chip eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius im Ofen.Um die Bindung zu stärken, aktivieren Sie die gesamte Struktur durch Luft-Plasma bei 300 Millitorr für eine Minute. Dies fördert das Eindringen der Flüssigkeit in die Kanäle im nächsten Schritt. Füllen Sie anschließend die Einlassöffnungen des Chips schnell mit Fibronectin bei 10 Mikrogramm pro Milliliter in Wasser. Andere Substrate wie Polyethylenglykol können verwendet werden, um die Zelladhärenz an den Kanalwänden zu modifizieren. Achten Sie darauf, dass sich die Flüssigkeit über die gesamte Struktur ausbreitet. Dies kann leicht visuell unter normalem Licht oder mit einem gewöhnlichen Hellfeldmikroskop überprüft werden.Anschließend die Struktur eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um die Absorption von Fibronectin oder einem anderen Beschichtungssubstrat an die Wände der Kanäle zu ermöglichen. Zum Schluss die Strukturen waschen, um nicht gebundenes Substrat zu entfernen, indem die gesamte Flüssigkeit aus den Kanälen und der Schale abgesaugt wird, gefolgt von einer Behandlung mit frischer, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS für fünf Minuten. Entfernen Sie das PBS von der Platte und füllen Sie das Mikrosystem mit Zellkulturmedium.Die Platte eine Stunde inkubieren lassen, um die Kanäle mit dem Medium zu sättigen, um Zellen zur Bildgebung zu sammeln. Schwimmende dendritische Zellen entfernen und halbadhärente Zellen durch Spülen der Platte mit Kulturmedium gewinnen. Vor dem Zählen der Zellen.Die Zellen mit einem Hämocytometer-Zentrifugieren bei 300 × g für fünf Minuten zentrifugieren und das Medium verwerfen. Den Pellet verdünnen, um eine Konzentration von 20 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen. Den Überschuss an Medium von der Platte entfernen und die Eintrittslöcher in der PDMS-Struktur entleeren.Unter Verwendung einer Mikropipette füllen Sie die Eingänge mit je fünf Mikrolitern Zelllösung, um eine Menge von einer mal 10 hoch fünf Zellen in jedem Eingangsloch zu erreichen. Nach einer Inkubation des Mikrochips für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator fügen Sie zwei Milliliter komplettes Medium zur Experimentierschale für die Bildgebung hinzu.Reinigen Sie zuerst die äußere Unterseite der Schalen mit Linsenreinigungspapier, bevor Sie die Platten unter das Mikroskop stellen. Um die Migration einer großen Anzahl von Zellen zu analysieren, verwenden Sie eine 10×-Vergrößerung und eine Weitfeldbeleuchtung in einem mit CO2 und Temperaturregelung ausgestatteten Videomikroskop, um das Verfolgen der Zellen zu erleichtern. Wie im Textprotokoll für die Zeitraffermikroskopie bei 10×-Vergrößerung erläutert, können Hirschberg-Färbung und UV-Licht verwendet werden.Wählen Sie eine Zeitfrequenz entsprechend der erwarteten Zellgeschwindigkeit. Dies sind typischerweise zwei Minuten für dendritische Zellen, die mit einer Geschwindigkeit von fünf Mikrometern pro Minute wandern. In jedem Experiment wird die Oberfläche des PDMS mit einem Molekül beschichtet, das an das Interesse der Studie angepasst ist.In dieser Abbildung sind die Kanäle mit einem fluoreszierenden Molekül beschichtet. Polylysin-gebundenes Polyethylenglykol vor und nach dem Waschen. Ein solches Experiment ermöglicht die Kontrolle der Homogenität der Beschichtung in den Kanälen; anschließend kann mittels Videomikroskopie die Zellmigration verfolgt werden.Hier ist ein Beispiel für dendritische Zellen, die in Mikrokanälen bei einer Dichte migrieren, die geeignet ist, um die Zellen zu verfolgen. Sowohl die Phasenkontrastmikroskopie als auch die Hersch-Färbung können für diesen Zweck verwendet werden. Die Technik ist außerdem mit der fluoreszenzkonfokalen Mikroskopie bei höherer Auflösung kompatibel und kann verwendet werden, um Organellen oder zelluläre Strukturen zu verfolgen, wie in der Dynamik polymerisierten Aktins in migrierenden dendritischen Zellen, die Life Act GFP exprimieren, gezeigt.Ein Beispiel für die Quantifizierung der Zellmotilität, analysiert an migrierenden dendritischen Zellen, wird hier gezeigt. Die von Wildtyp- oder mit Y 27 632 Dihydrochlorid behandelten dendritischen Zellen erzeugte Kraft zeigt, dass der Wirkstoff ein gut charakterisierter Inhibitor der Zellkontraktilität und -migration ist und verwendet wurde, um die Fähigkeit des Systems zur Detektion von Geschwindigkeitsänderungen zu überprüfen. Die kog kann weiter analysiert werden, um Position und Größe der Zellen als Funktion der Zeit zu ermitteln, wodurch die Untersuchung verschiedener Parameter zur Beschreibung der Zellmigration ermöglicht wird.Die Migrationsgeschwindigkeit wurde durch Abbildung der Kernposition mithilfe einer selbst entwickelten Software verfolgt. Dendritische Zellen weisen eine mittlere Geschwindigkeit von etwa sechs Mikrometern pro Minute auf. Die Behandlung mit dem Wirkstoff verringert ihre Geschwindigkeit signifikant.Dieses Beispiel zeigt die Leistungsfähigkeit der Technik, die es ermöglicht, große Zellzahlen in einzelnen Experimenten zu quantifizieren, sowie die Nützlichkeit des Systems zur Detektion von Unterschieden, die durch Wirkstoffbehandlungen hervorgerufen werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie nach ihrer Entwicklung in drei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Migration den Weg, die Zellbewegung in kontrollierten, begrenzten Umgebungen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

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Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

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