Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Ultraschallführung ein Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen zu etablieren, das dann mittels MRT überwacht werden kann. Dies wird erreicht, indem tropische Brustkrebszellen des Gehirns gesammelt und in den linken Ventrikel injiziert werden. Mit Hilfe der Ultraschallkontrolle wird dann die intrakranielle Tumorentwicklung überwacht.

Mittels MRT und Metastasen werden durch h- und e-Färbung bestätigt. Letztendlich kann die bildgesteuerte, genaue Injektion den Erfolg der Überwachung, Bildung und Entwicklung von Brustkrebs-Hirnmetastasen erheblich steigern. Die longitudinale MRT ermöglicht eine nicht-invasive Überwachung der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs.

Essis alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Southwestern Medical Center der University of Texas für dieses Protokoll genehmigt und verfügen über fertige M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P-Zellen, die in DMEM-Medium kultiviert wurden, das 10 % FBS, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin enthält. Streptomycin überwacht immer den Zustand der Zellen und tauscht das Medium alle zwei bis drei Tage aus. Wenn 80%ige Konfluenz erreicht ist, trypsin die Augen und sammeln Sie die Zellen.

Entfernen Sie zunächst das alte Medium vollständig mit einer Vakuumpipette. Fügen Sie dann fünf Milliliter PBS hinzu, um die Zellen sanft zu waschen, bis alle Zellen von PBS bedeckt sind. Entfernen Sie dann die Wäsche.

Geben Sie als nächstes 1,5 Milliliter Trypsin in die Schüssel. Kippen Sie die Schale vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Zellen mit Trypsin bedeckt sind. Stellen Sie die Schale wieder bei 37 Grad Celsius in den Zellinkubator.

Warten Sie eine Minute und beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn sie rund und schwebend sind, haben sie sich gelöst. Fügen Sie drei Milliliter Medium hinzu, um den Aufschluss zu stoppen, und pipettieren Sie die Zellmischung in ein Zentrifugenröhrchen.

Die Mischung bei 1.160 g fünf Minuten lang zentrifugieren. Entfernen Sie dann das Medium vorsichtig mit einer Vakuumpipette. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette in fünf Millilitern serumfreiem Medium, bis kein offensichtliches Zellpellet mehr zu sehen ist und die Lösung homogen zu 50 Mikrolitern der Zellmischung erscheint.

Fügen Sie 50 Mikroliter Trianblau hinzu, sobald es gründlich vermischt ist. Fügen Sie 10 Mikroliter Aliquots zu mehreren Zellzählobjektträgern hinzu. Zählen Sie dann die Zellen aus den Werten des Zellzählers.

Berechnen und verwenden Sie den Durchschnitt aller Zählungen Unzen. Stellen Sie nun eine genauere Zellsuspension her. Zentrifugieren Sie sie erneut und resuspendieren Sie sie bei 175.000 Zellen pro 100 Mikroliter freiem Serummedium.

Anschließend lagern Sie die Zellen für die intrakardiale Injektion auf Eis. Verwenden Sie für dieses Protokoll weibliche BC-Nacktmäuse im Alter von sechs bis acht Wochen. Melden Sie sich beim Bildgebungssystem an und initialisieren Sie den Schallkopf.

7 0 4 bei 40 Megahertz. Starten Sie eine neue Studie und füllen Sie die Eingabeaufforderungen entsprechend aus. Als nächstes betäuben Sie die Maus und geben Sie ein Betäubungsmittel über einen Nasenkonus ab.

Stellen Sie während der geführten Injektion die Temperatur des Bildgebungstisches auf 37 Grad Celsius ein und kleben Sie die Maus in Rückenlage an den Tisch. Halten Sie das Ultraschallgel vor der Bildgebung bei 37 Grad Celsius und tragen Sie es auf die Brust der Maus auf. Montieren Sie nun den Schallkopf in der Halterung und senken Sie ihn auf die gewünschte Abbildungstiefe ab.

Verschieben Sie als Nächstes die Bühne, bis der linke Ventrikel mit der aufsteigenden Aorta identifiziert wird, da der Orientierungspunkt die Bühne sperrt, auf der die Sicht am klarsten ist. Ziehen Sie nun 100 Mikroliter des gekühlten Zellgemisches mit einer 22-Gauge-Nadel in eine Ein-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie die geladene Spritze an der Spritzenhalterung.

Bewegen Sie dann die Spritze in Richtung Brust. Bewegen Sie die Maus vor dem Einsetzen vorsichtig von einer Seite zur anderen, bis sich die Nadelspitze im Bildfeld befindet. Stellen Sie die Höhe und den Winkel der Nadel so ein, dass sie auf den linken Ventrikel abzielt, und wenn Sie sich in Position befinden, dringen Sie sofort durch Haut- und Muskelschichten in den linken Ventrikel ein.

Ein Indiz für eine erfolgreiche Insertion in die linke Herzkammer ist unter Anleitung des Ultraschallbildes der Rückfluss von frischem rosa arteriellem Blut in die Spritze. Injizieren Sie dann die Zellmischung langsam nach Fertigstellung, ziehen Sie die Nadel zurück, heben Sie den Schallkopf an und reinigen Sie das Ultraschallgel mit angefeuchteter Gaze. Lösen Sie dann das Tier vom Klebeband und setzen Sie es mit einem vorgewärmten Pad in einen sauberen Käfig um.

Beobachten Sie die Maus, bis sie sich vollständig erholt hat, und überprüfen Sie sie danach einige Tage lang täglich. Mit einem 78 Quadratmikrometer in einfacher Auflösung können MRT-hyperintense Läsionen mit einem Durchmesser von 310 Mikrometern identifiziert werden. Da die Metastasen in dieser Studie sehr klein waren und die Nekrose und das Ödem minimal waren, repräsentierte die hyperintense Läsion auf den beiden gewichteten Bildern tatsächlich den Tumor.

Massen-Längsschnitt-MRT-Untersuchungen ermöglichen in vivo eine nicht-invasive Beurteilung des Tumorwachstums. Das hochauflösende MRT war in der Lage, drei Wochen nach der intrakardialen Injektion in der vierten Woche mehrere kleine Läsionen zu erkennen, die Läsionen, die im vorherigen Scan zu sehen waren, wurden alle größer. Weitere neue Läsionen erschienen auf den beiden gewichteten Bildern.

Die H- und e-Färbung zeigten diffuse metastasierende Läsionen oder h und e zeigten metastasierende Läsionen vom Cluster-Typ. Um den Tumor herum waren oft vergrößerte Gefäße zu sehen, was darauf hindeutete, dass eine nicht keimende Angiogenese stattfand. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine ultraschallbildgesteuerte Nadelinjektion in den linken Ventrikel eines Mausherzens durchführen.