Name: Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Mausmodells für metastasierendes Mammakarzinom mit intaktem Immunsystem. Diese Methode nutzt Adenovirus-Cre zur präzisen Tumorinduktion und YFP-Tracking zur Visualisierung von Tumorzellen und Metastasen.

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Diese Arbeit wurde von NCI Grants RO1CA157664 und RO1CA124515 und einem Breast Cancer Alliance Award unterstützt. Wir danken Jeffrey Faust, David Ambrose und Scott Weiss von der Wistar Flow Cytometry Core Facility, James Hayden von der Wistar Imaging Facility und dem gesamten Personal der Wistar Institute Animal Facility für ihre unschätzbare technische Unterstützung.

Alle Tierversuche wurden von der Wistar-Institut Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Erstellung und Wartung von transgenen Mäusen <ol><li> Rasse LSL-K-ras tm4Tyj 26 und Trp53 tm1Brn 27 (von NGI-Maus-Modellen der menschlichen Krebs Konsortium auf eine gemischte Hintergrund erhalten wird) zu einem vollen C57BL / 6 Hintergrund 28 durch Rückkreuzung mindestens 10 Generationen mit C57BL / 6 Mäusen. So verfolgen Tumormetastasen, Rasse B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, von The Jackson Laboratory auf Voll C57BL / 6 Hintergrund erhalten) mit Doppel transgenen LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäusen. Hinweis: Transgene LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäuse haben loxP-Stellen flankieren eine transkriptionell Schweigen Allel des onkogenen K-ras und der endogenen p53-Locus, so dass bei Cre-vermittelte Exzision, die Überexpression eines onkogenen K-ras Mutante und Ablation von p53 ist achiEVED. Hinweis: Die LSL-EYFP Maus enthält ein Stopcodon flankieren, ein Gen für eine verstärkte gelb fluoreszierendes Protein (YFP), das nach Cre-vermittelter Exzision Ergebnisse der Expression von YFP in den Geweben, in denen die YFP Stop-Kassette wird herausgeschnitten. <ol><li> Rasse transgenen Mäusen zu LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäusen oder LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP-Mäuse für intraduktale Injektionen erhalten. Hinweis: Die Mäuse werden als homozygot für p53 loxP / loxP und heterozygot für rassigen LSL-K-ras G12D / +, da Mäuse mit einer homozygote Deletion des K-ras sterben in utero. Verwenden naiv jungfräulichen Weibchen mindestens sechs Wochen alt für intraduktale Injektionen. Hinweis: Die Primer für die Genotypisierung floxed p53 Allel homozygot sind p53 - T010-fwd (5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 &#39;) und p53-T011-rev (5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;). Sie produzieren eine Wildtyp-Allel bei 391 bp und das p53-Allel floxed bei 461 bp 29,30. Hinweis: Die Primer, die mutierte Form des K-ras detektieren oIMR8273 (5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 &#39;) und oIMR8274 (5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;). Sie produzieren das mutierte Bande bei 600 bp detektiert. Hinweis: Für die Dreifach-Reporter YFP transgenen Mäusen, um die Primer die ROSA Kassette erkennen (5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 &#39;), die das Wildtyp-Allel (5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39;) und eine gemeinsame Allel (5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 &#39;) führen zur Verstärkung der Banden bei 320 bp für floxed Allel und 600 bp für das Wildtyp-Allel. </li></ol></li></ol> 2. OP-Vorbereitung <ol><li> Saubere chirurgischen Materialien mit 75% EtOH und Autoklaven sie vor und nach den Injektionen. </li><li> Führen Operation auf einem Labortisch ordentlich sauber desinfiziert in einem Zimmer in einer Tieranlage. Wischen Sie alle Oberflächen, einschließlich der Bühne und Zifferblätter des Operationsmikroskops mit einem Breitspektrum-Desinfektionslösung, gefolgt von 75% EtOH. </li><li> Wiegen und Mäuse anästhesiert durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (80-100 mg / kg) und Xylazin (8-10 mg / kg) in steriler Kochsalzlösung. </li><li> Sanft legen Mäuse wieder in ihre Käfige für 5 Minuten ungestört, während sie unter Narkose zu gehen. Während dieser Zeit erzeugen Virus Niederschläge (siehe Protokoll Nr. 3). </li><li> Überprüfen Sie, ob Mangel an Reaktion auf Schmerzen, die durch Quetschung Zehe. Die Augen der narkotisierten Mäusen vorsichtig Abdeckung mit Tier Salbe, um übermäßige Hornhaut Austrocknen zu verhindern. </li><li> Um Unterkühlung zu vermeiden, legen narkotisierten Mäusen auf einem Heizkissen auf kleiner Flamme während des chirurgischen Eingriffs eingestellt und bis sie sich zu erholen beginnen. </li><li> Für die Behandlung von Schmerzen, verwalten Mäusen subkutan Meloxicam bei 1 mg / kg vor der Operation und 24 Stunden nach. </li></ol> 3. Erzeugung von Virus Niederschläge VORSICHT: Adenovirus-Vektoren, wenn sie modifiziert worden sind und sich nicht replizieren, besteht das Risiko,Infektion. Griff Adenovirus mit Vorsicht. Alle Mitarbeiter sollten entsprechend den Richtlinien des Instituts für den Umgang mit BSL2 Agenten Nach intraduktale Injektion, entsorgen Adenovirus nach BSL2 Richtlinien geschult werden. <ol><li> Speicher Adenovirus konzentrierte Virusbestände bei -80 ° C in Aliquots von 4 x 10 8 pfu jedes ausreichend gefroren zum Einspritzen 16 Tiere mit 3 ml 2,5 x 10 7 pfu des Adenovirus-Partikel. </li><li> Bewahren Adenovirus aliquoten auf Trockeneis, bis ca. 15-20 min vor Beginn der Injektionen. Hinweis: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen als Virus-Titer sinkt deutlich zwischen jedem Zyklus. Hinweis: Adenovirus Niederschläge werden durch Modifizieren eines zuvor beschriebenen Protokolls 31 gebildet. </li><li> Rekonstituieren 504 mg Pulver MEM mit 50 ml steriler Molekular Grad Wasser, Nahrungsergänzungsmittel mit 244 mg Natriumbicarbonat und Filter in sterilen Bedingungen und bei 4 ° C <ol> &lt;li&gt; Bereiten Sie die Calciumchlorid-Lösung durch Zugabe von 1,5 g Calciumchlorid in 50 ml molekular reines Wasser und Filter unter sterilen Bedingungen und bei 4 ° C </li><li> Mischen Aliquots mit 4 x 10 8 pfu Adenovirus-Cre mit ausreichender 3% Saccharose in sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml gelöst. In 34 ml MEM, um das Virus und vorsichtig mischen. Dann fügen Sie 4 ml der CaCl 2-Lösung, vorsichtig mischen, und bei Raumtemperatur für 15-20 min. </li><li> Shop Adenovirus auf Trockeneis bis bereit, um Niederschläge zu bilden. Vermeiden Auftauen des Adenovirus und Speichern auf Eis oder bei Raumtemperatur für längere Zeiträume, sofern Niederschläge gebildet werden. Anmerkung: Es ist auch möglich, die Saccharose, MEM und CaCl 2 vor den Operationen mischen, wenn es nicht möglich ist, den Adenovirus-Aliquot aufgetaut und beginnen, fällt unmittelbar nach dem Entfernen von -80 ° C. Dieses Aliquot von Saccharose, MEM, und Kalzium kann auf Trockeneis, bis bereit, den Adenovirus hinzufügen gespeichert werden. Hinweis: Viruspartikel werden etwa 1 h stabil. </li><li> Vor jeder Injektion, sanft Flick das Rohr, um sicherzustellen, Viruspartikel werden gemischt. Zeichnen bis 3 ml (2,5 x 10 7 pfu) von Viruspartikeln in den 10-ml-Spritze und bereiten Sie die Maus für die intraduktale Injektion. </li></ol></li></ol> 4. Intraduktale Injektion von Viruspartikeln <ol><li> Sanft statt mit der Maus auf dem Rücken auf den beleuchteten Bühne von einem sauberen Dissektionsmikroskop. Beleuchten Sie die Bauchseite mit einer zusätzlichen Lichtquelle und suchen Sie die links oder rechts, 4. 9. Leistenbrustdrüse durch die kleinen weißen Flecken von Pelz (sichtbar auf C57BL / 6 Frauen) jeden Nippel umgibt. </li><li> Reiben Sie die Brustwarze vorsichtig mit einer sterilen Ethanol getränkten Wattestäbchen, um Haare aus der Brustwarze zu löschen und die Injektionsstelle zu sterilisieren. Wenn sie schwer zu finden sind, vorsichtig eine dicke Schicht einer Enthaarungscreme oder Verwendung Schere, um die Brustwarzen freizulegen. </li&gt; <li> Entfernen Sie das Keratin Stecker, eine Schicht aus dichtem abgestorbene Hautzellen, die Abdeckung wird die Brustwarze. Sobald die Nippel ausgesetzt ist, sollte das Keratin Stecker gut sichtbar unter der Dissektionsmikroskop sein. </li><li> Sichern Sie die Brustwarze mit feinen chirurgischen Pinzette und ziehen Sie mit wenig Kraft um das Keratin Stecker entfernen. </li><li> Stabilisieren Sie die Brustwarze zwischen der Zange. </li><li> Setzen Sie vorsichtig die Nadel zwischen den Zangen, Kanülieren den Kanal Kanal bei 90 °. Geben Sie die Sauger etwas hinter der Abschrägung der Nadel (nicht mehr als 2 mm), um das Eindringen durch das Brustgewebe und in die serösen Membranen der ventralen Körperhöhle zu verhindern. <ol><li> Sie die Nadel zu tief einführen. Um die richtige Tiefe der Injektion zu gewährleisten, ziehen Sie die Nadel bis nach dem Einlegen in das Lumen des Kanals, zeichnen die Brustwarze bis an den Rändern der Nadel, wie es oben gezogen. Hinweis: Visualisierung der Injektion schwierig, deshalb practicE für diesen Schritt wird unter Verwendung von Trypanblau empfohlen. </li></ol></li><li> Wenn die Nadel in geeigneter Weise in der Brustkanal platziert, lassen Sie die 3 ml Virus Niederschläge (2,5 x 10 7 pfu des Adenovirus-Cre), indem Sie vorsichtig stürzen die Spritze mit dem Daumen der Hand hält die Spritze. Die Brustwarze sollte etwas aufblasen, wenn die Flüssigkeit aufgenommen ist. </li></ol> 5. Wiederherstellung von Mäusen <ol><li> Platzieren Sie die Maus wieder auf das Heizkissen nach der Injektion, bis sie beginnt, sich von der Narkose zu erholen. </li><li> Sobald die Maus gewonnen, setzen Sie ihn wieder in einen sauberen Käfig und Monitor für vollständige Erholung und Bewegung. </li><li> 24 Stunden nach der Injektion intraductal, subkutan verabreichen Meloxicam bei 1 mg / kg. </li></ol> 6. Überwachung Tumorprogression <ol><li> Tasten Sie die Brustdrüse injiziert am Tag 30 für die Erweiterung und Schwellungen. <ol><li> Überwachung der Tumorprogression alle 5-7 Tage einmal geschwollen und vergrößerte Brust Gland beobachtet. </li></ol></li><li> Messen Tumorvolumina alle 3-4 Tage für das Tumorwachstum Kinetik einmal tastbaren Tumoren erscheinen (ca. 50-60 Tage nach der Adenovirus-Injektion). </li><li> Euthanize Mäusen als Tumorvolumen 10% des Körpergewichts der Mäuse überschreiten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von der richtigen Technik während der intraduktalen Injektionen ab, was für ungeübte Experimentatoren schwierig sein wird. Erfahrene Forscher in unserem Labor erhalten in der Regel in 79 % der Fälle, in denen sie adenovirale Injektionen verabreichen, Brusttumormassen. Probleme mit der Injektion können zu einer deutlich verzögerten, variablen oder fehlenden Tumorentwicklung führen. Wenn die Nadel zu tief oder in einem unangemessenen Winkel eingeführt wird, kann der Duktalkanal übersehen werden. Es ist wichtig, den Sauger etwas über die Abschrägung der Nadel hinaus (nicht mehr als 2 mm) einzuführen, um ein Eindringen durch das Brustgewebe in die serösen Membranen der Bauchhöhle zu verhindern. Auch eine zu flache Platzierung der Nadel oder die Injektion von mehr als 3 ml Viruspräzipitaten kann zum Verschütten von Viruspräparat außerhalb der Brustdrüse und zur Induktion unbeabsichtigter Tumoren führen. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu lösen, besteht darin, die Nadel etwas tiefer als 3 mm in den Sauger einzuführen und die Spritze langsam wieder aus dem Kanal herauszuziehen, bis sie 2 mm von der Spitze der Fase entfernt ist. Dadurch wird sichergestellt, dass das Brustgewebe und nicht der Muskel, der die Bauchhöhle der Mäuse umgibt, ins Visier genommen wird (Abbildung 1A). Dadurch wird auch der Sauger entlang der Ränder der Spritze gedehnt, so dass beim Ausstoßen des Virus in den Kanal kein Verschütten und kein Verlust von Virusausfällungen auftritt.
Die Visualisierung der Injektion ist schwierig und es wird empfohlen, diesen Schritt zu üben. Wir haben eine Zunahme erfolgreicher Injektionen nach der Praxis beobachtet, was zu einer höheren Penetranz der Tumorentwicklung führt. Da bei dieser Technik nicht-laktierende jungfräuliche Frauen verwendet werden, ist es wichtig, den Keratinpfropfen zu entfernen, der die Brustwarze bedeckt, um den darunter liegenden Kanalkanal freizulegen. Wir empfehlen, diesen Schritt durchzuführen, indem Sie Trypanblau oder einen anderen sterilen, rückverfolgbaren Farbstoff in den Kanal injizieren und ganze Brusthalterungen vorbereiten, um die Ausrichtung auf den Ductalbaum zu bestätigen. Darüber hinaus wurden weitere Protokolle veröffentlicht, die die intraduktale Injektion von Reagenzien beschreiben33,34, die für die Entwicklung der richtigen Technik nützlich sein können. Probleme mit der Virusvorbereitung oder eine Infektion des duktalen Lumens können ebenfalls mit einem mCherry-exprimierenden Adenovirus untersucht werden. Nicht-transgene Mäuse können für jeden dieser Zwecke verwendet werden, bis die Injektionstechnik optimiert ist.
Obwohl jede Brustdrüse zur Initiierung von Tumoren verwendet werden kann, haben wir die konsistentesten Wachstumsraten erreicht, indem wir auf die Brustdrüse 4 oder 9 abzielten, was unserer Meinung nach daran liegt, dass es einfacher ist, die richtigen Injektionen an diesen Drüsen durchzuführen, was zu einer effizienteren Ausrichtung des Gangs führt. Die Nähe der linken 4. oder rechten 9. Leistendrüsen zur drainierenden leistenden Lymphdrüsen ist auch nützlich, um Anti-Tumor-Immunantworten während verschiedener zeitlicher Zeitpunkte der Tumorprogression zu untersuchen. Um latente Metastasen an distalen Stellen zu modellieren und zu verfolgen, wurden transgene Mäuse mit LSL-EYFP-Mäusen gekreuzt. Im weiteren Verlauf des Tumors wird das Gefäßsystem, das den Tumor mit dem axillären Lymphknoten verbindet, nach etwa 5 Wochen leicht anschwellen, bevor der Tumor exponentiell zu wachsen beginnt (Abbildung 3A). Nach 7-8 Wochen führt die lymphovaskuläre Invasion schließlich zu einem Tumorwachstum im axillären Lymphknoten (Abbildungen 3A und 3B). Unter Verwendung von Reportermäusen und der Cre-loxP-Technologie wird durch den Einbau von YFP eine Plattform geschaffen, um die Metastasierung von Tumorzellen an distalen Stellen während der Tumorprogression zu verfolgen. Dies kann Studien erleichtern, die darauf abzielen, die zellulären und epigenetischen Mechanismen aufzuklären, die die latente Metastasierung begünstigen. In unseren Händen exprimierten Brusttumorzelllinien Cytokeratin-8, Mesothelin, Östrogenrezeptor-α und Her2/neu, was das Targeting des duktalen Epithels bestätigt. Abhängig von den induzierten Mutationen und aufgrund der Schwierigkeit und Variabilität der Injektionen empfehlen wir jedoch eine histologische Charakterisierung von Tumoren, sobald das Modell im Labor gut etabliert ist.
Da Brustkrebs eine so tödliche und weit verbreitete Krankheit ist1,2, ist es wichtig, Tiermodelle zu verwenden, die das komplexe Zusammenspiel zwischen Tumor und Wirt genau rekapitulieren. Hier beschreiben wir ein vollständig rückgekreuztes C57BL/6-Mausmodell eines Brusttumors. Erstens ermöglichen wir dem Tumor durch die Induktion von Tumoren aus nativen Zellen, sich auf natürliche Weise in einer vollständigen Immunmikroumgebung zu entwickeln. Die Immunmikroumgebung in den fortgeschrittenen Maus-Brusttumoren rekapituliert die Populationen von αβ- und γδ-T-Zellen, myeloischen Suppressorzellen und Makrophagen, die häufig bei menschlichem Brustkrebs beobachtet werden (Abbildung 4). Da wir bereits zuvor veröffentlicht haben, dass Adenovirus-Cre zur Induktion von Ovarialtumoren verwendet wird, haben wir festgestellt, dass die virale Injektion einen vernachlässigbaren Einfluss auf die entsprechenden Tumorinfiltrate und die Tumorprogression hat28. Zweitens stellt die endokrine unabhängige Expression von Onkogenen sicher, dass Tumorzellen eine anhaltend hohe Expression von Zielgenen aufweisen. Drittens können wir durch die Ausnutzung latenter Mutationen den Zeitpunkt der Tumorgenese kontrollieren, um eine präzise zeitliche Verfolgung der Tumorevolution zu ermöglichen. Zu den Anwendungen dieses Modells gehören die Erforschung der Tumorzellbiologie, Studien zu Faktoren in der Tumormikroumgebung, Anti-Tumor-Immunantworten und sogar die Bewertung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Durch die Verfügbarkeit des Cre-loxP-Systems kann diese Technik als Plattform für die Untersuchung einer Vielzahl zusätzlicher Mutationen bei der Entstehung und Progression von Brusttumoren verwendet werden. Wir hoffen, dass die Verwendung dieses Modells das Verständnis der Brustkrebsbiologie verbessern und schließlich zu neuen Therapeutika zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs führen wird.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.
Protocol section 3.1 was updated from:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
to:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 &#181;l of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
Protocol section 3.3.2 was updated from:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
to:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 &#181;l. Add 34 &#181;l of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 &#181;l of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
Protocol section 3.4 was updated from:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
to:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 &#181;l (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 &#181;l syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
Protocol section 4.7 was updated from:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
to:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 &#181;l of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:
10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
to:
10&#181;l syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Brustkrebs ist die am häufigsten auftretende Krebserkrankung bei Frauen in der ganzen Welt 1,2 und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle 2. Komplexe genetische 3,4, 5 histologische und klinische Phänotypen 6 werden verwendet, um die verschiedenen Subtypen von Brustkrebs zu charakterisieren und werden oft als ein Mittel, um das Überleben vorherzusagen. Die Analyse einer großen Kohorte von Frauen mit Brustkrebs zeigte, dass die meisten (ca. 80%) der Patienten, die starben innerhalb von 10 yr Beitrag Entfernung des Primärtumors 7 wiedergekehrt war. Für die Mehrheit der invasiven Mammakarzinome hat lymphovascular Invasion gezeigt worden, um stark zu einem schlechten Ergebnis und aggressiveren klinischen Verlauf der Erkrankung korreliert werden 8. Aufgrund der genetischen und phänotypischen Komplexität von Brustkrebs, gibt es keine Tiermodell, das den gesamten Verlauf der Krankheit rekapituliert. Menschliche Muttertumorzelllinien wurden mehrals Xenotransplantat oder orthotopen 9 Modelle von invasiven und metastatischen Brustkrebs bei immungeschwächten Mäusen verwendet. Obwohl informative treten diese Modelle in Abwesenheit von Immun Druck und weil es eine Quer Arten Transplantat, verzerren die Wirkung des gesamten Tumor-Mikroumgebung. Induzierbare genetische Mutationen durch Brust spezifische Promotoren, wie Maus-Mammatumorvirus (MMTV) und Molke saures Protein (WAP) angetrieben haben eine enorme Menge an Wissen über die genetische Beschaffenheit von Brustkrebs beigetragen. Jedoch ist die gewebespezifische Expression dieser Promotoren durch ihre Reaktionsfähigkeit mit dem endokrinen System 10-16 beeinträchtigt, was zu einer variablen Expression der induzierten genetischen Mutationen, spiegeln nicht die Expression von Onkogenen in der Regel in menschlichem Brustkrebs überexprimiert. Um endokrine Kontrolle des MMTV gesteuerte Expression von Onkogenen zu überwinden, Moody et al. Erzeugt eine bedingte, Doxycyclin induzierbaren Überexpression Modell Neu in der BrustEpithel 17. Dieses Modell ist nützlich für deinducing Neu nach Tumorbildung zu Regression und Wiederholung zu studieren, aber erfordert ständige Doxycyclin Verwaltung für konsistente, langfristige Onkogenexpression. Eine umfassende Diskussion der vielen relevanten Brusttumor-Modelle in der Übersicht von Vargo-Gogola et al. 10 gefunden werden Unser Ziel war es, ein Mausmodell für Brustkrebs rückführbar auf Voll C57BL / 6 Hintergrund zu entwickeln, dass nach der ständigen Induktion der Mutationsereignisse, Modelle die Bildung einer entstehenden Tumor in der Anwesenheit von Immundruck. Wir führten ein Adenovirus Cre-Rekombinase in die Milchgänge von transgenen Mäusen enthält floxed Allele Tp53 und eine onkogene Form von K-ras und YFP. Cre-Expression Tp53 abträgt, eine häufig mutierte Gen in vielen Brustkrebs 18 und induziert eine onkogene Allel des K-ras neben YFP Ausdruck spezifischin der Brust duktalen Epithel. Obwohl Mutationen in K-ras sind selten bei Brustkrebs, in nur 6,5% der Brustkrebspatientinnen 19,20 auftritt, die Überexpression von stromaufwärtigen Kinasen wie Her2/neu und EGFR bewirken die konstitutive Aktivierung des Ras-Signalwegs in menschlichen Brusttumoren 21-23. Aktivierung des Ras-Signalwegs in vielen Brusttumorzelllinien wurde auch berichtet, 24,25. Wir werden den Beginn der Tumorbildung und die Technik der intraduktale Injektion eines Adenovirus Cre-Rekombinase in sexuell reifen, Jungfrau weiblichen Mäusen zu beschreiben. Dieses Modell von Brustkrebs entwickelt offene Läsionen, die exponentiell nach etwa 8 Wochen der langsamen Tumorprogression zu wachsen, mit lymphovascular Invasion und Metastasierung in die axillären Lymphknoten von 7-8 Wochen. Da diese Mäuse sind auf Voll C57BL / 6 Hintergrund und YFP-exprimierenden Tumorzellen sind rückführbar in distalen Lymphknoten, bietet dieses Modell eine entsprechende Werkzeug, um die ce studierenllular und immunologischen Mechanismen der Metastasierung latent und wird dazu beitragen, neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von metastasierendem duktalen Brustkrebs zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Trp53tm1Brn Transgene Mäuse K-rastm4Tyj Transgene Mäuse</td><td>aus NCI-Mausmodellen des menschlichen Krebskonsortiums</td><td></td><td>wurden zehnmal auf einen vollständigen C57BL/6-Hintergrund</td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JTransgene Mäuse</td><td>Jackson Labs</td><td>006148</td><td></td></tr><tr><td>Primer p53loxP/loxP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'Primer</td></tr> <tr><td>LSL-K-rasG12D/+</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'Primer</td></tr> <tr><td>für LSL-EYFP zum Nachweis des integrierten Rosa-Promotors</td><td> DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'Primer</td></tr> <tr><td>zum Nachweis der Mesothelin-Expression</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'Primer</td></tr> <tr><td>zum Nachweis der Progesteronrezeptor-Expression</td><td>Integriert DNA Technologies</td><td></td><td>5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'Primer</td></tr> <tr><td>für den Nachweis der Cytokeratin 8-Expression</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'Primer</td></tr> <tr><td>für den Nachweis der Erbb2-Expression</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>5'-ACCTGCCCCTACAACTT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'Primer</td></tr> <tr><td>zum Nachweis der Östrogenrezeptor-A-Expression</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'Primer</td></tr> <tr><td>zum Nachweis der Östrogenrezeptor-B-Expression</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'Primer</td></tr> <tr><td>für den Nachweis der B-Aktin-Expression</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>5'-GCCTTCCTTCTTGGGTAGGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'Adenovirus-Cre</td></tr> <tr><td></td><td>Gentransfervektor Core von der Universität von Iowa</td><td>Ad5CMVCre</td><td>Lagern Sie die Aliquoten des Virus (4 x 108 pfu/aliquot) bei -80 &#176; C zur Vermeidung wiederholter Gefrier-Auftauzyklen.</td></tr><tr><td>Adenovirus-mCherry</td><td>Gene Transfer Vector Core von der University of Iowa</td><td>Ad5CMVmCherry</td><td>Speichern Sie Aliquots des Virus (4 x 108 pfu/aliquot) bei -80 &#176; C zur Vermeidung wiederholter Gefrier-Auftauzyklen.</td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Firma Hamilton</td><td>701RN</td><td>10 &#956; l Spritze, RN-Serie. Autoklav vor und nach jedem Gebrauch. Reinigen Sie mit PBS und 75% Ethanol.</td></tr><tr><td>Kundenspezifische Nadel</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05</td><td>33 G 0,5 in langer RN-Nadel, mit einer 12&#176; Fase. Autoklavieren Sie vor und nach jedem Gebrauch. Reinigen Sie mit PBS und 75% Ethanol.</td></tr><tr><td>Chirurgische Zange</td><td>Dumont</td><td>52100-58</td><td>Dumostar Nr. 5 Pinzette. Nach jedem Gebrauch mit 75% Ethanol reinigen, anschließend MEM-Pulver autoklavieren</td></tr><tr><td></td><td>Cellgro</td><td>50 012 PB</td><td>Bei 4 &#176 lagern; C in Pulverform und rekonstituierter Form</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Zu MEM hinzufügen und Filter stearilisieren</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td>Mindestens 96%, wasserfrei</td></tr></tbody></table>

initiation metastasierende mammakarzinom durch targeting des duktalen epithel mit adenovirus-cre: eine neue transgene maus-modell der brustkrebs

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Brustkrebs ist eine heterogene Erkrankung, die komplexen zellulären Interaktionen zwischen der Entwicklungs Tumor und Immunsystems, was schließlich in der exponentiellen Tumorwachstum und Metastasen in Geweben distalen und dem Zusammenbruch der Anti-Tumor-Immunität. Viele nützliche Tiermodelle existieren, um Brustkrebs zu studieren, aber keine, die das Fortschreiten der Krankheit beim Menschen auftritt vollständig rekapitulieren. Um ein besseres Verständnis der zellulären Interaktionen, die in der Bildung von latenten Metastasierung und verminderter Überleben zu gewinnen, haben wir einen induzierbaren transgenen Mausmodell von YFP-exprimierenden duktales Karzinom, die nach der Geschlechtsreife entwickelt in immunkompetenten Mäusen und wird angetrieben wird durch konsequente, endokrine unabhängige Onkogenexpression. Die Aktivierung von YFP, Ablation von p53, und Ausdruck einer onkogenen Form von K-ras wurde von der Lieferung eines Adenovirus Cre-Rekombinase in der Milchkanal von sexuell reifen, rein weiblichen Mäusen erreicht. Tumorenbeginnen zu 6 Wochen nach der Initiierung der onkogenen Ereignisse angezeigt. Nach Tumoren deutlich wird, Fortschritte sie sich langsam für etwa zwei Wochen, bevor sie, exponentiell zu wachsen beginnen. Nach 7-8 Wochen nach der Adenovirus-Injektion wird Gefäßsystem beobachtet Anschluss der Tumormasse zu distalen Lymphknoten, mit eventuellen lymphovascular Invasion von YFP + Tumorzellen mit den distalen axillären Lymphknoten. Infiltrierenden Leukozyten-Populationen sind ähnlich zu denjenigen in der menschlichen Brustkarzinome, einschließlich der Anwesenheit von αβ und γδ T-Zellen, Makrophagen und MDSCs gefunden. Dieses einzigartige Modell wird die Untersuchung der zellulären und immunologischen Mechanismen in latenter Metastasen und Ruhe zusätzlich zu nützlich für die Entwicklung neuer immun invasive Interventionen zur Behandlung von Brustkrebs beteiligt sind, erleichtern.

Eine erfolgreiche Ansteuerung des Milchgallengewebes kann durch die Herstellung von Ganzpräparaten der Mammaria nach Injektion von Trypanblau (zur Überprüfung der korrekten Injektionstechnik (Abbildung 1A) oder eines Adenovirus, das mCherry exprimiert (zur Überprüfung der korrekten Virenaufbereitung und Infektion der ductalen Epithelzellen, Abbildung 1B)), wie zuvor beschrieben32, veranschaulicht werden.
<img alt="Gefäßstrukturdiagramm; Mikroskopie; Färbung mit blauer Farbstoff (A) und fluoreszierende Markierung (B); TD, LD, MG." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Intraduktale Zielgerichtetheit der Brustdrüsen durch Injektion von Trypanblau oder Adenovirus-mCherry. A) Eine Ganzpräparat-Analyse, wie zuvor beschrieben32, der Brustdrüse nach Injektion von Brustdrüse #4 mit Trypanblau wurde 3 Stunden nach der Injektion angefertigt, um die gezielte Erfassung des gesamten Duktalbaums zu visualisieren und zu bestätigen. Die Bilder zeigen eine 4fache Vergrößerung. B) Infektion des duktalen Epithels mit Adenovirus durch Injektion von 2,5 x 107 pfu Adenovirus, das mCherry exprimiert. Mäuse wurden intraduktal injiziert, und vier Tage nach der Injektion wurde ein Ganzpräparat der Brustdrüse angefertigt, um die virale Infektion des Duktalbaums zu bestätigen. Das Bild zeigt eine 4fache Vergrößerung. MG steht für Brustdrüse, LD für den Milch- oder Hauptgang und TD für den terminale Gang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.</a>
Wenn Tumoren in p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ transgenen Mäusen induziert werden, sind Tumoren erst ab etwa Tag 40 sichtbar, wenn die Milchdrüsen vergrößert und geschwollen erscheinen. Sobald dies beobachtet wird, ist es notwendig, mit der Palpation zu beginnen und das Tumorwachstum alle 5–7 Tage zu überwachen. Nach unserer Erfahrung geht der Verhärtung der Milchdrüse stets der Beginn der Tumorentwicklung voraus. Die Tumoren entwickeln sich weitere zwei Wochen lang langsam. Ab etwa Tag 56 beginnen die Tumoren exponentiell zu wachsen (Abbildung 2B). Zu diesem Zeitpunkt ist es entscheidend, bei gewünschten kinetischen Studien alle drei Tage die Tumorvolumina zu messen, da geringe Maus-zu-Maus-Variabilität im Tumorverlauf normal ist (Abbildungen 2A und 3A). Große abdominelle Tumoren sind bis Tag 80 deutlich sichtbar (Abbildung 2A, 2B und 3A), danach sollten die Mäuse euthanasiert werden, wenn die Tumoren mehr als 10 % des Körpergewichts betragen. Die cDNA-Analyse von drei Klonen einer maus mit Tumor zeigte die Expression von Mesothelin, Cytokeratin-8, Her2/neu und dem Östrogenrezeptor-α (Abbildung 2C).
<img alt="Studie zum Tumorwachstum bei Mäusen; Graph, Tumorvolumen; Western-Blot-Analyse der Proteinexpression." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Tumorentwicklung bei p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+-Mäusen, die intraduktal mit Adenovirus-Cre injiziert wurden. A) Zwei Beispiele für Tumoren 80 Tage nach Injektion mit Adenovirus, das Cre exprimiert. Den Mäusen wurde 2,5 × 107 PFU Adenovirus, das Cre exprimiert, verabreicht, und 80 Tage nach Tumorinduktion sind große, tastbare Massen sichtbar, die seitlich am Bauch des Tieres hervorstehen. B) Typische Tumorkinetik und Tastuntersuchungszeitplan für Tumoren, die bei p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+-Mäusen induziert wurden. C) Charakterisierung von drei Tumorzellklonen, die aus demselben homogenisierten Tumor einer p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+-Maus stammen. RNA wurde extrahiert und cDNA für die RT-PCR-Analyse unter Verwendung spezifischer Primer für β-Aktin, Mesothelin, Cytokeratin-8, Her2/neu, Progesteronrezeptor, Östrogenrezeptor-α und Östrogenrezeptor-β synthetisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.</a>
Ähnlich wie im zellulären Mikromilieu beim menschlichen Brustkrebs haben wir eine Infiltration von αβ- und γδ-T-Zellen sowie von myeloischen suppressorischen Zellen und Makrophagen in die Tumore beobachtet (Abbildung 4). Das Gefäßsystem, das zum axillären Lymphknoten abfließt, beginnt sich zu füllen, bevor die Tumore so weit gewachsen sind, dass sie das gesamte Brustgewebe umfassen, in das die Injektion erfolgt ist (Abbildung 3A). Lymphovaskuläre Invasion und Metastasierung von Tumorzellen können verfolgt werden, indem man LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP-Mäuse mit LSL-EYFP-Mäusen kreuzt. Nach der Cre-vermittelten Excision werden YFP-exprimierende Tumorzellen (sowohl stark als auch schwach exprimierend) im Tumor nachgewiesen und können bei ihrer Metastasierung zum entwässernden axillären Lymphknoten verfolgt werden (Abbildung 3B). Die Metastasierung zum distalen axillären Lymphknoten wurde bestätigt, indem eine Tumorzelllinie von diesem Ort aus einer tumortragenden LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP-Maus erfolgreich kultiviert werden konnte (Daten nicht gezeigt).
<img alt="Tumorprogression bei Mäusen und Durchflusszytometrie-Diagramme, Gewebeanalyse, SSC- vs. YFP-Streudiagramme." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Bildung von Tumoren und latente Metastasierung in den axillären Lymphknoten. A) Beispiel für drei fortgeschrittene Brusttumoren mit unterschiedlichen Tumorprogressionsraten. Ein solider Tumor, gekennzeichnet durch den Pfeil, bildet sich und wächst schließlich bis zur Größe des gesamten Bauchmammarorgans heran. Der Tumor bleibt auf das Brustgewebe beschränkt und zeigt keine Invasion oder Anheftung an den Muskel, der die Bauchhöhle bedeckt. Deutlich sichtbar ist die Erweiterung der oberflächlichen epigastrischen Vene zwischen den inguinalen und axillären Lymphknoten, markiert durch weiße Pfeilspitzen. Nach 7–8 Wochen beginnt der axilläre Lymphknoten sich zu vergrößern, bedingt durch lymphovaskuläre Invasion der Tumorzellen, wie durch den Pfeil angezeigt. B) Die Metastasierung von YFP-positiven Tumorzellen kann im axillären Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie visualisiert werden. LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP LSL-EYFP-Mäuse wurden verwendet, um Tumoren zu induzieren und die Aktivierung von YFP durch intraduktale Applikation von Adenovirus-Cre zu bewirken. Um die lymphovaskuläre Invasion von Tumorzellen in den axillären Lymphknoten zu bestätigen, wurden 80 Tage nach der Adenovirus-Injektion die angegebenen Lymphknoten und Organe entnommen, mit Markern für Lymphozyten gefärbt und auf YFP-Expression untersucht. CL steht für den kontralateralen, nicht-tumorbefallenen, drainierenden Lymphknoten. Die Ergebnisse zeigen die Gating-Strategie auf CD45-negative Tumorzellen, was darauf hinweist, dass die Tumorzellen in den distalen axillären Lymphknoten eindringen. Die Zahlen geben den Prozentsatz der YFP-positiven Zellen der Gesamtpopulation an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.</a>
<img alt="Durchflusszytometrie-Diagramme; CD3, CD45, γδTCR, CD11b, GR1-Marker; Analyse von Zellpopulationen" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Immuninfiltrate in transgenen Brusttumoren der Maus. Maus-Brusttumoren wurden homogenisiert und für CD45, CD3, γδTCR, CD11b und GR1 gefärbt. Die Zahlen geben den Prozentsatz positiver Leukozyten im gesamten Tumor an: (63,5), gesamt CD3+ (46,7), gesamt CD3-negativ (40,1), gesamt CD3+ γδ+ (γδ-T-Zellen, 13), CD3+ γδ-negativ (24), gesamt GR1-hoch CD11b (MDSC, 28,6) und gesamt CD11b GR1-niedrig (Makrophagen, 18,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzuzeigen.</a>
Aufgrund der Anatomie der Maus und der Technik intraduktaler Injektionen erzielen wir die konsistentesten Ergebnisse und zuverlässigsten Injektionen, wenn die Brustdrüsen 4 und 9 (Abbildung 5) gezielt behandelt werden. Dennoch kann je nach Vorliebe des Technikers, der die Operation durchführt, jede beliebige Drüse angesprochen werden.
<img alt="Diagramm der Nagetieranatomie mit beschrifteten experimentellen Markierungen für biologische Forschung" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 5"> 
Abbildung 5. Nummerierung der Milchgänge. Die Milchgänge 4 und 9 sind im Diagramm rot hervorgehoben und am Mausmodell mit Pfeilen gekennzeichnet. Nach unserer Erfahrung lassen sich Injektionen an diesen Milchgängen am einfachsten durchführen, doch alle anderen gezielten Brustgewebe entwickelten Tumoren mit ähnlicher Kinetik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.</a>

Die Aktivierung von latenten Mutationen mit Adenovirus-Cre im duktalen System der Brust führt zu einem klinisch relevanten metastasierten Brustkrebs. Der Einbau eines YFP-Promotors ermöglicht die Verfolgung von distalen metastasierten Tumorzellen. Dieses Modell ist nützlich, um latente Metastasen und Anti-Tumor-Immunität zu untersuchen und neuartige Immuntherapien zur Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein Mausmodell für Brustkrebs zu entwickeln, der schließlich in Gegenwart eines gesunden Immunsystems metastasiert. Dies wird zunächst durch die Verabreichung eines Cree-exprimierenden Adenovirus in den Milchgangkanal der Versuchstiere erreicht. Anschließend wird die Brustdrüse regelmäßig abgetastet, um das Fortschreiten des Tumors zu überwachen.Letztendlich können die Tumormetastasierung und die Leukozyteninfiltration in den axillären Lymphknoten durch durchflusszytometrische Analyse beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Brusttumormodellen besteht darin, dass sie die präzise Initiierung von Tumoren ermöglicht, die sich in Gegenwart eines ausgereiften Immunsystems entwickeln können und die durch die YFP-Expression verfolgt werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die einführenden Injektionsschritte schwer zu erlernen sind.Die richtige Platzierung der Nadel erfordert Präzision und Übung. Am Tag des Experiments lagern Sie Eloqua von viermal 10 der achten plaquebildenden Einheiten des Adenovirus Cree auf Trockeneis, tauen Sie das Virus bei Raumtemperatur auf und mischen Sie es mit ausreichend 3%iger Saccharose in sterilem Wasser, um das endgültige Volumen auf 10 Mikroliter zu bringen. Mischen Sie anschließend vorsichtig 34 Mikroliter Mem und vier Mikroliter frisch zubereitetes Calciumchlorid in das Virus und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur.Nach 15 bis 20 Minuten erscheinen die Medien trüb, was auf die Bildung der Adenovirus-Ausfällungen hinweist. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Viruspartikel gleichmäßig in der Suspension verteilt sind, und ziehen Sie dann zum Injizieren der Viruspartikel drei Mikroliter des Virus in eine 10-Mikroliter-Spritze auf. Als nächstes legen Sie eine betäubte Maus auf den Rücken auf den beleuchteten Tisch eines sauberen Dissektionsmikroskops.Beleuchten Sie den Bauch mit einer zusätzlichen Lichtquelle und lokalisieren Sie die linke, vierte oder die rechte neunte Leistendrüse an den kleinen weißen Fellflecken, die jede Brustwarze umgeben. Reiben Sie nun den Sauger vorsichtig mit einem sterilen, mit Ethanol getränkten Applikator mit Wattespitze ab. Sichern Sie dann die Brustwarze mit einer feinen chirurgischen Zange und ziehen Sie sie mit leichter Kraft nach oben.Um den Keratinpfropfen zu entfernen, stabilisieren Sie den Nippel zwischen den Pinzetten und führen Sie die Nadel vorsichtig zwischen die Spitzen ein. Kanülieren Sie den Kanalkanal in einem 90-Grad-Winkel, um die richtige Injektionstiefe zu gewährleisten, ziehen Sie die Nadel nach dem Einführen in das Lumen des Kanals vorsichtig nach oben und ziehen Sie den Nippel entlang der Ränder der Nadel nach oben, während sie nach oben gezogen wird. Wenn die Nadel richtig platziert ist, tauchen Sie vorsichtig den gesamten Inhalt der Spritze ein.Der Sauger sollte sich leicht aufblasen, wenn die Flüssigkeit hinzugefügt wird. Legen Sie die Maus nach der Injektion wieder auf das Heizkissen, bis sie sich von der Narkose zu erholen beginnt. Setzen Sie das Tier dann wieder in einen sauberen Käfig und überwachen Sie es, bis eine vollständige Genesung festgestellt wird.Palpieren Sie die injizierte Gedächtnisdrüse am 30. Tag, um die Vergrößerung und Schwellung der Drüse zu beurteilen. Überwachen Sie das Fortschreiten des Tumors alle fünf bis sieben Tage. Sobald eine geschwollene und vergrößerte Brustdrüse beobachtet wird, messen Sie das Tumorvolumen alle drei bis vier Tage auf die Kinetik des Tumorwachstums.Sobald tastbare Tumoren auftreten, kann ein erfolgreiches Targeting des Milchgangbaums visualisiert werden, indem ganze Berge der Brustdrüse nach der Injektion von trip und blue präpariert werden, um die ordnungsgemäße Injektion zu überprüfen, oder nach der Injektion eines Adenovirus, das die M-Kirsche exprimiert, um die ordnungsgemäße virale Vorbereitung und Infektion duktiler Epithelzellen zu überprüfen. Wenn Tumoren in transgenen Mäusen mit F Fluxed P 53 LSLK RAs induziert werden, werden erste Tumoren erst um den 40. Tag herum sichtbar, wenn die Brustdrüsen vergrößert und geschwollen werden. Ab etwa dem 56. Tag beginnen die Tumore exponentiell zu wachsen.Zu diesem Zeitpunkt ist es wichtig, das Tumorvolumen alle drei Tage zu messen. Wenn kinetische Studien gewünscht werden, da es eine gewisse normale Variabilität von Maus zu Maus in der Tumorprogression gibt, werden am 80. Tag große abdominale Massen sichtbar sein, danach sollten Mäuse eingeschläfert werden, wenn die Tumoren mehr als 10 % des Körpergewichts des Tieres überschreiten. Die CDNA-Analyse von drei Zelllinien, die von Brusttumoren im Fluss P 53 LSL KRAS transgenen Mäusen abgeleitet wurden, zeigte, dass die Tumoren Mesothelin, Cytokeratin acht, HER zwei neue und Östrogenrezeptor alpha exprimieren, ähnlich wie in der zellulären Mikroumgebung bei menschlichem Brustkrebs die Infiltration von Alpha-, Beta- und Gamma-Delta-T-Zellen sowie myeloischen Suppressorzellen und Makrophagen in die Tumoren beobachtet wird.Das Gefäßsystem, das zum axillären Lymphknoten abfließt, beginnt sich zu verschließen, bevor die Tumore gewachsen sind, und umfasst schließlich das gesamte Gedächtnisgewebe, in dem die Injektion durchgeführt wurde. Es kommt auch zu einer deutlichen Schwellung der oberflächlichen Magenvene zwischen den leistenden und axillären Lymphknoten. Nach sieben bis acht Wochen vergrößert sich der axilläre Lymphknoten aufgrund der lymphovaskulären Invasion der Tumorzellen.Die lymphovaskuläre Invasion und Metastasierung der Tumorzellen kann durch Kreuzung von beflockten P 53 LSLK RAs transgenen Mäusen mit L-S-L-E-Y-F-P Mäusen verfolgt werden. Nach der prämedialen Exzision werden Zellen, die sowohl hohe als auch niedrige YFP-Spiegel exprimieren, im Tumor nachgewiesen und ihre Metastasierung kann bis zum drainierenden axillären Lymphknoten zurückverfolgt werden. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie bei richtiger Anwendung in zwei bis drei Stunden an einer experimentellen Kohorte von 20 Mäusen durchgeführt werden.Nach diesem Verfahren können weitere Tumormodelle entwickelt werden, indem Mäuse mit zusätzlichen Locks, p-Transgenen, gezüchtet werden, um Fragen zu beantworten wie: Wie beeinflussen verschiedene Onkogene die Pathologie, die Immunmikroumgebung und die metastasierende Invasion von Brustkrebs.

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Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs (Video) | JoVE Journal

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