Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop für hochauflösende intravitale Bildgebung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Mikroskop justiert wird, einschließlich der Einstellung der Laser. Anschließend wird der Strahlmultiplexer ausgerichtet, um eine optimale Strahlform und eine präzise Strahlanordnung zu erzielen.

Im Fall der Multibeam-Abtastung werden die Rohbilder erworben, indem die Probe mit einem gestreiften Beleuchtungsmuster abgetastet wird. Abschließend wird ein Algorithmus angewendet, um das hochauflösende Endbild zu berechnen. Letztlich dient die gestreifte Beleuchtungsmikroskopie dazu, Details des Immunsystemverhaltens innerhalb von Keimzentren in den Lymphknoten von Mäusen sichtbar zu machen, die zuvor der intravitellen Mikroskopie unzugänglich waren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren wie der strukturierten Beleuchtung oder der Lokalisierungsmikroskopie liegt darin, dass sie in großen Gewebetiefen an lebenden Proben angewendet werden kann. Sie erfordert keine Änderung der Laserstrahlform, wodurch die Methode sehr einfach bleibt und leicht an jedes Multiphotonen-Mikroskop angepasst werden kann. Der hier gezeigte Versuchsaufbau für die Mehrstrahl-Zweiphotonen-Streifenbeleuchtungsmikroskopie dient dazu, eine optimale Auflösung und Kontrastqualität bei gleichzeitig geringster Photo-Bleaching-Belastung und schnellster Aufnahme zu erzielen.

Ziehen Sie Änderungen an der Versuchsanordnung in Erwägung, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Nach Durchführung der Anpassungen überprüfen Sie, ob der Strahl zum Spiegel zurückkehrt, der sich direkt oberhalb des Eintrittsspiegels am Ende des auf Prismen basierenden Pulskompressors befindet. Sobald der Lichtweg ab diesem Punkt eingerichtet ist, wird der Strahl in das Strahl-Multiplexgerät reflektiert.

Wenn eine Mehrstrahl-Streifenbeleuchtung durchgeführt wird, führen Sie die Mehrphotonen-Mikroskopie mit abgeschaltetem Scanner durch. Richten Sie die Spiegel im Strahlmultiplexer aus, indem Sie eine homogen fluoreszierende Probe auf dem Objektträger platzieren und den Laserstrahl innerhalb der Probe, jedoch nahe der oberen Oberfläche, fokussieren – in der Nähe der vorderen Linse des Objektivs.

Stellen Sie das Mikroskop auf den Multistrahlmodus ein und wählen Sie die Anzahl der Strahlen sowie die Polarisation. Zum Beispiel P, um den Laserstrahl durch Abbilden des fluoreszierenden Objektträgers zu finden, öffnen Sie den P-Verschluss und betreiben Sie die CCD-Kamera kontinuierlich, während Sie den Strahl fokussieren, wobei sichergestellt werden muss, dass er in der Mittelposition ist. Schalten Sie beim Justieren des P-Strahls in den 64-Strahl-Modus und öffnen Sie den entsprechenden Verschluss.

Überprüfen Sie die Position des Strahls. Justieren Sie die Spiegel des ersten bis fünften Strahlmultiplexers, sodass die Strahllinien gleichmäßig beabstandet sind. Da Algorithmen mit gestreifter Beleuchtung auf dieser Annahme basieren, ersetzen Sie die homogen fluoreszierende Probe durch eine heterogen strukturierte Probe.

Beispielsweise bereichsweise Wurzelprobe erfassen und ein Multibild aufnehmen. Überprüfen, ob das Bild scharf, gleichmäßig und gerade erscheint. Ersetzen Sie die heterogene Probe durch die homogene Probe.

Starten Sie den XY-Scanner, um den Abtastvorgang zu steuern. Um das streifige Bildanregungsmuster für die Multistrahl-Abtastung zu erzeugen. Bewegen Sie den Y-Scanner-Spiegel senkrecht zur beleuchteten Strahllinie.

Wiederholen Sie das erzeugte Muster hier, angegeben durch die Anzahl der Blöcke, indem Sie den als Blockverschiebung bezeichneten X-Scanner-Spiegel bewegen, um ein rechteckiges gestreiftes Bild zu erzeugen. Setzen Sie die heterogene Probe erneut ein und verwenden Sie den Scanner als Hauptschalter. Synchronisieren Sie die Kamera mit dem Scanner, um automatisch ein gestreiftes Bild aufzunehmen und zu speichern, um wiederholt gestreifte Bilder zu erfassen.

Bewegen Sie den X-Scanner-Spiegel an verschiedene Positionen, indem Sie hier ausreichend Wiederholungsschritte, die Anzahl der Verschiebungen und die geeignete Schrittlänge auswählen. Verschiebungsschritt zwischen zwei aufeinanderfolgenden gestreiften Bildern, um die Distanz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Strahlbreiten abzudecken. Stellen Sie die X-Verschiebung auf einen Wert ein, der unterhalb der lateralen Auflösungsgrenze bei der gegebenen Anregungswellenlänge liegt.

Beispielsweise führt die Verwendung von 10 Schritten des X-Scanner-Spiegels pro Verschiebung und 12 oder 13 Verschiebungen zur besten räumlichen Auflösung. Variieren Sie diese beiden Werte mithilfe der Conval-Flächenwurzel-Schiebefunktion, bis das Conval-Flächenbild am schärfsten wird. Verwenden Sie das Linienprofil-Tool für die herkömmlichen CCD-Bilder und die berechneten Streifenbeleuchtungsbilder.

Vergleichen Sie die Breite der Linienprofile, die in diesem Beispiel dem fluoreszierenden Signal von Conval-Zellwänden entspricht. Erfassen Sie jedes rohe Streifenbild synchron zur Scannerbewegung und speichern Sie es separat, beispielsweise in TIFF- oder Binärdateien. Um eine zweidimensionale Matrix des hochauflösenden Streifenbeleuchtungsbilds zu erzeugen, öffnen Sie einen vollständigen Satz roher Streifenbilder als Matrizen in der Auswertungsroutine.

Verwenden Sie entweder den Minimal-Maximal-Algorithmus oder einen auf der Fourier-Transformation basierenden Algorithmus, wie zuvor detailliert beschrieben, um eine streifenförmige Beleuchtung, Multibeam-, Multiphotonen-Mikroskopie in tiefem Gewebe durchzuführen. Erfassen Sie in lebenden Organismen Streifenbilder in verschiedenen Gewebetiefen über die Zeit und werten Sie diese wie zuvor beschrieben aus, um einen hochauflösenden 3D-Film der dynamischen Wechselwirkung zwischen Keimzentrum, B-Zellen und follikulären dendritischen Zellen zu erzeugen. Die Abmessungen der effektiven Punktverbreiterungsfunktion entsprechen der räumlichen Auflösung eines Mikroskops.

Wir maßen diese dreidimensionale Funktion, indem wir entweder das Signal der zweiten Harmonischen Erzeugung von Kollagenfasern oder das Fluoreszenzsignal von 100 Nanometer großen Polystyrolkügelchen, die bei 515 Nanometern emittieren, in mion-Lymphknoten erfassten. Dabei verwendeten wir unsere Mehrstrahl-Streifenbeleuchtung T-P-L-S-M im Vergleich zu etablierten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Verfahren wie der Felderkennung T-P-L-S-M mittels CCD-Kameras und der Punkterkennung T-P-L-S-M. Aus diesen Messungen wird deutlich, dass an der Oberfläche der Probe sowohl die laterale als auch die axiale Auflösung den von der Beugungstheorie vorhergesagten erwarteten Werten entspricht.

Jedoch verschlechtert sich mit zunehmender Bildtiefe und damit mit einem längeren optischen Weg sowohl der Anregungs- als auch der Emissionsstrahlung durch ein Medium mit stark variierenden Brechungsindizes die räumliche Auflösung erheblich, unabhängig vom verwendeten Aufbau. Durch die Verwendung von M-B-S-I-T-P-L-S-M unabhängig von der Bildtiefe erzielten wir eine etwa 20 % bessere laterale Auflösung und eine 220 % bessere axiale Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen T-P-L-S-M-Ansätzen.

Die klonale Selektion von B-Zellen während der Immunantwort in den sekundären lymphatischen Organen erwachsener Mäuse stellt den ersten Schritt auf ihrem Weg zur Differenzierung in Gedächtnis-B-Zellen oder Plasmazellen dar. In diesem Prozess wird angenommen, dass die hochdynamische Interaktion zwischen follikulären dendritischen Zellen und B-Zellen auf der Ebene von Immunkomplexstrukturen innerhalb von Keimzentren eine zentrale Rolle spielt. Erst durch den Einsatz einer hochauflösenden intravitale Mikroskopietechnologie ist es möglich, diese zelluläre Kommunikation und ihre Bedeutung für die Immunantwort zu untersuchen, die hier durch anti-CD21/35-Fab-ATTO590 auf follikulären dendritischen Zellen markiert ist.

M-B-S-I-T-P-L-S-M bietet erstmals die Möglichkeit, die Dimensionen von Immunkomplexablagerungen in Keimzentren von Lymphknoten bis zu einer Tiefe von 120 Mikrometern in vivo zu visualisieren und zu quantifizieren. Diese Bilder zeigen den direkten Vergleich zwischen den 3D-Fluoreszenzbildern von Immunkomplexablagerungen in einem Keimzentrum, wie sie mittels herkömmlicher PMT-basierter Detektion und mittels M-B-S-I-T-P-L-S-M aufgenommen wurden. Darüber hinaus konnten die Wechselwirkungen der Immunkomplexablagerungen mit Keimzentrum-B-Zellen hochauflösend dargestellt werden und können nun in Kombination mit in-vivo-Funktionsproben für Proliferation, Differenzierung oder Apoptose untersucht werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass bei einer kamerabasierten Detektionstechnik die Aufnahmegeschwindigkeit etwa achtmal höher ist, während die maximale Bildtiefe etwa 25 % geringer ist als bei einem herkömmlichen mehrphotonischen Mikroskop mit Standard-Photomultiplier. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr mehrfaches Mikroskop für die Verwendung der streifenförmigen Beleuchtungsmethode einrichten, einschließlich der Einstellung des Lichtwegs am Mikroskop, der Justierung der Strahllatten, der Berechnung der Scanparameter und der Methoden zur Berechnung des endgültigen hochauflösenden Bildes. Für intravitale Tiefengewebsexperimente.