Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Die Aktivierung von latenten Mutationen mit Adenovirus-Cre im duktalen System der Brust führt zu einem klinisch relevanten metastasierten Brustkrebs. Der Einbau eines YFP-Promotors ermöglicht die Verfolgung von distalen metastasierten Tumorzellen. Dieses Modell ist nützlich, um latente Metastasen und Anti-Tumor-Immunität zu untersuchen und neuartige Immuntherapien zur Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein Mausmodell für Brustkrebs zu entwickeln, der schließlich in Gegenwart eines gesunden Immunsystems metastasiert. Dies wird zunächst durch die Verabreichung eines Cree-exprimierenden Adenovirus in den Milchgangkanal der Versuchstiere erreicht. Anschließend wird die Brustdrüse regelmäßig abgetastet, um das Fortschreiten des Tumors zu überwachen.

Letztendlich können die Tumormetastasierung und die Leukozyteninfiltration in den axillären Lymphknoten durch durchflusszytometrische Analyse beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Brusttumormodellen besteht darin, dass sie die präzise Initiierung von Tumoren ermöglicht, die sich in Gegenwart eines ausgereiften Immunsystems entwickeln können und die durch die YFP-Expression verfolgt werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die einführenden Injektionsschritte schwer zu erlernen sind.

Die richtige Platzierung der Nadel erfordert Präzision und Übung. Am Tag des Experiments lagern Sie Eloqua von viermal 10 der achten plaquebildenden Einheiten des Adenovirus Cree auf Trockeneis, tauen Sie das Virus bei Raumtemperatur auf und mischen Sie es mit ausreichend 3%iger Saccharose in sterilem Wasser, um das endgültige Volumen auf 10 Mikroliter zu bringen. Mischen Sie anschließend vorsichtig 34 Mikroliter Mem und vier Mikroliter frisch zubereitetes Calciumchlorid in das Virus und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur.

Nach 15 bis 20 Minuten erscheinen die Medien trüb, was auf die Bildung der Adenovirus-Ausfällungen hinweist. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Viruspartikel gleichmäßig in der Suspension verteilt sind, und ziehen Sie dann zum Injizieren der Viruspartikel drei Mikroliter des Virus in eine 10-Mikroliter-Spritze auf. Als nächstes legen Sie eine betäubte Maus auf den Rücken auf den beleuchteten Tisch eines sauberen Dissektionsmikroskops.

Beleuchten Sie den Bauch mit einer zusätzlichen Lichtquelle und lokalisieren Sie die linke, vierte oder die rechte neunte Leistendrüse an den kleinen weißen Fellflecken, die jede Brustwarze umgeben. Reiben Sie nun den Sauger vorsichtig mit einem sterilen, mit Ethanol getränkten Applikator mit Wattespitze ab. Sichern Sie dann die Brustwarze mit einer feinen chirurgischen Zange und ziehen Sie sie mit leichter Kraft nach oben.

Um den Keratinpfropfen zu entfernen, stabilisieren Sie den Nippel zwischen den Pinzetten und führen Sie die Nadel vorsichtig zwischen die Spitzen ein. Kanülieren Sie den Kanalkanal in einem 90-Grad-Winkel, um die richtige Injektionstiefe zu gewährleisten, ziehen Sie die Nadel nach dem Einführen in das Lumen des Kanals vorsichtig nach oben und ziehen Sie den Nippel entlang der Ränder der Nadel nach oben, während sie nach oben gezogen wird. Wenn die Nadel richtig platziert ist, tauchen Sie vorsichtig den gesamten Inhalt der Spritze ein.

Der Sauger sollte sich leicht aufblasen, wenn die Flüssigkeit hinzugefügt wird. Legen Sie die Maus nach der Injektion wieder auf das Heizkissen, bis sie sich von der Narkose zu erholen beginnt. Setzen Sie das Tier dann wieder in einen sauberen Käfig und überwachen Sie es, bis eine vollständige Genesung festgestellt wird.

Palpieren Sie die injizierte Gedächtnisdrüse am 30. Tag, um die Vergrößerung und Schwellung der Drüse zu beurteilen. Überwachen Sie das Fortschreiten des Tumors alle fünf bis sieben Tage. Sobald eine geschwollene und vergrößerte Brustdrüse beobachtet wird, messen Sie das Tumorvolumen alle drei bis vier Tage auf die Kinetik des Tumorwachstums.

Sobald tastbare Tumoren auftreten, kann ein erfolgreiches Targeting des Milchgangbaums visualisiert werden, indem ganze Berge der Brustdrüse nach der Injektion von trip und blue präpariert werden, um die ordnungsgemäße Injektion zu überprüfen, oder nach der Injektion eines Adenovirus, das die M-Kirsche exprimiert, um die ordnungsgemäße virale Vorbereitung und Infektion duktiler Epithelzellen zu überprüfen. Wenn Tumoren in transgenen Mäusen mit F Fluxed P 53 LSLK RAs induziert werden, werden erste Tumoren erst um den 40. Tag herum sichtbar, wenn die Brustdrüsen vergrößert und geschwollen werden. Ab etwa dem 56. Tag beginnen die Tumore exponentiell zu wachsen.

Zu diesem Zeitpunkt ist es wichtig, das Tumorvolumen alle drei Tage zu messen. Wenn kinetische Studien gewünscht werden, da es eine gewisse normale Variabilität von Maus zu Maus in der Tumorprogression gibt, werden am 80. Tag große abdominale Massen sichtbar sein, danach sollten Mäuse eingeschläfert werden, wenn die Tumoren mehr als 10 % des Körpergewichts des Tieres überschreiten. Die CDNA-Analyse von drei Zelllinien, die von Brusttumoren im Fluss P 53 LSL KRAS transgenen Mäusen abgeleitet wurden, zeigte, dass die Tumoren Mesothelin, Cytokeratin acht, HER zwei neue und Östrogenrezeptor alpha exprimieren, ähnlich wie in der zellulären Mikroumgebung bei menschlichem Brustkrebs die Infiltration von Alpha-, Beta- und Gamma-Delta-T-Zellen sowie myeloischen Suppressorzellen und Makrophagen in die Tumoren beobachtet wird.

Das Gefäßsystem, das zum axillären Lymphknoten abfließt, beginnt sich zu verschließen, bevor die Tumore gewachsen sind, und umfasst schließlich das gesamte Gedächtnisgewebe, in dem die Injektion durchgeführt wurde. Es kommt auch zu einer deutlichen Schwellung der oberflächlichen Magenvene zwischen den leistenden und axillären Lymphknoten. Nach sieben bis acht Wochen vergrößert sich der axilläre Lymphknoten aufgrund der lymphovaskulären Invasion der Tumorzellen.

Die lymphovaskuläre Invasion und Metastasierung der Tumorzellen kann durch Kreuzung von beflockten P 53 LSLK RAs transgenen Mäusen mit L-S-L-E-Y-F-P Mäusen verfolgt werden. Nach der prämedialen Exzision werden Zellen, die sowohl hohe als auch niedrige YFP-Spiegel exprimieren, im Tumor nachgewiesen und ihre Metastasierung kann bis zum drainierenden axillären Lymphknoten zurückverfolgt werden. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie bei richtiger Anwendung in zwei bis drei Stunden an einer experimentellen Kohorte von 20 Mäusen durchgeführt werden.

Nach diesem Verfahren können weitere Tumormodelle entwickelt werden, indem Mäuse mit zusätzlichen Locks, p-Transgenen, gezüchtet werden, um Fragen zu beantworten wie: Wie beeinflussen verschiedene Onkogene die Pathologie, die Immunmikroumgebung und die metastasierende Invasion von Brustkrebs