Name: Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Lernen Sie die ultraschallgeführte Herzkammerinjektion zur Erstellung eines Mausmodells von Brustkrebs-Hirnmetastasen. Diese Methode ermöglicht die nicht-invasive Langzeitbeobachtung mittels hochauflösender MRT.

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Wir sind dankbar, dass DRS. Diane Palmieri und Patricia Steeg von NCI für die Bereitstellung MDA-MB231Br Zellen. Wir danken Dr. Ralph Mason, Mr. Jason Reneau und Frau Ramona Lopes für technische und kollegiale Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch das DOD IDEA Awards W81XWH-08-1 bis 0583 und W81XWH-12-1 bis 0317 unterstützt. MRI-Experimente wurden in der Advanced Imaging Research Center, ein NIH BTRP # P41-RR02584 Anlage durchgeführt und Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion wurde mit Visualsonics Vevo 770 unter 1S10RR02564801 durchgeführt.

Alle Tier Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt. 1. Vorbereitung der Zellen MDA-MB231/Br-GFP <ol><li> Abrufen und Kultur MDA-MB231/Br-GFP die Zellen in DMEM-Medium mit 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin (freundlicherweise von Dr.. Palmieri und Steeg, NCI). </li><li> Beachten Sie den Zustand der Zellen und Farbe des Mediums, und ersetzen Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Trypsinieren und sammeln Sie die Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreicht ist, wie in den Schritten skizziert 1.3.1-1.3.5: <ol><li> Entfernen Sie das alte Medium vollständig und mit 5 ml PBS (1x), um die Zellen vorsichtig waschen. Entfernen Sie die PBS von der Schale. </li><li> 1,5 ml Trypsin in die Schüssel, kippen die Schale vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle die Zellen durch Trypsin bedeckt. Setzen Sie die Schale zurück in die Zelle und halten Sie sie Inkubator bei 37 ° C für 1 min. </li><li> Nehmen Sie die Schale von Inkubator und beobachtendie Zellen unter einem optischen Mikroskop, um die Zellen zu gewährleisten lösen sich von der Schale. </li><li> 3 ml Medium, um die Wirkung des Trypsins zu stoppen. Sammeln der Zellmischung in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Mischung bei 2.000 UpM für 5 min. </li><li> Entfernen Sie das Medium vorsichtig resuspendieren und in 5 ml Serum-freiem Medium, bis sie homogen. </li></ol></li><li> Zählen geeignete Anzahl von Zellen und Resuspendieren sie in Serum-freiem DMEM-Medium mit einer Endkonzentration von 1,75 × 10 5 Zellen in 100 &amp;mgr; l Volumen. <ol><li> Nehmen Sie 50 ul Zellgemisch und 50 ul Trypanblau. Nach dem Mischen nehmen 10 ul Mischung und vorsichtig auf die Zellzählung Rutsche. Verwenden Sie mehrere Proben, um eine genaue Abschätzung der Zellzahl zu gewährleisten. </li><li> Halten Sie in der Zellzählung Rutsche, ein Ende zu einer Zeit und dem Zellzähler startet automatisch gezählt. Nehmen Durchschnitt aller Zählergebnisse und die Berechnung der Gesamtzellzahl. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen wieder und wieder zu suspendieren sie indas entsprechende Volumen der serumfreien Medium in einer Endkonzentration von 1,75 × 10 5 Zellen/100 &amp;mgr; l Volumen führen. </li></ol></li><li> Platz Zellen auf Eis vor der intra Injektion. </li></ol> 2. Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection <ol><li> Verwenden weiblichen Nacktmäusen (BALB / c nu / nu) zwischen 6-8 Wochen alt. </li><li> Log in dem Abbildungssystem. Initialisieren der Wandler 704 (40 MHz). </li><li> Starten Sie eine neue Studie und füllen Sie die Informationen. </li><li> Anästhesiert (3% isoflurane/100% O 2 in einer Induktionskammer) und während des gesamten Verfahrens über einen Nasenkonus, die Tiere mit Isofluran (2%) in 100% O 2 (1 dm 3 / min) zu halten. Anästhesie wird bestätigt, wenn kein Rückzugsreflex ist mit Zehen Prise beobachtet. </li><li> Stellen Sie die Temperatur der Abbildungstabelle auf 37 ° C. Kleben Sie die narkotisierten Maus zum beheizten Bildgebungstisch in Rückenlage. </li><li> Halten Sie die Ultraschall-Gel bei 37 ° C vor dem IMAlterung. Wenden Sie das Gel auf die Brust der Maus. </li><li> Montieren Sie den Schwinger in die Halterung. Senken Sie den Wandler, bis die gewünschte Bildtiefe erreicht ist. Bewegen der Plattform, bis die linke Herzkammer mit der aufsteigenden Aorta als orientierungs (1A) identifiziert. Sperren Sie die Bühne, wenn eine klare Sicht des linken Ventrikels wird visualisiert. </li><li> Zeichnen 100 ul Zellgemisch in eine 1 ml Spritze mit einer 22 G-Nadel. Platzieren und befestigen Sie die Spritze an der Spritze montieren. </li><li> Bewegen Sie die Spritze nach vorn in Richtung der Maus Brust und vorsichtig bewegen sie von Seite zu Seite, bis die Nadelspitze in der Bildfeld (vor dem Betreten der Maus). </li><li> Stellen Sie die Nadel Höhe und Winkel, um zu zielen Sie die linke Herzkammer. </li><li> Dringen Sie die Spritzennadel in inter Raum sofort durch die Haut-und Muskelschichten in den linken Ventrikel unter der Leitung von Ultraschall-Bildgebung. Eine Angabe der erfolgreichen Einführung der Nadel in den linken Ventrikelcle ist der Rückfluss von frischen arteriellen Blut (rosa Farbe im Gegensatz zu den dunkelroten venösen Blut) in die Spritze </li><li> Spritzen Sie die Zellgemisch langsam (Abbildung 1B). </li><li> Nach Abschluss ziehen Sie die Nadel, heben Sie den Wandler, reinigen Sie die Ultraschall-Gel mit angefeuchteten Gaze und Klebeband entfernen. </li><li> Bereiten Sie einen sauberen Käfig mit einem vorgewärmten Pad. </li><li> Legen Sie das Tier auf dem Pad und beobachten Sie das Tier bis zur vollständigen Genesung. </li><li> Überwachung des Verhaltens des Tieres alle 24 h für zwei Tage. </li><li> Allgemeine Bedingungen und neurologischen Anzeichen von Komplikationen bei Versuchsmäusen werden routinemäßig überwacht. </li></ol> 3. MRT-Überwachung von intrakraniellen Tumorentwicklung <ol><li> Verwenden Sie ein 9,4 Tesla Magneten an intrakraniellen Entwicklung von Hirnmetastasen zu überwachen. </li><li> Initiieren MRI zwei Wochen nach der Tumorimplantation und wiederholen Sie einmal pro Woche für bis zu drei Wochen. </li><li> Sedieren die Tiere mit 3% Isofluran und pflegen sie unter Genral Anästhesie (Isofluran 1,5%). </li><li> Überwachung und die Tierkörpertemperatur und Atmung während des Experiments konstant zu halten. </li><li> Hochauflösende Multislice (14 Scheiben mit 1 mm dick, kein Spalt) T 1 - und T 2-gewichtete koronale Bilder, für die Region aus der Frontallappen an der hinteren Schädelgrube, werden mit den folgenden Parametern erworben: T 1-gewichtete Bilder: mehrere Spin-Echo-Scheibe (REM), TR / TE = 400 ms msec/20, Matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in der Ebene Auflösung: 78 x 78 um 2. T 2-gewichtete Bilder: Fast-Spin-Echo mehrere Scheibe (FSEMS) Sequenzen, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 Echozüge, Matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in der Ebene Auflösung: 78 x 78 um 28,9. Tumor-Läsionen erscheinen heller als normale Hirngewebe auf T 2-gewichteten Bildern. </li><li> Die Tumorgröße ist auf T 2-gewichtete Bilder manuell umreißt die Zubeh bestimmtCING Teil der Masse auf jedes Bild mit Hilfe von MATLAB-Programme von uns 8 geschrieben. Gegeben meisten der Tumordurchmesser kleiner sind als die Schichtdicke (1 mm), wird die Größe des Tumors nach ebene Fläche anstatt das Volumen dargestellt. </li></ol> 4. H &amp; E-Färbung Bestätigung der Metastasen <ol><li> Opfere die Mäuse sofort nach der letzten MR-Scan, sezieren die tumortragenden Gehirne und binde sie in OCT-Medium und in -80 ° C eingefroren </li><li> Abschnitt eine Serie von 10 um dicke koronale Hirnproben mit Kryostaten. </li><li> Führen H &amp; E-Färbung auf den Gehirnschnitten. </li></ol>

<ol><li>Schouten, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94, 2698-2705 (2002).</li>
<li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">CNS metastases in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).</li>
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<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+evaluation+of+intracranial+development+and+vascular+characteristics+of+breast+cancer+brain+metastases+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
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<li>Zhang, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+brain+metastases+produced+by+human+neoplasms+implanted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice.</a> Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).</li>
<li>Mason, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oximetry%3A+comparison+of+19F+MR+EPI+and+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass Ultraschall bildgesteuerten linksventrikuläre Injektion gewährleistet die Genauigkeit, so dass jedes Tier in dieser Studie entwickelte Gehirn-Metastasen und kein Tier Tod beobachtet. Die Schönheit des bildgeführten Injektion ist, dass der Weg der Nadelpenetration von Haut und schließlich in den linken Ventrikel überwacht und unter Bild, das sich von dem manuellen Verfahren strengen anatomischen Strukturen erfordern zu folgen ist, eingestellt werden. <p class="jove_c...

Hirnmetastasen ist die häufigste Krebserkrankung bei intrakraniellen Erwachsene. Die Prognose ist sehr schlecht, mit einer medianen Überlebens von 4-6 Monaten auch bei aggressiven Behandlung. Brustkrebs ist eine der drei großen Primärtumoren mit einer hohen Morbidität von Hirnmetastasen 3.1. Mehrere Gehirn-tropischen Brustkrebslinien sind in der Lage sich entwickelnde Gehirn Metastasen nach intra oder intracarotid Injektion 4. Direkte Injektion von Tumorzellen in den linken Ventrikel kann die Lunge Kapillarbett zu umgehen und somit die Häufigkeit der Bildung Hirnmetastasen bei Minimierung viszerale Metastasen. Der MDA-MB231Br Linie ist eine der am weitesten verbreiteten menschlichen Brustkrebslinien Hirnmetastasen in Nagetiermodellen 5,6 zu entwickeln. Wie viele andere Studien 4,7, haben wir eine manuelle Prozedur intrakardialer Injektion in unseren früheren Studien durchgeführt. Es wurde jedoch nur 50% Erfolgsquote bei der manuellen erhaltenEinspritzung und ein Bruchteil der Mäuse starben aus den wiederholten invasiven Verfahren, wenn vor Versuchen fehlgeschlagen. Hier stellen wir die Verwendung eines bildgesteuerten Verfahren, um die Injektion von Hirnsuchbrustkrebszellen in den linken Ventrikel von athymischen Mäusen zu sichern. Längshochauflösende MRT wird angewendet, um intrakranielle Entwicklung von Hirnmetastasen zu folgen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Mediatech</td><td>25-051-C1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Automatischer Zellzähler</td><td>BioRad</td><td>TC10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter International Inc.</td><td>1001936060</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>VisualSonics Vevo 770 Hochauflösendes Bildgebungssystem&nbsp;</td><td>Visual Sonics Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>9,4 T Magnet mit horizontaler Bohrung und einem Varian INOVA Unity System&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ultraschall-imaging-guided intra injection zur entwicklung eines mausmodells von brustkrebs hirnmetastasen durch längs mri gefolgt

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Brustkrebs Hirnmetastasen, bei 30% der Patientinnen mit Brustkrebs im Stadium IV auftreten, wird mit hoher Sterblichkeit. Die mediane Überlebens ist nur 6 Monate. Es ist kritisch, geeignete Tiermodelle haben die hämodynamischen Ausbreitung der metastatischen Zellen im klinischen Szenario zu simulieren. Hier stellen wir die Verwendung von Kleintierultraschallbildgebung, um eine genaue Einspritzung von Gehirn tropischen Brustkrebszellen in den linken Ventrikel von athymischen nackten Mäusen führen. Längs-MRT zur Beurteilung intrakranieller Initiierung und das Wachstum von Hirnmetastasen eingesetzt. Ultraschall-gesteuerte intrakardiale Injektion gewährleistet nicht nur eine genaue Einspritzung und hiermit eine höhere Erfolgsquote, sondern auch deutlich verringert Sterblichkeit im Vergleich zu unseren bisherigen manuellen Verfahren. In vivo hochauflösende MRT erlaubt die Visualisierung von hyperintens multifokale Läsionen, so klein wie 310 um Durchmesser auf T2-gewichteten Bildern 3 Wochen nach der Injektion. Follow-up-MRT zeigt intrakraniellen Tumorwachstum und die erhöhte Anzahl von Metastasen, die während des gesamten Gehirns zu verteilen.

Mit der hohen räumlichen Auflösung der MRT (78 in der Ebene um Auflösung) können hyperintense Läsionen so klein wie 310 um im Durchmesser (Abbildung 2) identifiziert werden. Da die Metastasen in dieser Studie sind sehr klein und die Entwicklung der Nekrose und Ödem ist minimal, die hyperintense Läsion auf T 2-gewichteten Bildern die Tumormasse wirklich vertreten. Längs-MRT-Studien ermöglichen in vivo nicht-invasive Beurteilung des Tumorwachstums. Wie in <...

Ein Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell mit Ultraschall bildgesteuerten Injektion von intra MDA-MB231/Br-GFP Zellen etabliert. Entwicklung von Hirnmetastasen multifokale längs mit hochauflösenden 9,4 T MRT überwacht.

Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer Ultraschallführung ein Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen zu etablieren, das anschließend mittels MRT überwacht werden kann. Dies wird erreicht, indem zerebrotröpe Brustkrebszellen gesammelt und in das linke Ventrikel injiziert werden. Mit Unterstützung der Ultraschallführung wird dann die intrakranielle Tumorentwicklung überwacht.Mithilfe von MRT und Metastasen werden durch H-und-E-Färbung bestätigt. Letztendlich kann eine bildgesteuerte, genaue Injektion die Erfolgschancen bei der Überwachung, Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs-Hirnmetastasen erheblich erhöhen. Eine longitudinale MRT ermöglicht eine nichtinvasive Überwachung der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs.Alle Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee des University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt. Für diesen Protokollansatz haben Sie M-D-A-M-B 231 B-R-G-F-P-Zellen vorbereitet, die in DMEM-Medium mit 10 % FBS, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin kultiviert werden. Überwachen Sie stets den Zellzustand und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Wenn eine Konfluenz von 80 % erreicht is

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Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

In der Pathogenese von Knochenmetastasen ist die Angiogenese ein entscheidender Prozess und stellt somit ein Ziel für die Bildgebung und Therapie. Hier präsentieren wir ein Rattenmodell der ortsspezifischen Brustkrebs und Knochenmetastasen beschreiben Strategien, um nicht-invasiv Bild...

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Echokardiographie geführten perkutanen intramyokardiale Injektion stellt einen effizienten, zuverlässigen und anzielbare Modalität für die Lieferung von Gentransfermittel oder Zellen in die Maus-Herz. Nach der Schritte in diesem Protokoll dargelegt, kann der Bediener schnell kompetente werden in diesem vielseitigen, minimal-invasive Technik.

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Hirnmetastasen hat ein dringender medizinischer Bedarf werden wie ihre Häufigkeit zugenommen hat, während therapeutische Optionen palliative geblieben sind. Erstellen von experimentellen Tiermodellen von Hirnmetastasen über intracarotid arterielle Injektion von Krebszellen erleichtert mechanistische Untersuchungen der Krankheitsbiologie und Evaluierung neuartiger Interventions Regimen.

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Die meisten Hirnmetastasen-Mausmodelle werden durch systemische Metastasen kompliziert, die die Analyse der Mortalität und der therapeutischen Interventionsergebnisse verwirren. Hier wird ein Protokoll für die interne Karotisinjektion von Krebszellen vorgestellt, das konsistente intrakranielle Tumoren mit minimalen systemischen Tumoren erzeugt.

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Mikroblasen-vermittelte fokussiertem Ultraschall Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine vielversprechende Technik zur nicht-invasiven gezielten Verabreichung von Medikamenten im...

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