Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, microRNAs in zerebralen Rückenmarksflüssigkeiten mittels quantitativer PCR zu profilieren und die Daten mit professioneller Software der Generation X zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gesamt-RNA aus zerebralen Rückenmarksflüssigkeitsproben isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine reverse Transkription durchzuführen, um die RNAs in CDNAs zu transkribieren.

Als nächstes werden die CDNAs mit einem cybergrünen Mastermix gemischt, der in 384-Well-Platten geladen wird, die Primer für 742 einzigartige Sequenzen enthalten, und mittels Echtzeit-PCR amplifiziert. Der letzte Schritt besteht darin, die aus der Echtzeit-Amplifikation gewonnenen Daten zu analysieren. Letztendlich können die Ergebnisse als Faltenänderung, -zunahme oder -abnahme über ein Steuerelement ausgedrückt und in verschiedenen grafischen Darstellungen visualisiert werden.

Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Chip-Arrays besteht also darin, dass unsere Methode hochempfindlich ist und eine minimale Menge an RNAs benötigt. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der hohen Menge an generierten Daten und der Verwendung der Software zur Datenanalyse Schwierigkeiten haben. Besprühen Sie zunächst den Arbeitsbereich und die Pipetten mit RNA Zap.

Zu Beginn werden die Template-RNA-Proben bei der CDNA-Synthese mit nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter verdünnt. Legen Sie anschließend den five x Reaktionspuffer vorsichtig zum Auftauen auf Eis. Fügen Sie dann 40 Mikroliter nukleasefreies Wasser zum RNA-Spike hinzu, um das Reagenz zu resuspendieren, wirbeln Sie das Röhrchen und lassen Sie es 15 bis 20 Minuten lang auf Eis.

Nehmen Sie dann die Enzyme aus dem Gefrierschrank, schnippen Sie die Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. Sobald alle Reagenzien aufgetaut sind, schleudern Sie sie schnell herunter. Bereiten Sie die Arbeitslösung der reversen Transkriptase in einem 1,5-Milliliter-Eph-Röhrchen vor, indem Sie das Fünf-fach-Reaktionspuffer-Enzym hinzufügen.

Mischen Sie nukleasefreies Wasser und RNA-Spike im Template unter Verwendung der in Tabelle eins angegebenen Anteile. Mischen Sie anschließend die Arbeitslösung, indem Sie sie ein bis zwei Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Schleudern Sie die Lösung 10 Sekunden lang kurz herunter und geben Sie die Arbeitslösung dann in nukleasefreie PCR-Röhrchen ab.

Geben Sie dann die Template-RNA direkt in die PCR-Röhrchen. Drehen Sie die Reaktion ein bis zwei Sekunden lang sanft, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien gründlich gemischt sind, und drehen Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang in die Röhrchen. Legen Sie die Probe in das PCR-Gerät und geben Sie die hier gezeigten Einstellungen ein.

Starten Sie dann das Programm nach der Retrotranskription. Das CDNA ist bereit für die Echtzeit-PCR-Amplifikation und kann bis zu fünf Wochen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um mit der Echtzeit-PCR-Amplifikation zu beginnen, legen Sie zunächst das CDNA und den PCR-Mastermix auf Eis.

Schützen Sie zum Auftauen die PCR-Mastermix-Fläschchen vor Licht, indem Sie sie während des Auftauens mit Aluminiumfolie abdecken. Nach dem Auftauen vortexen Sie den PCR-Mastermix für ein bis zwei Sekunden. Kombinieren Sie anschließend 2000 Mikroliter von zwei XPCR-Mastermixen und 1.980 Mikroliter Wasser in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie der Mischung 20 Mikroliter CDNA hinzu und wirbeln Sie die Lösungen ein bis zwei Sekunden lang vorsichtig ein. Dann schleudern Sie die Lösungen in einer gekühlten Zentrifuge bei 1.500 G für eine Minute bei vier Grad Celsius herunter. Geben Sie anschließend den PCR-Reaktionsmix in ein Mehrkanal-Pipettenreservoir.

Schleudern Sie die gebrauchsfertigen Platten in einer gekühlten Zentrifuge kurz bei 1.500 g herunter, bevor Sie die Plattenversiegelung entfernen. Geben Sie dann 10 Mikroliter des PCR-Mastermixes, der CD NA enthält, in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Verwenden Sie eine 16-Kanal-Pipette und versiegeln Sie die Platte mit einer optischen Versiegelungsfolie.

Nachdem Sie den Mastermix hinzugefügt haben, drehen Sie die Platte kurz in einer gekühlten Zentrifuge bei 1.500 G, um die Lösung auf den Boden der Vertiefungen zu ziehen. Mischen Sie die Proben und entfernen Sie Luftblasen, um das Experiment zu unterbrechen. Lagern Sie die Reaktionen zu diesem Zeitpunkt bis zu 24 Stunden lang an einem lichtgeschützten Ort bei vier Grad Celsius.

Führen Sie als Nächstes eine Echtzeit-PCR-Amplifikations- und Schmelzkurvenanalyse gemäß den in Tabelle zwei aufgeführten Parametern durch. Um mit der Analyse zu beginnen, wählen Sie die zweite abgeleitete Analysemethode im Roche Light Cycler aus. Berechnen Sie dann den Quantifizierungszyklus oder die CQ-Werte.

Exportieren Sie die Daten als Tabelle, und speichern Sie sie als Textdatei. Importieren Sie als Nächstes die Daten in Gen X, indem Sie zuerst auf die Schaltfläche des gon-Importassistenten klicken und dann im nächsten Fenster auf Start klicken, wählen Sie das Format der Instrumenten- und Plattenlayoutdateien aus. Excel-Dateien für das Plattenlayout können von der GON-Website heruntergeladen werden.

Importieren Sie dann das erste Bedienfeld und klicken Sie auf Weiter. Die Tabelle, die nach dem Dateiimport generiert wird, enthält in diesem Schritt vordefinierte Spalten, Bearbeiten von Beispielnamen und Hinzufügen oder Entfernen von Klassifikationsspalten. Klicken Sie auf Weiter, wenn Sie fertig sind, und speichern Sie die Daten.

Laden Sie es dann in den Dateneditor Kalibrieren Sie zunächst die Daten zwischen den Platten, indem Sie im Vorverarbeitungsmenü die Option INTERPLATE-Kalibrierung auswählen, um sicherzustellen, dass alle Platten mit denselben Parametern berechnet werden. Definieren Sie als Nächstes einen Grenzwert, der Daten verwirft, die höher als der Schwellenwertzyklus oder ct sind. Wenn eine Mikro-RNA eine CT aufweist, die für eine von drei Repliken größer ist, wird dieser Messwert durch den Durchschnitt der CT der beiden anderen Sonden ersetzt.

Definieren Sie Referenzgene, indem Sie eine Liste von microRNAs auswählen, die in allen Proben ähnliche CQ-Werte aufweisen und die Gennorm ausführen. Normalisieren Sie als Nächstes die Daten mit den erhaltenen Referenzgenen. Die resultierenden Werte entsprechen dem Delta CT.

Entfernen Sie leere und fast leere Spalten, indem Sie das Vorverarbeitungsfenster öffnen, Blatt validieren auswählen und dann in der Zeile leere Spalten entfernen in der Zeile darunter die Option Anwenden auswählen. Wählen Sie den gewünschten Prozentsatz gültiger Daten aus und klicken Sie auf Übernehmen. Wählen Sie 100 %, wenn Sie nur microRNAs vergleichen möchten, die allen Proben gemeinsam sind.

Laden Sie die endgültige MDF-Datei in Gen X und öffnen Sie den Datenmanager, um microRNAs und Proben auf Heatmaps und Dendrogrammen zu klassifizieren, zu clustern und zu visualisieren. Wählen Sie dann Gruppen von Beispielen aus, erstellen Sie sie, und klicken Sie auf Anwenden, wenn Sie fertig sind. Klicken Sie anschließend im Fenster der Systemsteuerung auf Ausführen.

Speichern Sie die Heatmap im gewünschten Format, z. B. TIFF oder Bitmap, und kopieren Sie die Heatmap, und ändern Sie sie nach Bedarf. Dieser grafische Balken wurde aus der G-Norm-Anwendung innerhalb der Generation X zur Analyse von 10 möglichen microRNA-Referenzgenen gewonnen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MIR 622 und MI 1, 266 die stabilsten exprimierten microRNAs sind.

Der hier gezeigte Boxplot zeigt die Verteilung der Daten für jede der 11 statistisch signifikanten microRNAs innerhalb der Gruppen HIVE und HIV plus ohne Enzephalitis. In jeder Spalte zeigt das Diagramm den Median sowie das erste und dritte Quartil sowie die Maximal- und Minimalwerte an. Nach diesem Verfahren kann das Mineral Profiling an allen Körperflüssigkeiten, Gewebeproben und kultivierten Zellen durchgeführt werden.