Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop für die hochauflösende intravitale Bildgebung vorzubereiten. Dazu wird zunächst das Mikroskop ausgerichtet, was auch das Justieren der Laser beinhaltet. Anschließend wird der Strahlmultiplexer ausgerichtet, um eine perfekte Strahlform und Strahllichtanordnung zu erreichen.

Beim Multibeam-Scanning werden die Rohbilder aufgenommen, indem die Probe mit dem gestreiften Beleuchtungsmuster gescannt wird. Schließlich wird ein Algorithmus angewendet, um das hochauflösende Endbild zu berechnen. Letztendlich wird die Streifenlichtmikroskopie verwendet, um Details des Verhaltens des Immunsystems in den Keimzentren in den Lymphknoten von Mäusen zu zeigen, die früher für die Intravitalmikroskopie unzugänglich waren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der strukturierten Beleuchtung oder der Lokalisationsmikroskopie besteht darin, dass sie in lebenden Proben in großen Gewebetiefen angewendet werden kann. Es erfordert keine Änderung der Laserstrahlform, so dass die Methode sehr einfach und leicht auf jedes Multiphotonenmikroskop zu implementieren ist. Hier wird der Aufbau der Mehrstrahl-Zwei-Photonen-Streifenbeleuchtungsmikroskopie gezeigt, um eine optimale Auflösung und Kontrastqualität bei geringstem Photo-Bleaching und schnellster Erfassung zu erzielen.

Erwägen Sie, Anpassungen an der Einrichtung vorzunehmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie die Einstellungen vorgenommen haben, überprüfen Sie, ob der Strahl wieder auf dem Spiegel ankommt, der sich direkt über dem Eintrittsspiegel am Ende des prismenbasierten Impulskompressors befindet. Nachdem von hier aus der Strahlengang eingestellt wurde, wird der Strahl in den Strahlmultiplexer reflektiert.

Wenn Sie eine gestreifte Mehrstrahlbeleuchtung durchführen, führen Sie eine Multiphotonenmikroskopie bei ausgeschaltetem Scanner durch. Richten Sie die Spiegel im Strahlmultiplexer aus, indem Sie eine homogen fluoreszierende Probe auf den Tisch legen und den Laserstrahl innerhalb der Probe, aber in der Nähe der oberen Oberfläche, fokussieren. Nahe der Frontlinse des Objektivs.

Stellen Sie das Mikroskop auf den Mehrstrahlmodus ein und wählen Sie die Anzahl der Strahlen und die Polarisation. Um beispielsweise den Laserstrahl durch Abbildung des fluoreszierenden Objektträgers zu finden, stellen Sie den P-Verschluss ein und lassen Sie die CCD-Kamera kontinuierlich laufen, während Sie den Strahl fokussieren, um sicherzustellen, dass er sich in der Mittelposition befindet. Wechseln Sie beim Ausrichten des P-Strahls in den 64-Strahl-Modus und öffnen Sie den entsprechenden Verschluss.

Überprüfen Sie die Position des Balkens. Justieren Sie den ersten bis den fünften Strahl-Multiplexer-Spiegel, um sicherzustellen, dass die Strahlleuchten gleich weit entfernt sind. Da die Algorithmen der gestreiften Beleuchtung auf dieser Annahme basieren, ersetzen Sie die gleichmäßig fluoreszierende Probe durch die heterogen strukturierte Probe.

Zum Beispiel Conval Area Root Sample und Scan eines Mehrstrahlbildes. Vergewissern Sie sich, dass das Bild scharf, gleichmäßig und gerade erscheint. Ersetzen Sie die heterogene Probe durch die homogene Probe.

Starten Sie den XY-Scanner, um den Scanvorgang zu steuern. Zum Generieren des Anregungsmusters für das Streifenbild für das Scannen mit mehreren Strahlen. Bewegen Sie den Y-Scannerspiegel senkrecht zur Strahlbeleuchtungslinie.

Wiederholen Sie das hier erzeugte Muster, das durch die Anzahl der Blöcke angegeben wird, indem Sie den X-Scanner-Spiegel hierher verschieben, der als Blockverschiebung bezeichnet wird, um ein rechteckiges Streifenbild zu erzeugen. Setzen Sie die heterogene Probe zurück und verwenden Sie den Scanner als Master-Trigger. Synchronisieren Sie die Kamera mit dem Scanner, um automatisch ein Streifenbild zu erfassen, und speichern Sie es, um wiederholt Streifenbilder aufzunehmen.

Bewegen Sie den X-Scanner-Spiegel in verschiedene Positionen, indem Sie hier genügend Wiederholungsschritte, hier die Anzahl der Schichten und die passende Schrittlänge auswählen. Verschieben Sie den Schritt zwischen zwei aufeinanderfolgenden Streifenbildern, um den Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Strahlbreiten abzudecken. Stellen Sie die X-Verschiebung auf einen Wert ein, der bei der angegebenen Anregungswellenlänge unterhalb der lateralen Auflösungsgrenze liegt.

Zum Beispiel führt die Verwendung von 10 Schritten des X-Scannerspiegels pro Schicht und 12 oder 13 Schichten zu der besten räumlichen Auflösung. Ergebnisse mit der Wurzelfolie des Konvalsbereichs, um diese beiden Werte zu optimieren, bis das Bild des Konvalbereichs am schärfsten wird. Verwenden Sie das Linienprofil-Werkzeug für die herkömmlichen CCD-Bilder und die berechneten Streifenbeleuchtungsbilder.

Vergleichen Sie die Breite der Linienprofile, die in diesem Beispiel das Fluoreszenzsignal von conval Cell-Wänden ist. Erfassen Sie jedes Streifenrohbild, das mit der Scannerbewegung synchronisiert ist, und speichern Sie es separat, z. B. in TIFF- oder Binärdateien. Um eine zweidimensionale Matrix des hochauflösenden gestreiften Beleuchtungsbildes zu erzeugen, öffnen Sie einen vollständigen Satz von gestreiften Rohbildern als Matrizen in der Auswertungsroutine.

Verwenden Sie entweder den minimalen Maximalalgorithmus oder einen auf Fourier-Transformation basierenden Algorithmus, wie zuvor ausführlich beschrieben, um eine gestreifte Beleuchtung, Mehrstrahl- und Multiphotonenmikroskopie in tiefem Gewebe durchzuführen. In lebenden Organismen werden im Laufe der Zeit gestreifte Bilder in verschiedenen Gewebetiefen aufgenommen und wie zuvor beschrieben ausgewertet, um einen hochauflösenden 3D-Film der dynamischen Interaktion zwischen dem Keimzentrum, B-Zellen und follikulären dendritischen Zellen zu erstellen. Die Abmessungen der effektiven Punktspreizungsfunktion entsprechen der räumlichen Auflösung eines Mikroskops.

Wir haben diese dreidimensionale Funktion gemessen, indem wir entweder das Signal zur Erzeugung der zweiten Harmonischen von Kollagenfasern oder das Fluoreszenzsignal von 100 Nanometer Polystyrolkügelchen erfasst haben, die bei 515 Nanometern in Mion-Lymphknoten emittiert werden. Mit unserer mehrstrahligen Streifenbeleuchtung T-P-L-S-M im Vergleich zu etablierten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Techniken wie der Felddetektion T-P-L-S-M mittels CCD-Kameras und der Punktdetektion T-P-L-S-M. Aus diesen Messungen wird deutlich, dass an der Oberfläche der Probe sowohl die laterale als auch die axiale Auflösung den von der Beugungstheorie vorhergesagten erwarteten Werten entsprechen.

Mit zunehmender Abbildungstiefe und damit mit zunehmendem optischen Weg sowohl von Anregungs- als auch von Emissionsstrahlung durch Medien mit stark variierenden Brechungsindizes verschlechtert sich die räumliche Auflösung jedoch unabhängig vom verwendeten Aufbau erheblich. Durch die Verwendung von M-B-S-I-T-P-L-S-M unabhängig von der Abbildungstiefe erreichten wir eine etwa 20 % bessere laterale Auflösung und eine um 220 % bessere axiale Auflösung. Im Vergleich zu den Standard-T-P-L-S-M-Ansätzen.

Die klonale Selektion von B-Zellen während der Immunantwort in sekundären lymphatischen Organen adulter Mäuse ist der erste Schritt auf ihrem Weg zur Differenzierung in Gedächtnis-B-Zellen oder Plasmazellen. Dabei spielt vermutlich die hochdynamische Interaktion zwischen follikulären dendritischen Zellen und B-Zellen auf der Ebene der Immunkomplexstrukturen innerhalb der Keimzentren eine zentrale Rolle. Nur durch den Einsatz einer hochaufgelösten intravitalen Mikroskopie-Technologie ist es möglich, diese zelluläre Kommunikation und ihre Auswirkungen auf die hier gezeigte Immunantwort zu entschlüsseln, wie sie mit anti CD 2135 FAB ATO five 90 auf follikulären dendritischen Zellen markiert wurde.

M-B-S-I-T-P-L-S-M bietet zum ersten Mal die Möglichkeit, die Dimensionen der Cluster von Immunkomplexablagerungen in bis zu 120 Mikrometer Tiefe in den Keimzentren der popalen Lymphknoten intervital zu visualisieren und zu quantifizieren. Diese Bilder zeigen den direkten Vergleich zwischen den 3D-Fluoreszenzbildern von Immunkomplexablagerungen in einem Keimzentrum, wie sie mit herkömmlichen PMT-basierten und M-B-S-I-T-P-L-S-M aufgenommen wurden. Darüber hinaus konnten die Wechselwirkungen der Ablagerungen des Immunkomplexes mit den B-Zellen des Keimzentrums hochgradig aufgelöst werden und können nun in Kombination mit intravitalen Funktionssonden zur Proliferation, Differenzierung oder Apoptose untersucht werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig zu bedenken, dass bei einer auf Kameradetektion basierenden Technik die Erfassungsgeschwindigkeit etwa achtmal höher ist, während die maximale Abbildungstiefe etwa 25 % niedriger ist als bei einem Standard-Photomultiplier-basierten Multiphotonenmikroskop. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr Mehrfachmikroskop für die Arbeit mit der Streifenbeleuchtungsmethode einrichten, einschließlich der Einstellung des Strahlengangs des Mikroskops, der Ausrichtung der Strahllaten, der Berechnung der Scanparameter und der Methoden zur Berechnung des endgültigen hochauflösenden Bildes. Für intravitale Tiefengewebsexperimente.