Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer Ultraschallführung ein Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen zu etablieren, das anschließend mittels MRT überwacht werden kann. Dies wird erreicht, indem zerebrotröpe Brustkrebszellen gesammelt und in das linke Ventrikel injiziert werden. Mit Unterstützung der Ultraschallführung wird dann die intrakranielle Tumorentwicklung überwacht.

Mithilfe von MRT und Metastasen werden durch H-und-E-Färbung bestätigt. Letztendlich kann eine bildgesteuerte, genaue Injektion die Erfolgschancen bei der Überwachung, Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs-Hirnmetastasen erheblich erhöhen. Eine longitudinale MRT ermöglicht eine nichtinvasive Überwachung der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs.

Alle Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee des University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt. Für diesen Protokollansatz haben Sie M-D-A-M-B 231 B-R-G-F-P-Zellen vorbereitet, die in DMEM-Medium mit 10 % FBS, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin kultiviert werden. Überwachen Sie stets den Zellzustand und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Wenn eine Konfluenz von 80 % erreicht ist, lösen Sie die Zellen mit Trypsin ab und sammeln sie ein.

Entfernen Sie zunächst das alte Medium vollständig mittels Vakuumpipette. Geben Sie dann fünf Milliliter PBS zu, um die Zellen vorsichtig zu waschen, bis alle Zellen mit PBS bedeckt sind. Anschließend entfernen Sie die Waschlösung.

Fügen Sie anschließend 1,5 Milliliter Trypsin der Schale hinzu. Kippen Sie die Schale vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Zellen vom Trypsin bedeckt sind. Stellen Sie die Schale wieder in den Zellbrutkasten bei 37 Grad Celsius.

Warten Sie eine Minute und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn sie rund und schwebend sind, haben sie sich gelöst. Geben Sie drei Milliliter Medium hinzu, um die Verdauung zu stoppen, und pipettieren Sie das Zellgemisch in ein Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1.160 ×g fünf Minuten lang. Anschließend entfernen Sie das Medium vorsichtig mittels einer Vakuumpipette. Danach resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in fünf Milliliter serumfreiem Medium unter Verwendung einer Pipette, bis kein offensichtliches Zellpellet mehr sichtbar ist und die Lösung homogen erscheint, auf 50 Mikroliter der Zellmischung.

Fügen Sie 50 µL Trypanblau hinzu, nachdem es gründlich gemischt wurde. Geben Sie 10 µL-Aliquote auf mehrere Objektträger für die Zellzählung. Anschließend zählen Sie die Zellen anhand der Werte des Zellzählgeräts.

Berechnen Sie den Durchschnitt aller Zählungen pro Unze und verwenden Sie diesen Wert. Bereiten Sie nun eine genauere Zellsuspension vor. Zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie die Zellen in 175.000 Zellen pro 100 µL serumfreiem Medium.

Danach die Zellen für die intrakardiale Injektion auf Eis lagern. Verwenden Sie für dieses Protokoll weibliche BC-nude-Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen. Melden Sie sich am Bildgebungssystem an und initialisieren Sie den Wandler.

7 0 4 bei 40 Megahertz. Beginnen Sie eine neue Studie und füllen Sie die entsprechenden Informationsaufforderungen aus. Betäuben Sie anschließend die Maus und verabreichen Sie das Anästhetikum über eine Nasenkappe.

Während der gezielten Injektion die Temperatur des Bildgebungstisches auf 37 Grad Celsius einstellen und die Maus in Rückenlage mit Klebeband am Tisch fixieren. Ultraschallgel vor der Bildgebung auf 37 Grad Celsius halten und etwas davon auf die Brust der Maus auftragen. Danach den Wandler in der Halterung befestigen und auf die gewünschte Bildgebungstiefe absenken.

Bewegen Sie als Nächstes den Objekttisch, bis die linke Herzkammer unter Verwendung der aufsteigenden Aorta als Orientierungspunkt identifiziert ist, und blockieren Sie den Objekttisch an der Position, an der die Sicht am schärfsten ist. Ziehen Sie nun 100 Mikroliter der gekühlten Zellmischung in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel auf. Befestigen Sie die geladene Spritze am Spritzenhalter.

Bewegen Sie die Spritze anschließend in Richtung Brust. Bewegen Sie sie, bevor Sie in die Maus eindringen, vorsichtig von Seite zu Seite, bis sich die Nadelspitze im bildgebenden Sichtfeld befindet. Stellen Sie die Nadelhöhe und den -winkel so ein, dass das linke Ventrikel angesteuert wird, und dringen Sie unverzüglich, sobald die Position erreicht ist, durch die Haut- und Muskelschichten in das linke Ventrikel ein.

Unter Ultraschallbildkontrolle ist ein Hinweis auf eine erfolgreiche Injektion in den linken Ventrikel das Zurückfließen frischen, rosa-arteriellen Blutes in die Spritze. Danach die Zellmischung langsam injizieren, die Nadel ziehen, den Schallkopf anheben und das Ultraschallgel mit angefeuchtetem Mull entfernen. Anschließend das Tier von dem Klebeband befreien und in einen sauberen Käfig mit einer vorgewärmten Unterlage verbringen.

Beobachten Sie die Maus, bis sie sich vollständig erholt hat, und kontrollieren Sie sie danach mehrere Tage lang täglich. Mit einer Auflösung von 78 Quadratmikrometern in normaler Auflösung können mithilfe der MRT hyperintense Läsionen mit einem Durchmesser von 310 Mikrometern identifiziert werden. Da die Metastasen in dieser Studie sehr klein waren und Nekrose sowie Ödem minimal ausgeprägt waren, repräsentierte die hyperintense Läsion in T2-gewichteten Bildern tatsächlich den Tumor.

Mittels massiver longitudinaler MRT-Studien ist eine nichtinvasive in-vivo-Bewertung des Tumorwachstums möglich. Die hochauflösende MRT konnte bereits drei Wochen nach intrakardialer Injektion mehrere kleine Läsionen detektieren; in der vierten Woche waren alle zuvor sichtbaren Läsionen größer geworden. Weitere neue Läsionen zeigten sich in T2-gewichteten Bildern.

Die H- und E-Färbung zeigte diffuse metastatische Läsionen oder H- und E-Färbung zeigte metastatische Läsionen vom Clustertyp. Vergrößerte Gefäße waren häufig um den Tumor herum sichtbar, was darauf hindeutet, dass eine nicht-sprossende Angiogenese stattfindet. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine ultraschallgesteuerte Nadelinjektion in den linken Ventrikel des Mausherzens durchführt.