Name: Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Kardiomyozyten aus erwachsenen Mäuseherzen mittels LOR-Perfusion zur Analyse von Kontraktilität und Calcium-Transienten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Einflüsse auf die Herzfunktion.

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Marc Wozniak für die Nutzung der Abteilung für Zell-und Entwicklungsbiologie Videografie Ausrüstung. Vanderbilt University Cell Imaging Shared Resource. Diese Arbeit wird von AHA Zuschuss 12PRE10950005 zu ERP, AHA Zuschuss 11GRNT7690040 DMB, NIH R01 HL037675 DMB unterstützt. DMB ist die Gladys P. Stahlman Lehrstuhl für Herz-Kreislauf-Forschung.

Sicherzustellen, dass alle Verfahren, die Tiere werden durch die entsprechenden Tier Verwendung zugelassen und Pflege Körper. 1. Bereiten Sie Vektor Puffer in Advance <ol><li> Herstellung von 2 L stock Ca 2 + frei Tyrode-(Tabelle 1). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4. </li><li> Herstellung von 2 L stock 1,2 mM Ca 2 + Tyrode-(Tabelle 2). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4. </li></ol> 2. Am Tag des Experiments Bereiten Perfusion, Transfer, und die Verdauung Puffer <ol><li> Bereiten Sie 150 ml Perfusionspuffer in Ca 2 + frei Tyrode-(Tabelle 3) und durch ein 0,2 um Filter. </li><li> Vorbereitung 35 ml Ca 2 + Übertragungs freien &quot;Puffer A&quot; (Tabelle 4) und 25 ml Ca 2 + mit &quot;Puffer B&quot; (Tabelle 5). Filtern jeweils durch ein 0,2 um-Filter. </li><li> Werden die Lösungen von 00,06, 0,24, 0,6 und 1,2 mM Ca 2 + durch Mischen Puffer A und B pro Tabelle 6. </li><li> Vorbereitung 25 ml Aufschlusspuffer durch Auflösen von Verdauungsenzymen in 25 ml Perfusionspuffer (Tabelle 7), bezogen auf das Körpergewicht (BW) der Maus. Filtriert durch ein 0,2 um Filter vor der Verwendung. </li></ol> 3. Versuchsaufbau <ol><li> Zubauen einen konstanten Fluss Langendorff-Apparatur, im Handel erhältlich oder unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe, Schlauch und eine Wärmetauscherrohrschlange, um eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml zu ermöglichen / min Spülflüssigkeit auf 37 ° C erhitzt. Eine einfache schematische in der Überprüfung im Jahr 2011 von den Bell, et al 18. </li><li> Eingestellt zirkulierenden Wasserbad Temperatur (~ 47 ° C) der Langendorff-Apparatur, so daß Ausströmen von der Kanüle ist bei 37 ° C bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min. </li><li> Führen Sie 70% Ethanol durch die Perfusion System für 15 Minuten, gefolgt von 100 ml Reinstwasser vom Typ I Wasser. Führen Perfusionspuffer durch die system für 5 min beim Beseitigen von Luftblasen. </li><li> Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen mit einer gewünschten Methode. </li><li> Kanüle erstellen, indem ein kleines Stück (etwa 3 mm), PE-50-Schlauch an der Spitze einer 23 G Luer-Steckadapter. Wärme Spitze Schlauch an eine Lippe, über die der Aorta positioniert wird erstellen. </li></ol> 4. Cardiomyocyte Isolation <ol><li> Injizieren Maus mit 0,2 ml Heparinlösung (1000 IU / ml), durch intraperitoneale Injektion. </li><li> Nach 5 min zu betäuben Maus mit Isofluran. Wenn es vollständig betäubt (keine Reaktion auf den starken Fuß Prise), sprühen die Brust mit 70% EtOH. Öffnen Sie die Brust, schnell das Herz herauszuschneiden, man aufpassen, nicht die Aorta, und in 4 ° C Perfusionspuffer beschädigen. Verwenden einer gebogenen Pinzette zu greifen und zu heben unter dem Herzen. Das schafft Platz, um Anlagen hinter dem Herzen mit einer feinen Schere trimmen. </li><li> Kanülieren das Herz durch leichtes Greifen der Rand der Aorta mit zwei Paaren von feinen Pinzette und sorgfältig Ziehen des OPENing der Aorta über die Lippe der Kanüle. Sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle nicht über die Aortenklappe und in die Herzkammer, da dadurch die Durchblutung des Herzens über den Koronararterien zu inhibieren. </li><li> Sicherung der Aorta an der Kanüle durch das Binden einer Schleife von 5-0 Seidenfaden um die Aorta unmittelbar oberhalb der Lippe der Kanüle. </li><li> Hinweis: Die Schritte 4.2 bis 4.4 sollten so schnell wie möglich für beste Qualität Verdauung abgeschlossen sein. </li><li> Hinweis: Das Herz kann direkt auf die Kanüle bereits auf das Langendorff-Apparatur mit fließenden Perfusionspuffer befestigt aufgehängt werden. Jedoch hängt das Herz auf eine Kanüle zu einer kleinen Spritze von Perfusionspuffer unter einem Präpariermikroskop angebracht ist gefunden worden, am erfolgreichsten. Dies ermöglicht eine kleine Menge Perfusionspuffer durchgeschoben werden, gerade für die Reinigung der Koronararterien und Herz Gewährleistung fest mit Kanüle befestigt. Die Kanüle wird dann hing an der Langendorff-Perfusion mit Laufpuffer. </li><li> PerfuseDas Herz mit Ca2 + freien Puffer Perfusion bei einem Fluß von 3 ml / min für 2-3 min. </li><li> Wechseln, um die Verdauung Enzym und Puffer für 7-10 min durchströmen, werden Herz weicher und heller in der Farbe. </li><li> Hinweis: Verdauungszeit kann auf der Grundlage der Enzymaktivität und Herzgröße eingestellt werden. </li><li> Sobald Herz ist spürbar schlaff, zu entfernen Herz aus Kanüle und in eine sterile p60 Gericht mit Puffer A (Ca 2 + ablösefrei Puffer). </li><li> Entfernen Vorhöfe und der großen Gefäße. Entfernen rechten Herzkammer, wenn gewünscht. Mit einer Pinzette, trennen die Kammer in kleine Stücke. Pipette mehrmals mit einer sterilen 5 ml Transferpipette weiter zerstreuen Zellen. </li><li> Filtern der Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen durch ein 250 um Nylonmaschenfilter. </li><li> Ermöglichen die Suspension für etwa 10 Minuten zu pelletieren. </li><li> Übertragen Sie die Pellets in der 0,06 mM Ca 2 +-Lösung. Sodass die Zellen für 10 min pelletieren. Gesunde Zellen werden pelletieren, während die meisten toten Zellen zu schweben. </li&gt; <li> Saugen Sie den Überstand, und übertragen Sie die Pellets in der 0,24 mM Ca 2 +-Lösung. </li><li> Wiederholen Sie 10 min Inkubation, Aspiration, und übertragen Sie durch die verbleibenden zwei Ca 2 +-Lösungen, bis die Zellen sind in der 1,2 mM Lösung. An diesem Punkt sollte die Mehrzahl der stabförmigen Zellen Myozyten sind. </li></ol> 5. Mess Kontraktilität und Calcium Transienten <ol><li> Anmerkung: sind Kontraktilität und Calcium Transienten gleichzeitig gemessen werden können. </li><li> Vorbereitung Fura-2 AM-Lösung durch Resuspendieren in wasserfreiem DMSO auf eine Konzentration von 1 ug / ul. Fura-2-AM-Lösung kann in einem Exsikkator bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Last 1 ml suspendierten Zellen mit 1 ul Fura-2 AM. Sodass die Zellen in dunkel 10 min und dann gründlich absaugen Überstand sitzen. Zweimal waschen mit Ca 2 + Tyrode-Lösung, so dass Zellen, die in der Dunkelheit für 10 Minuten zwischen den Waschgängen zu pelletieren. </li><li> Legen Sie ein Deckglas in einem Stadium, Einsatz, beheizten pe ermöglichtrfusion / Aspiration und Elektrode Stimulation mit einem myocyte Feld Stimulator. Ort Tischeinsatz auf inverse Mikroskop für Fluoreszenzmessung eingestellt, indem Sie einen Tropfen Öl auf die Linse, wenn unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv. </li><li> Bis beheizten Schwerkraft Perfusion mit 1,2 mM Ca 2 + Tyrode-Lösung so eingestellt, Lösung auf der Bühne erreicht 37 ° C. Bringen Anspruch, Vakuum. Bringen Elektroden. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop-System, und öffnen Sie die ratiometrischen Fluoreszenz und Zell Dimensionierung Datenerfassungssoftware. </li><li> Fügen Sie ein paar Tropfen des Fura-2 AM beladenen Zellen auf die Bühne Einsatz, Sperrung Durchblutung vorübergehend, damit die gesunden Zellen zu begleichen. </li><li> Verwenden, um die gewünschten Ziel 40X Zelle zu lokalisieren. Eine gesunde Zelle sollte stabförmigen und nicht spontan kontra. Es sollte sichtbar und gleichmäßig zusammenziehen, wenn Zelle bei 5-20 V. Tempo </li><li> Hinweis: Physiologische Analyse erfordert eine hohe Qualität der Verdauung. Es ist möglich, Zellen, die gesund aussehen, aber nicht pa haben<html> gut CE-Kennzeichnung für physiologische Analyse. Verdauung Protokoll kann verlangen, Verfeinerung, um qualitativ hochwertige, gesunde Muskelzellen zu erhalten. Zusätzlich kann Mutante oder kranken Herzen Änderungen des Protokolls erfordern. </li><li> Adjust Linsendrehung und Veränderung Blende so gewünschte Zelle wird horizontal auf dem Bildschirm und Hintergrund ausgekleidet ist nicht sichtbar. </li><li> Richten Kantenerkennung Bars an jedem Ende der Myozyten und passen Schwelle. Richten Sarkomer Erkennung auf einem Teil der Zelle mit einheitlichen Sarkomere. Je länger Sie diese bar zu machen, desto genauer wird das mathematische Modell der Sarkomerlänge sein, solange es nicht auf zwei Populationen von Sarkomere. </li><li> Tempo-Zellen mit 2 Hz und 5-20 V für 10-15 Sekunden vor der Aufnahme. </li><li> Rekordverfolgung. Umgebungslicht sollte die besten Kalzium-Transienten-Aufzeichnung minimiert werden. </li></ol> 6. Analyse <ol><li> Analysieren Sie mit ratiometrischen Fluoreszenzspuren und Zell Dimensionierung Datenerfassungssoftware. </li></ol>Titel &quot;&gt; 7. Weitere Studien <ol><li> Dieses Protokoll stellt überschüssige Zellen, die für eine Vielzahl von anderen Experimenten verwendet werden können, einschließlich: Fixierung und Immunfärbung Beurteilung direkte Arzneimittelwirkungen, Kurzzeitkultur, und Atomkraftmikroskopie. </li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Isolation von Kardiomyozyten Qualität erfordert ein gewisses Maß an Übung und Optimierung. Dieses Protokoll enthält die wichtigsten Schritte, die das Ergebnis der Verdauung wesentlich beeinflussen können. Diese sollten bei der Durchführung und Fehlersuche das Protokoll sorgfältig geprüft werden. Die Zeit von der Entfernung des Herzens Kanülierung und Perfusion sollte minimiert werden, idealerweise weniger als fünf Minuten. Spülen des Herz sofort in eiskaltem Perfusionspuffer nach dem Entfernen von der Maus und Präparier...

Kardiomyozyten liefern die kontraktile Kraft für das Herz. Jeder Myoket enthält organisierte zytoskelettale und kontraktile Elemente, die für die Kontraktion unerlässlich sind. Das Herz enthält nicht nur Kardiomyozyten, sondern auch Fibroblasten, Bindegewebe und modifizierte Myozyten wie Purkinje-Fasern. Veränderungen in einem oder allen dieser Zelltypen können bei Herzinsuffizienz beobachtet werden, was die Bestimmung der endgültigen Ursache der Herzfunktionsstörung erschwert. Der verminderten ventrikulären Kontraktilität eines versagenden Herzens geht ein unterschiedlich starker Aufbau von fibrösem Gewebe sowie eine Hypertrophie und Dysfunktion der Kardiomyozyten voraus1. Arrhythmien können durch Funktionsstörungen der leitenden Zellen2, Fibrose, die die Herzleitung unterbricht3, oder Veränderungen in der Expression von Ionenkanälen in Kardiomyozyten verursacht werden1,4. In der Tat existieren diese Probleme oft auf komplizierte Weise nebeneinander.
Das Isolieren und Untersuchen von Kardiomyozyten ermöglicht es, die kontraktile und elektrische Dysfunktion einzelner Myozyten im Kontext der allgemeinen Herzfunktion zu untersuchen. Techniken zur Isolierung einzelner Herzmyozyten wurden vor über 40 Jahren entwickelt, um die Physiologie dieser "Arbeitstier"-Zelle des Herzens besser zu untersuchen. Die Isolierungstechniken wurden verbessert, um die Ausbeute und Qualität der Zellen zu erhöhen, wobei die lebenswichtige Entwicklung der Koronarperfusion durch Kanülierung der Aorta erstmals 1970 durchgeführt wurde5. In diesem Artikel wird die Isolierung von Kardiomyozyten beschrieben, gefolgt von der Messung der Kontraktilität und der Kalziumtransienten mit Hilfe von ratiometrischer Fluoreszenz- und Zelldimensionierungssoftware. Sowohl in genetischen als auch in Umweltmodellen für Herzerkrankungen liefert die Verwendung dieses Protokolls wichtige Informationen über die Kontraktilität von Zellen, die sarkomerische Kontraktilität und Relaxation, Kalziumtransienten und Störungen des Zytoskeletts. Dieses System wird häufig verwendet, um die Wirkung von Medikamenten auf isolierte Kardiomyozyten zu testen6,7. Wir verwenden das System, um die Kontraktilität und die Kalziumtransienten von Kardiomyozyten zwischen Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit einer Mutation, die zu einer dilatativen Kardiomyopathie führt, zu vergleichen.
Das Studium einzelner Herzmyozyten hat zahlreiche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Methoden zur Untersuchung der Herzanatomie und -physiologie. Die Echokardiographie und die Elektrokardiographie geben Aufschluss über die kontraktile Funktion und die elektrische Leitung des Herzens insgesamt. Keine dieser Methoden erklärt die Ursache oder Art der Funktionsstörung unterhalb des Niveaus des gesamten Organs. Die Messung der Kontraktilität einzelner Kardiomyozyten mit Hilfe von Kantendetektions- und Sarkomerlängenalgorithmen kann zeigen, dass Veränderungen in der kontraktilen Zelle des Herzens bei einer globalen Herzdysfunktion vorhanden sind. Die Messung von Kalziumtransienten zeigt den Einfluss von Änderungen des Ionenflusses auf zellulärer Ebene auf kontraktile Dysfunktionen oder Arrhythmien.
Zusätzlich zur Ergänzung ganzer Organstudien bietet dieses Protokoll Zellen, die leicht auf subzelluläre Komponenten gefärbt werden können. Es ist möglich, Veränderungen des Zytoskeletts durch Färben von Gewebeschnitten des gesamten Herzens zu sehen; Man ist jedoch nur in der Lage, einen Querschnitt von Zellen zu visualisieren. Ein ganzer Kardiomyzyt ist dicker als ein typischer Gewebeschnitt, und angesichts der Anordnung und Länge der Kardiomyozyten ist es schwierig, ganze Zellen in einem einzigen Schnitt zu sehen. Isolierte Kardiomyozyten können sofort fixiert und für eine Vielzahl von Zytoskelettelementen und Ionenkanälen gefärbt werden. Konfokale Bilder können in Z-Stapel der Zelle in voller Dicke kompiliert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Färbung isolierter kardialer Myozyten die Färbung von Komponenten, die in Schnitten nicht sichtbar sind, wie z. B. die Membraneinstülpungen, die als T-Tubuli bekannt sind.
Es existieren kultivierte Zelllinien von Herzmyozyten, von denen einige ähnliche Transkriptionsprofile und phänotypische Merkmale wie Herzmyozyten aufweisen. Einige, wie z. B. die HL-1-Zelllinie, behalten sogar eine gewisse sarkomerische Organisation und rudimentäre kontraktile Fähigkeitbei 8. Trotz dieser Eigenschaften fehlen kultivierten Zellen die "Box-Car"-Form und die T-Tubulus-Struktur von Kardiomyozyten und sie haben eine weniger sarkomerische Organisation. Diese Komponenten sind essentiell für die Funktion von Kardiomyozyten in vivo. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von kultivierten Zellen eine genetische Manipulation, aber keine physiologische In-vivo-Manipulation. Isolierte Kardiomyozyten behalten ihre zelluläre Organisation lange genug bei, um untersucht zu werden, lassen sich aber immer noch leicht abbilden und sogar transduzieren9. 
Isolierte Kardiomyozyten sind extrem vielseitig und bieten ein Substrat zur identischen Analyse von Zellen aus verschiedenen experimentellen Bedingungen. Die Isolierung und physiologische Analyse von Myozyten wurde von unzähligen Laboratorien für eine Vielzahl von Experimenten verwendet, einschließlich der Untersuchung der Wirkung von Medikamenten6,7 oder kleinen Molekülen10, Umweltstressoren11, Infektionen12, Krankheiten13 oder genetischen Mutationen14,15 auf die Kontraktilität und/oder Kalziumtransienten und der Untersuchung der Regulation der Kontraktilität und der Kalziumfreisetzung innerhalb eines Kardiomyozyten15-17. Bei der Anwendung eines dieser Stressoren könnten Veränderungen der Herzfunktion auf eine beliebige Kombination von Veränderungen in den Kardiomyozyten selbst und Veränderungen in der Umgebung des Herzens zurückzuführen sein, wie z. B. Narbenbildung, Veränderungen der Leitfähigkeit oder Veränderungen der extrazellulären Matrix. Dies ist ein ideales Protokoll zur Beantwortung von Forschungsfragen zur individuellen Myozytenstruktur und -funktion im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz jeglicher Ursache.
Obwohl es unzählige Vorteile gegenüber anderen Techniken hat, ist die physiologische Analyse von isolierten Kardiomyozyten nicht für jede Forschungsfrage ideal. Die Isolierung ist ein terminales Verfahren, daher können Kardiomyozyten nur zu einem Zeitpunkt im Leben der Maus beurteilt werden. Dies kann teilweise durch Kohorten und das Opfern einzelner Mäuse im Verlauf der Krankheitsentwicklung oder durch das Beobachten der Maus überwunden werden, um festzustellen, ob sie vor der Isolierung eine klinisch signifikante Herzinsuffizienz hat. Obwohl dieses Protokoll feststellen kann, ob eine Kardiomyozyten-Dysfunktion aufgetreten ist, kann man ohne zusätzliche experimentelle Informationen nicht den Schluss ziehen, dass diese Dysfunktion die Ursache für Herzinsuffizienz ist. Es ist möglich, dass die Funktionsstörung der Kardiomyozyten selbst sekundär zu anderen Veränderungen im Herzen ist. Trotz dieser Herausforderungen bietet die Untersuchung von Kardiomyozyten wertvolle Informationen zur Bestimmung der Art der Funktionsstörung im Herzen, insbesondere in Kombination mit anderen Experimenten. 
Das folgende Protokoll wurde von einem Protokoll übernommen, das von Dr. Chee Lim, Vanderbilt University, zur Verfügung gestellt wurde. Obwohl die Daten zur Kontraktilität und zum Kalziumfluss hochgradig reproduzierbar und nützlich sind, um Herzen mit genetischen oder umweltbedingten Manipulationen zu vergleichen, bleibt die Isolierung selbst ein technikabhängiges Protokoll, das optimiert werden muss. Die Minimierung der Zeit zwischen der Entnahme des Herzens aus der Maus und der Perfusion des Herzens durch Aortenkanülierung ist für eine qualitativ hochwertige Verdauung unerlässlich. Darüber hinaus können die Verdauungszeit und die Enzymkonzentration für Myozyten höchster Qualität optimiert werden. Die Schritte, die wahrscheinlich optimiert werden müssen, sowie Optimierungsvorschläge sind unten aufgeführt.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>EM Science</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandion-monoxim (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase B</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-823</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-882</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV</td><td>Sigma</td><td>P-5147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>Butler Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Teflabs</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO &ndash; wasserfreies</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix Zellstimulations- und Fluoreszenzanalysesystem</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 &mu; m Nylon Siebfilter</td><td>Sefar America</td><td>Lab Pak 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>23 G Luer-Stub Adapter</td><td>Becton Dickinson</td><td>1482619E</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 Schlauch</td><td>Becton Dickinson</td><td>427410</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und physiologische analyse von maus kardiomyozyten

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Kardiomyozyten, das Arbeitspferd des Herzens, enthalten exquisit organisierte zytoskelettale und kontraktile Elemente, die die kontraktile Kraft erzeugen, die zum Pumpen von Blut verwendet wird. Vor über 40 Jahren wurden erstmals einzelne Kardiomyozyten isoliert, um die Physiologie und Struktur des Herzmuskels besser untersuchen zu können. Die Techniken haben sich schnell verbessert und umfassen nun auch die enzymatische Verdauung über die Koronarperfusion. In jüngerer Zeit hat die Analyse der Kontraktilität und des Kalziumflusses isolierter Myozyten ein wichtiges Werkzeug für die zelluläre und subzelluläre Analyse von Herzinsuffizienz geliefert. Echokardiographie und EKGs liefern Informationen über das Herz nur auf Organebene. Es gibt Kardiomyozyten-Zellkultursysteme, aber den Zellen fehlen physiologisch essentielle Strukturen wie organisierte Sarkomere und T-Tubuli, die für die Myozytenfunktion im Herzen erforderlich sind. In dem hier vorgestellten Protokoll werden Kardiomyozyten über die Langendorff-Perfusion isoliert. Der Maus wird das Herz entnommen, über die Aorta an eine Kanüle gebunden, mit Verdauungsenzymen durchblutet und die Zellen werden an die Erhöhung der Kalziumkonzentration herangeführt. Zur Analyse der Kontraktilität wird eine Edge- und Sarkomer-Detektionssoftware verwendet, und ein kalziumbindender Fluoreszenzfarbstoff wird verwendet, um Kalziumtransienten von elektrisch gesteuerten Kardiomyozyten zu visualisieren. Zunehmendes Verständnis der Rolle, die zelluläre Veränderungen bei Herzfunktionsstörungen spielen. Traditionell verwendet, um die Wirkung von Medikamenten auf Kardiomyozyten zu testen, verwenden wir dieses System, um Myozyten von WT-Mäusen und Mäusen mit einer Mutation zu vergleichen, die eine dilatative Kardiomyopathie verursacht. Dieses Protokoll ist einzigartig im Vergleich von lebenden Zellen von Mäusen mit bekannter Herzfunktion und bekannter Genetik. Viele experimentelle Bedingungen werden zuverlässig verglichen, einschließlich genetischer oder umweltbedingter Manipulation, Infektionen, medikamentöser Behandlung und mehr. Abgesehen von physiologischen Daten lassen sich isolierte Kardiomyozyten leicht fixieren und auf Zytoskelettelemente färben. Die Isolierung von Kardiomyozyten durch Perfusion ist eine äußerst vielseitige Methode, die bei der Untersuchung zellulärer Veränderungen, die mit Herzinsuffizienz einhergehen oder zu einer Herzinsuffizienz führen, unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen nützlich ist.

Sobald die Kontraktilität und transiente Kurven werden gesammelt (Abbildung 2), werden die Daten einfach mit der geeigneten Software analysiert. Die gesamte Ablaufverfolgung oder Teile davon können gemittelt werden (Abbildung 3). Kontraktilität kann in einer Vielzahl von Weisen analysiert werden. Systolischen Funktion kann man die Stärke der Kontraktion mit fraktionelle Verkürzung oder Kontraktionsgeschwindigkeit mit der Zeit bis zum Peak Verkürzung und Kontraktionsgeschwindigkeit zu be...

Einzelne Kardiomyozyten aus Wildtyp- und mutierten Mäusen können aus dem Herzen isoliert werden, um ihre Kontraktilität und Kalziumtransienten zu untersuchen. Dies ermöglicht die Charakterisierung des Beitrags zellulärer Dysfunktion zur Herzfunktionsstörung aus beliebiger Ursache.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Die Ziele dieses Protokolls bestehen darin, mit Hilfe der LOR-Perfusion Herzmuskelzellen aus adulten Mäuseherzen mit bekannter Genetik zu isolieren und die Kontraktilität sowie Kalziumtransienten der Muskelzellen zu analysieren. Nach einer Heparin-Injektion wird das Herz aus einer anästhesierten Maus entnommen. Es wird schnell über die Aorta an eine Kanüle montiert, die mit einer Spritze, gefüllt mit Perfusionspuffer, verbunden ist.Die Aorta wird fixiert. Langsam wird ein Faden und Puffer zur Spülung der Koronararterien perfundiert. Anschließend wird die Kanüle an eine LOR-Vorrichtung mit fließendem Perfusionspuffer montiert.Das Herz wird mit einer kalciumfreien Lösung aus Kollagenase und Protease digeriert, bis es fühlbar weich ist. Der linke Ventrikel wird in den kalciumfreien Puffer gegeben und mit einer Pinzette und sanftem Pipettieren dispergiert. Nachdem die Lösung durch ein Netz gefiltert wurde, werden die Zellen schrittweise höheren Kalziumkonzentrationen ausgesetzt, um tote Zellen zu entfernen und sicherzustellen, dass die Kardiomyozyten kalkiumtolerant sind.Gesunde Zellen sind stabförmig, während tote Zellen diese Form nicht aufweisen. Die Kardiomyozyten werden anschließend mit dem radiometrischen Kalziumbindungsfarbstoff RA zwei A beladen und auf dem Mikroskopobjekttisch platziert. Zur Analyse werden die Zellen elektrisch stimuliert, während die Kontraktilität anhand der Sarkomerlänge und Kanten­erkennung gemessen wird, und die Kalzium-Transientes werden durch die Analyse der spektralen Verschiebung der mit RA zwei beladenen Zellen erfasst.Die dilatative Kardiomyopathie wird durch eine Vielzahl von Mutationen verursacht. Das Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus dieser Herzerkrankung kann jedoch schwierig sein. Die Isolierung von Kardiomyozyten ermöglicht es uns, die Kontraktilität und Kalziumtransienten der kontraktilen Zelle des Herzens zu analysieren, Kalziumfrei und 1,2 Millimolar.Calcium-Tyro-Lösungen können am Tag der Isolation im Voraus hergestellt werden. Bereiten Sie gemäß dem schriftlichen Protokoll den kalziumfreien Perfusionspuffer, den Enzymverdauungspuffer sowie die Transferpuffer A und B vor. Filtern Sie alle Lösungen vor der Verwendung durch einen 0,2-Mikron-Filter.Stellen Sie die Transferpuffer eins bis vier mit ansteigenden Kalziumkonzentrationen durch Mischen der Puffer A und B gemäß dem schriftlichen Protokoll her. Stellen Sie die Flussrate einer LOR-Vorrichtung auf drei Milliliter pro Minute ein und regulieren Sie die Temperatur des zirkulierenden Wasserbades so, dass der Ausfluss an der Kanülenspitze etwa 37 Grad beträgt. Leiten Sie 70 %igen Ethanol 15 Minuten lang durch das System, gefolgt von hundert Millilitern Wasser, und stellen Sie sicher, dass alle Blasen aus dem System entfernt werden.Bevor Sie die erste Isolierung durchführen, stellen Sie eine Kanüle her, indem Sie ein kurzes Stück PE 50-Schlauch an die Spitze eines 20 3G-Lure-Stutzens befestigen und die Schlauchspitze erhitzen, um einen kleinen Rand zu bilden. Befestigen Sie die Kanüle an einer kleinen Lu-Lock-Spritze, die mit Perfusionspuffer gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle mit Puffer gefüllt ist.Spritzen Sie eine Maus mit 200 Heparin über eine i.p.-Injektion. Beginnen Sie damit, Perfusionspuffer durch das L-Endorf laufen zu lassen, sodass er vollständig durch das System fließt, bevor das Herz angeschlossen wird. Nach fünf Minuten betäuben Sie die Maus mit Isofluran.Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig gegenüber einem festen beidseitigen Zehenquetschen anästhesiert ist. Öffnen Sie den Brustkorb, indem Sie unterhalb des Brustbeins schneiden und entlang beider Seiten des Rippenbogens nach oben schneiden, und entfernen Sie schnell das Herz, wobei darauf geachtet wird, so viel Aorta wie möglich am Herzen zu belassen. Legen Sie das Herz unverzüglich in Eis. Kaltes Puffermittel zur Überflutung, so schnell wie möglich arbeiten. Unter einem Dissektionsmikroskop jegliches zusätzliche Gewebe entfernen. Vorsichtig überschüssiges Fett entfernen, ohne die darunterliegende Aorta zu beschädigen. Die Aorta direkt unterhalb der ersten Verzweigungen abschneiden.Unter Verwendung eines feinen Pinzettenpaares den Rand der Aorta vorsichtig fassen und sanft über die Spitze der Kanüle ziehen. Sicherstellen, dass die Spitze der Kanüle nicht durch die Aortenklappe in den linken Ventrikel gelangt. Die Aorta mit einer kleinen Schleife aus 5,0-Nahtmaterial sichern.Drücken Sie vorsichtig eine kleine Menge Perfusionspuffer durch die Kanüle und beobachten Sie, wie die Koronararterien vom Blut befreit werden. Entfernen Sie die Kanüle von der Spritze und verbinden Sie sie mit dem Langendorff-Apparat, der sich im Durchfluss mit Perfusionspuffer befindet. Achten Sie darauf, keine Bläschen einzuführen.Lassen Sie den Perfusionspuffer zwei bis drei Minuten lang durch das Herz fließen. Die Perfusion sollte sich von blutig zu klar verändern; wechseln Sie dann zur Verdauungspufferlösung und verdauen Sie sieben bis zehn Minuten lang. Nachdem der Puffer das Langendorff-System gefüllt hat, kann der Fluss wiederverwendet werden, sobald das Herz fühlbar ist.Weich, von der Kanüle nehmen und in eine P 60-Schale mit Puffer a geben. Atrien, große Gefäße und rechten Ventrikel entfernen und in eine zweite Schale mit Puffer a überführen. Mit einer Pinzette.Trennen Sie den linken Ventrikel vorsichtig in kleine Stücke. Wenn das Herz ausreichend verdaut ist, sollte sich das Gewebe leicht lösen; pipettieren Sie mehrmals vorsichtig mit einer sterilen 5-mL-Transferpipette, um die Zellen weiter zu dispergieren. Überführen Sie die Zell- und Gewebesuspension mit einer sterilen Pasteurpipette durch einen 250-Mikron-Nylon-Mesh-Filter in ein 50-mL-Konischglas.Lassen Sie die Zellen etwa 10 Minuten lang pelletieren. Lebende Zellen setzen sich am Boden im Pellet ab, während tote Zellen schwimmen. Überführen Sie das Pellet in den 0,06 Millimolar Kalzium-Transferpuffer.10 Minuten ruhen lassen, den Überstand, der die toten Zellen enthält, abpipettieren und das Pellet in die 0,24 Millimolar Kalziumlösung überführen. Wiederholen Sie das Zentrifugieren, Abpipettieren und Überführen durch steigende Kalziumlösungen, bis die Zellen im 1,2 Millimolar Kalzium-Transferpuffer pellettiert sind. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Pellet viele gesunde stabförmige Zellen, die nicht spontan kontrahieren, um Zellen mit weniger oder zwei Farbstoffen zu beladen.Überführen Sie ein Milliliter der resuspendierten Zellen in ein Ein-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Geben Sie ein Mikroliter einer einmillimolaren Fira-2-Lösung in wasserfreiem DMSO hinzu. Mischen Sie durch vorsichtiges Invertieren des Röhrchens.Lassen Sie die Zellen 15 bis 20 Minuten im Dunkeln pelletieren; nachdem die Zellen abgesetzt haben, entfernen Sie durch Aspiration den Überstand und geben 1,2 Millimolar Calcium-Tyro-Lösung hinzu. Mischen und lassen Sie die Zellen weitere fünf bis 10 Minuten absetzen. Wiederholen Sie dann die Waschung.Richten Sie das umgekehrte Mikroskop für die Datensammlung ein. Legen Sie zunächst einen Glasdeckel auf einen Objektträgerhalter, der für die Perfusionsaspiration und die elektrische Stimulation von Zellen ausgelegt ist. Wenn Sie ein Öl-Objektiv verwenden, geben Sie einen Tropfen Öl auf das 40x-Objektiv und setzen Sie den Objektträgerhalter auf das Mikroskop.Befestigen Sie die Elektroden. Richten Sie eine gravitationsgetriebene, beheizte Perfusionslösung mit 1,2 Millimolar Calcium-Tyro-Lösung ein und schließen Sie die Aspiration an das Vakuum an. Schalten Sie das Mikroskop und das Zellstimulationssystem ein.Öffnen Sie die Ionen-Assistenten-Software. Geben Sie einige Tropfen mit wenigen oder zwei beladenen Zellen auf das Objektfeld, während Sie den Perfusionsfluss blockieren. Um gesunden Zellen das Anheften zu ermöglichen, stellen Sie die Perfusion wieder her; viele der verbleibenden toten Zellen werden dadurch weggespült.Verwenden Sie das Okular, um eine gesunde stabförmige Zelle zu finden, die bei einer Stimulation mit fünf bis 20 Volt spontan kontrahiert; kontrahierende Zellen sollten aufgrund von Membranleckage vermieden werden. Schalten Sie die Bildausgabe auf die Kamera um. Stellen Sie die Drehung des Objektivs so ein, dass die Zelle im Fenster sichtbar ist.Passt die Blende so an, dass der größte Teil des Hintergrunds entfernt wird. Platziert den Marker zur Sarkomerlängenmessung über einen Bereich der Zelle mit gleichmäßigen Sarkomeren. Ändert gegebenenfalls die Größe des Feldes, um sicherzustellen, dass der Marker nicht verschiedene Populationen überdeckt, falls gewünscht.Richten Sie auch die Kanten-Erkennungs-Balken aus. Beginnen Sie mit dem Stimulieren der Zellen 10 bis 15 Sekunden, bevor Sie das Experiment starten. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung.Analysieren Sie Sarkomer-Verkürzungs- und URA-zwei-Verhältnis-Spuren mit der Ion-Wizard-Software. Mögliche Vergleiche zwischen Wildtyp- und Knockout-Kardiomyozyten umfassen die Bruchverkürzung, Zeit bis zur Spitzenverkürzung und Zeit bis zur 50 % Relaxation zur Kontraktilitätsanalyse sowie die Basislinien-Spitzenzeit, Zeit bis zur Spitze und Zeit bis zur 50 % Basislinie des Verhältnisses von URA zwei, um den Kalziumfluss zu bewerten. Die mit diesem Protokoll erzeugten Zellen eignen sich hervorragend für viele weitere Experimente und Verfahren, einschließlich der Färbung für subzelluläre Bestandteile und der Kurzzeitkultur.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Kardiomyozyten aus Wildtyp- und Knockout-Mäusen zu isolieren und die Kontraktilität sowie die Kalziumtransienten dieser Zellen zu analysieren. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Artikels soll das Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen (CSCs) aus dem Herzen der erwachsenen Maus zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Zentrifugation Methode, murine CSCs zu isolieren und ausgearbeiteten Methoden für CSC-Kultur, Proliferation und Differenzierung in Herzmuskelzellen.

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Dieses Protokoll wird verwendet, um einzelne vorhofflische Kardiomyozyten aus dem erwachsenen Mausherz mit einem Chunk-Verdauungsansatz zu isolieren. Dieser Ansatz wird verwendet, um rechte oder linke Vorhoffleine myozyten zu isolieren, die verwendet werden können, um Vorhoffleine Myozytenelektrophysiologie in Patch-Clamp-Studien zu charakterisieren.

Isolierung von Atrial Myozyten von erwachsenen Mäusen

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (&lt;50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Wir entwickelten eine einfacheMethode zur Isolierung hochwertiger einzelner Mausherzzellen durch die antegrade Perfusionstechnik. Diese Methode ist Langendorff-frei und nützlich zur Isolierung von ventrikulären und vorhofialen Myozyten oder interstitiellen Zellen, wie Herzfibroblasten oder Vorläuferzellen.

Eine antegrade Perfusionsmethode zur Kardiomyozytenisolation von Mäusen

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Lernen Sie die Isolierung von Kardiomyozyten aus erwachsenen Mäuseherzen mittels LOR-Perfusion zur Analyse von Kontraktilität und Calcium-Transienten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Einflüsse auf die Herzfunktion.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

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