Name: Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Lernen Sie die biolumineszente Bildgebung zur Echtzeit-Überwachung von Streptococcus pneumoniae-Infektionen in einem akuten Lungenentzündungs-Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Virulenzfaktoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Forschung im Labor wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Medical Genomics Infektion (FKZ 0315828A) SH unterstützt.

Die hier beschriebenen Tierinfektionsversuche müssen in strikter Übereinstimmung mit den örtlichen und internationalen (zB Europäische Gesundheitsgesetz des Bundes für Labortierkunde Verbände (FELASA)) Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren durchgeführt werden. Die Versuche müssen von der lokalen ethischen Pension und Institutional Animal Care Committee genehmigt werden. Alle Experimente mit S. pneumoniae im Labor oder Tierinfektionen sind in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt. 1. Vorbereitung der Infektions Auf Biolumineszenz Pneumocococi <ol><li> Vorbereitung stock Pneumokokken Kulturen in Todd-Hewitt-Brühe mit 1% (w / v) Hefeextrakt und einer Endkonzentration von 20% Glycerin für die Wartung bei 80 ° C ergänzt </li><li> Platte eine kleine Menge an Tiefkühl Lager Pneumokokken-Kultur auf eine Blut-Agar-Platte und Inkubation der Bakterien für 10 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. Ter Blut-Agar-Platte enthält die geeigneten Antibiotika wie Kanamycin (150 ug / ml) für die Transposon-Insertion des luxABCDE Genkassette in das Genom. </li><li> Unter pflegen eine frische Kolonie auf eine neue Blut-Agar-Platte für maximal 10 Stunden. </li><li> Impfen THY-Medium mit 10% (v / v) hitzeinaktiviertem (30 min bei 56 ° C) fetales Rinderserum (FBS) mit Pneumokokken ergänzt und starten Sie die Kultur auf eine OD 600 von 0,05 bis 0,07. </li><li> Pneumokokken Inkubieren ohne Schütteln bei 37 ° C und 5% CO 2, bis die Kultur eine OD 600 von 0,35-0,40 erreicht. Das Wachstum wird zwischen 3-4 Stunden dauern. </li><li> Pneumokokken Ernte durch Zentrifugation bei 3.750 × g für 10 min und Resuspendieren Biolumineszenz Pneumokokken in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS) mit 0,5% FBS ergänzt. </li><li> Einstellen des Inokulums auf die gewünschte Konzentration in PBS/10% FBS. Die Infektionsdosis ist abhängig von der Pneumokokkenstamm verwendet und den genetischen Hintergrund der micE. Um intranasal mit S. infizieren outbred CD-1-Mäuse pneumoniae D39 lux die Infektion Dosis bis 1 × 10 7 CFU in einer Suspension von 20 ul mit 90 Einheiten Hyaluronidase ergänzt eingestellt werden. Schütteln oder Wirbel Pneumokokken, da dies Autolyse auslösen. </li><li> Überprüfen der Inokulum-Konzentration durch Plattieren 10fache serielle Verdünnungen auf Blut-Agar-und Auszählung der Kolonien nach dem Wachstum über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Überprüfen der Biolumineszenz des Pneumokokken Inokulum durch Messung der Biolumineszenz unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems. </li></ol> 2. Die intranasale und intraperitoneale Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz Pneumokokken <ol><li> Verwenden weiblichen outbred Mäuse in dem Alter von 7-10 Wochen für die akute Lungenentzündung und Sepsis-Modell. Das Gewicht dieser Mäuse sollte zwischen 20-30 g bestimmt. </li><li> Mäuse anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin. Bereiten Sie eine Mischung 1,0 mgKetamin und Xylazin 0,1 mg in 100 &amp;mgr; l sterilem 0,9% (w / v) Natriumchlorid-Mäuse mit einem Körpergewicht von 20 g. Dies ist konsistent mit einer Dosis von 50 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg / kg Körpergewicht für Xylazin. Um genau zu sein, wiegen Mäuse vor der Injektion von Anästhetika. </li><li> Injizieren Sie die Mischung in die Bauchhöhle und legen die Tiere zurück in den Käfig, bis die Narkosemittel wirken und die Tiere narkotisiert sind. Die Atmung von Mäusen wird sehr langsam und regelmäßig. Mäuse müssen vollständig narkotisierten, so dass die intranasale Impfung und Inhalation der Bakteriensuspension werden in Niesen und damit Verlust von Inokulum führen. Dies kann durch Einklemmen der Maus am Ende ihres Schwanzes untersucht werden, eine vollständig narkotisierten Maus Reaktions fehlt. </li><li> Vorsichtig holen ein narkotisierten Maus und halten Sie die Maus zwischen den Fingern und Daumen mit der Nase aufrecht (Abbildung 1). </li><li> Verwenden Sie eine Pipette mit langen, schmalen Spitzen (Gel-LoaderTipps) und Drop Biolumineszenz Pneumokokken in mehreren kleinen Tröpfchen auf der Nase (10 ul / Nasenloch) der Maus 26-29. Die Maus wird unfreiwillig einatmen der Bakterien. Halten Sie die Maus 1-2 min aufrecht und beobachten, ob die Maus niest oder hält den Impfstoff. </li><li> Infect 7-10 Wochen alten CD-1-Mäuse intranasal mit einer Infektionsdosis von 1 x 10 7 oder 7,5 x 10 7 Pneumokokken des Stammes D39 und TIGR4 jeweils um die Infektion in Echtzeit zu überwachen. Die Nachweisgrenze für das System ohne Absorption durch das Wirtsgewebe ist etwa 1 x 10 6 biolumineszenten Bakterien. </li><li> Infect Mäusen intraperitoneal (IP) zu bewerten und BioImage Virulenz von Pneumokokken in einem Sepsis-Mausinfektionsmodell. Verwenden 5 x 10 3 CFU in 100 &amp;mgr; l-Stamm D39 und 1 x 10 4 Dehnungs TIGR4. Mäuse werden nicht bei der Verwendung der IP-Route betäubt. </li><li> Impfen Kontrollmäusen mit PBS. <img alt="Figur 1" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Fig. 1 ist. Intranasale Infektion von CD-1-Mäusen mit S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . </li></ol> 3. Visualisierung Pneumokokken-Verbreitung in die Lunge und Blut Mit dem Imaging System Bild Verbreitung von Pneumokokken nach der intranasalen Infektion der weiblichen outbred CD1-Mäusen in Echtzeit unter Verwendung einer in-vivo-Imaging-System. <ol><li> Schalten Sie die Imaging-System und starten Sie die Bildanalyse-Software auf dem vorkonfigurierte Computer. </li><li> Das Abbildungssystem automatisch initialisiert und die CCD-Kamera thermo bis 90 ° C, bevor es aktiv abgekühlt wird. </li><li> Die Einstellungen und Binning hängen von der Anzahl der Mäuse gemessengleichzeitig und auf die Stärke der biolumineszenten Signals. Das Sichtfeld (FOV), um die Biolumineszenz der Tiere zu überwachen ist variabel und reicht die Vergrößerung zwischen einem FOV von 22,5 cm bis zu fünf Mäuse zu messen, und ein FOV von 3,9 cm, eine einzelne Maus oder Teile des Tieres, wie die Brust messen oder Kopf. </li><li> Verwenden routinemäßig eine Belichtungszeit von 1 min, einem mittleren Grad von Binning und einem FOV von 22,5 cm (Satz D). Zunächst wählen Sie die Leuchtbildmodus und legen Sie die Bildparameter dann. </li><li> Die Emission des Signals auf dem Bakterienstamm und Mausstamm verwendet und das Pigment der Maus ab. Rasur der Brust von Mäusen bei Verwendung z. B. C57BL / 6 Mäusen, was vorteilhaft sein kann, wenn die Abbildung der Entwicklung von Lungenentzündung in diesen Mäusen. </li><li> Bild infizierten Mäusen in vorgewählten Zeitintervallen. Messung der Biolumineszenz von Mäusen in der akuten Lungenmodell in zeitlichen Abständen von maximal 8-12 Stunden. Überwachung auch das Wohlergehen von infizierten Mäusen durch observing ihr Aussehen, das Verhalten und die Bestimmung der Gewichtsabnahme. </li><li> Betäuben Mäuse in der Suchtkammer des Anästhesiesystems der Bildgebungsgeräte vor den Messungen in der Kammer. Starten Inhalation eines Gemisches von Isofluran und Sauerstoff und warten, bis die Mäuse atmen Sie langsam und regelmäßig. </li><li> Zeigen betäubt Tiere in der bildgebenden Kammer des Systems und halten Mäuse in der Rückenlage. Die CCD-Kamera an der Oberseite der Kammer wird dann die Bild murinen Atemwege. </li><li> Legen Sie die Tiere mit der Nase in den Röhren, um ein Einatmen der Anästhetika ermöglichen. </li><li> Isofluran Eintrag in die Abbildungskammer über eine Gasleitung darf Narkose aufrecht zu erhalten. </li><li> Um die CCD-Kamera auf der Oberseite der Kammer zu aktivieren und Biolumineszenz-optische Bildgebung, drücken Sie &quot;Acquire&quot; in der Bildbearbeitungssoftware starten. Sofort eine Fotografie der Mäuse in der geschlossenen Kammer auf dem Bildschirm erscheint. Nach einer Minute<html> Messung eine Überlagerung der Biolumineszenz Daten und das Foto gezeigt. </li><li> Stoppen Narkose nach der Bildüberlagerung im Fenster der Software angezeigt wird, und setzen die Mäuse wieder in ihre Käfige. </li><li> Mäuse werden für die Wiederherstellung überwacht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Abbildung 2. Anästhesie und Überwachung von Mäusen mit Biolumineszenz Pneumokokken mit der Anästhesie und IVIS IVIS Spectrum System auf. A) Die IVIS Spectrum Imaging-System. B) Die IVIS Anästhesiesystem mit dem Brutraum. C) Mäuse in der Inkubation Kammer betäubt infiziert . D) Mäuse innerhalb der IVIS Spectrum Imaging Kammer mit ihrer Nase Einatmen der Narkose entfernt._blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. </li></ol> 4. Quantifizierung und Bewertung der Biolumineszenz von Mäuse Infizierte mit Biolumineszenz S. pneumoniae <ol><li> Bestimmen der Intensität der Biolumineszenz Mäusen oder von einem ausgewählten Bereich der Mäuse durch die Quantifizierung der Gesamtphotonenemission (Photonen / sec) unter Verwendung der Bildanalyse-Software. </li><li> Verwenden Sie die Werte der Photonenemission, die in einer Excel-Datenblattes sind, um eine Grafik erstellen. Da die Datenvariation ist oft hoch in den gruppierten Mäusen, erzeugen eine Box-Whisker Diagramm, um die Unterschiede in den Mäusen, die mit den verschiedenen Pneumokokken-Stämmen infiziert anzuzeigen. </li><li> Stellen die Photonen pro Mäusen oder alternativ die Ergebnisse als Mittelwert der Strahldichte (Photonen / sec / cm 2 / sr) eines ausgewählten Bereichs. </li><li> Die Messdaten von ROI (Region-of-Interest) in Photonen-Modus kann quantitativ über verschiedene verglichen werden, in vivo Imaging-Systeme mit unterschiedlichen kamra-Einstellungen, da die Messungen in Einheiten der Ausstrahlung automatisch die Kameraeinstellungen (zB Integrationszeit, Binning, f / Stop, und Feld) zu berücksichtigen. </li></ol>

<ol><li>Niederman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+management+of+adults+with+community-acquired+pneumonia.+Diagnosis%2C+assessment+of+severity%2C+antimicrobial+therapy%2C+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).</li>
<li>WHO, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+disease%3A+2004+update%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">The global burden of disease: 2004 update.</a> World Health Organization. , (2008).</li>
<li>Bogaert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+Staphylococcus+aureus+in+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children.</a> Lancet. 363, 1871-1872 (2004).</li>
<li>Gamez, G., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combat+pneumococcal+infections%3A+adhesins+as+candidates+for+protein-based+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development.</a> Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).</li>
<li>Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+pathophysiology+of+pneumococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).</li>
<li>Musher, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+contagious+are+common+respiratory+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">How contagious are common respiratory tract infections.</a> N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).</li>
<li>Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+escape+recombinants+emerge+after+pneumococcal+vaccination+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States.</a> PLoS Pathog. 3, (2007).</li>
<li>Munoz-Almagro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+invasive+pneumococcal+disease+caused+by+nonvaccine+serotypes+in+the+era+of+7-valent+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).</li>
<li>Whitney, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conjugate+pneumococcal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Infect.+Dis.+J%22%5BJournal%5D)">Impact of conjugate pneumococcal vaccines.</a> Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).</li>
<li>Whitney, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+invasive+pneumococcal+disease+after+the+introduction+of+protein-polysaccharide+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine.</a> N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).</li>
<li>Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+epidemiology+and+risk+factors%2C+evolution+of+antimicrobial+resistance%2C+and+impact+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pulm.+Med%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines.</a> Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).</li>
<li>Singleton, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+pneumococcal+disease+caused+by+nonvaccine+serotypes+among+Alaska+native+children+with+high+levels+of+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage.</a> JAMA. 297, 1784-1792 (2007).</li>
<li>Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+pneumonia%3A+mechanisms+of+infection+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution.</a> Chest. 142, 482-491 (2012).</li>
<li>Lieberman, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+identifies+candidate+pathogenicity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes.</a> Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).</li>
<li>Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bacterial+virulence+by+AraC-like+regulators+that+respond+to+chemical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals.</a> Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).</li>
<li>Young, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+dynamics+of+Staphylococcus+aureus+during+progression+from+carriage+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li>
<li>Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pneumococcal+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules+on+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization.</a> Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).</li>
<li>Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Streptococcus+pneumoniae+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system.</a> Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).</li>
<li>Paterson, G. K., Mitchell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+the+pneumococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and the pneumococcus.</a> Microbiology. 152, 285-293 (2006).</li>
<li>Gerber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+Streptococcus+pneumoniae+meningitis+mimicking+several+features+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease.</a> Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).</li>
<li>Gingles, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+genetic+resistance+in+invasive+pneumococcal+infection%3A+identification+and+study+of+susceptibility+and+resistance+in+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains.</a> Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).</li>
<li>Holmes, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pavA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+encodes+a+fibronectin-binding+protein+that+is+essential+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence.</a> Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).</li>
<li>Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+understandings+on+the+pathophysiology+of+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).</li>
<li>Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).</li>
<li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+glutamine+transporters+on+pneumococcal+fitness+under+infection-related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions.</a> Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).</li>
<li>Hermans, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+streptococcal+lipoprotein+rotamase+A+%28SlrA%29+is+a+functional+peptidyl-prolyl+isomerase+involved+in+pneumococcal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization.</a> J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).</li>
<li>Jensch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavB+is+a+surface-exposed+adhesin+of+Streptococcus+pneumoniae+contributing+to+nasopharyngeal+colonization+and+airways+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections.</a> Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).</li>
<li>Kadioglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+protein+PavA+is+important+for+nasopharyngeal+carriage+and+development+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis.</a> Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).</li>
<li>Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+contributions+of+pneumococcal+virulence+factors+to+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis.</a> J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).</li>
<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).</li>
<li>Basavanna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methionine+acquisition+and+synthesis+on+Streptococcus+pneumoniae+growth+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+central+carbon+metabolism+of+Streptococcus+pneumoniae+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling.</a> J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).</li>
<li>Hammerschmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+immune+regulator+factor+H+interacts+via+two+contact+sites+with+the+PspC+protein+of+Streptococcus+pneumoniae+and+mediates+adhesion+to+host+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells.</a> J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).</li>
<li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+disease+in+western+Europe%3A+burden+of+disease%2C+antibiotic+resistance+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li>
<li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Brehm,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Alle Versuche an Tieren durchgeführt haben, die von den lokalen Behörden und Ethikkommissionen genehmigt werden. Bei in vivo Experimenten ist die Infektion bakterielle Belastung in den verschiedenen Wirtsnischen der infizierten Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt. Unter diesen experimentellen Bedingungen die Tiere, die vor der Trennung der Bakterien aus dem Blut, des Nasopharynx, bronchoalvelar Spülung oder Organen wie der Lunge, Milz und Gehirn geopfert werden. Um die Anzahl de...

Infektionen der Atemwege, die durch Viren oder Bakterien verursacht weiterhin eine der häufigsten ambulant erworbenen oder klinische Probleme verursachen etwa ein Drittel aller weltweit Todesursache weltweit. Die wichtigsten Bakterienarten sind Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae 2. Allerdings sind diese Bakterienarten in der Regel übliche Bestandteile der natürlichen Atemwege Flora. Somit ist die bakterielle Schlitten auch gewisse Gefahr einer invasiven Erkrankung und je nach der Immunstatus oder Prädispositionen der Individuen. Die asymptomatischen Besiedlung auf invasive Infektionen ausgelöst. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Bei gesunden Personen S. pneumoniae (Pneumokokken) sind oft asymptomatisch und harmlos Kolonisatoren der oberen Atemwege, wo sie mit nicht-pathogener Bakterien gegender ansässigen Flora, sondern auch mit Erregern wie Haemophilus spp. oder Staphylococcus aureus und die erste Zeile des menschlichen Immunabwehr. Wagen am höchsten sind bei jungen Kindern (37%) und sogar noch höher im überfüllten Tagesstätten (58%) 3-5. Die jüngste Bevölkerung und ältere Menschen, Erhalt der Pneumokokken über Aerosol-Übertragung von Nasen-Rachen-Sekrete Träger und 6, gehören zu den Risikogruppen und die Impfung mit einem der Pneumokokken-Konjugat-Impfstoffe (PCV10 oder PCV13 bei Kindern und 23-valenten Polysaccharid PPSV23 bei Erwachsenen) ist in den Vereinigten Staaten (US) und vielen europäischen Ländern 4 empfohlen. Die PPSV23 deckt Serotypen für ~ 90% der Pneumokokken-Bakteriämie Krankheiten in den USA und Europa, so effizient verhindert invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) bei Erwachsenen verantwortlich, während die PCV decken die häufigsten Serotypen bei Kindern. Folglich durch Impfstoff-Typen (VT) sind IPD reduced aber nonvaccine Serotypen Anzeige eine hohe Virulenz Potenzial und die Antibiotika-Resistenz haben 4,7-12 entstanden. Der Nasenrachenraum als Reservoir ist der Ausgangspunkt für Pneumokokken zu den Nasennebenhöhlen oder Mittelohr Einleitung schädlicher lokaler Infektionen verbreiten. Noch wichtiger ist, Pneumokokken direkt über die Atemwege bis zu den Bronchien und der Lunge, was zu lebensbedrohlichen CAP 4,13 verbreiten. Lungenentzündungen sind oft mit Gewebe-und Barriere Zerstörung begleitet, so dass die Erreger in die Blut verbreitet und verursacht IPD. Inzidenz von GAP und IPD höchsten sind bei immungeschwächten Personen oder an den Extremen der Alters 4,13. Die für die Umwandlung von einem kommen auf einen Erreger mit hoher Virulenz verantwortlich Umstände sind noch immer umstritten. Doch neben Veränderungen in der Wirtsempfindlichkeit und evolutionäre Anpassung begleitet mit höheren Virulenz und die Zunahme der Antibiotika-Resistenzen wurden vorgeschlagen, um einen entscheidenden Einfluss auf pne habenumococcal Infektionen 14-16. Der Erreger ist mit einer Vielzahl von Adhäsine Vermittlung innigem Kontakt an Epithelzellen der Schleimhaut dotiert. Nach Überwindung der Atemwege Schleim, ist die Einhaltung Pneumokokken an Wirtszellen über direkte Interaktionen der Oberfläche exponierte Adhäsine mit zellulären Rezeptoren und durch die Nutzung extrazellulären Matrixkomponenten oder Serumproteine ​​als Brückenmoleküle 4,17,18 erleichtert. So vielseitig Erreger Pneumokokken sind auch mit Faktoren in Umgehung der Immunabwehr beteiligten Mechanismen ausgestattet. Darüber hinaus haben sie die Fähigkeit, sich an verschiedene Wirts Milieus wie der Lunge, Blut und Rückenmarksflüssigkeit (CSF), jeweils 5,17,19,20 anzupassen. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren auf die Pathogenese und entzündlichen Wirtsreaktionen in experimentellen Tiermodellen der Pneumonie, Bakteriämie sucht oder Meningitis 21-25. Obwohl er ein humanes Pathogen, wir sind diese Modellell-gegründet, um Pneumokokken Gewebetropismus, Virulenz Mechanismen oder Protektivität der Pneumokokken-Impfstoff-Kandidaten zu entziffern. Der genetische Hintergrund des Inzucht-Mausstämmen bestimmt die Empfindlichkeit gegen Pneumokokken. BALB / c-Mäuse intranasal mit Pneumokokken infiziert waren resistent zu sein, während CBA / Ca und SJL-Mäuse waren empfindlich gegen Pneumokokken-Infektionen 22. Dies impliziert, dass, ähnlich wie beim Menschen, den genetischen Hintergrund und die Abwehrmechanismen des Wirts zu bestimmen, das Ergebnis der Infektion. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, um den Widerstand Loci im Genom der Mäuse weniger anfällig für Pneumokokken-Infektionen zu entwirren. Die Ergebnisse wurden auf Veränderungen in vivo Virulenz Protokolle geführt. Anstelle der Inzucht BALB / c-Mäuse in der Vergangenheit oft verwendet, werden die sehr anfällig CD-1/MF1 outbred Mausstämme heutzutage oft verwendet, um die Wirkung von loss-of-function Pneumokokken Virulenz oder Fitness Faktoren 26-28 studieren. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeitbiolumineszierender Pneumokokken und optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht die Echtzeit-Biolumineszenz bioimaging von Infektionen. In Pneumokokken die optimierte luxABCDE Gen-Kassette (Plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) hat sich zu einem einzigen Integrationsstelle des Chromosoms durch Transposon-Mutagenese eingeführt worden ist. Biolumineszenz Pneumokokken wurden eingesetzt, um die Dämpfung des Pneumokokken-Mutanten in der Virulenz oder Fitness-Faktoren und ihre Translokation von einem zu einem anderen anatomischen Ort 26,28-31 mangelhaft zu beurteilen. Hier stellen wir ein Protokoll für die bioimaging der Pneumokokken-Infektionen in einem Maus-Pneumonie oder Sepsis-Modell. Amplifikation und Verbreitung von Biolumineszenz Pneumokokken in intranasal oder intraperitoneal infiziert Mäuse leicht mit der Zeit unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems und des gleichen Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet werden.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt Bouillon</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>X936.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>2363.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Blut-Agarplatten</td><td>Oxoid, Wesel, Deutschland</td><td>PB5039A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>T832.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>E6376</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>PAA Laboratories, Coelbe, Deutschland</td><td>A11-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD-1 Mäuse, Weibchen</td><td>Charles River, Sulzfeld, Deutschland</td><td>CD1SIFE06W08W</td><td>weibliche CD-1 Mäuse, sechs bis acht Wochen alt</td></tr><tr><td>Ketamin 500 mg, Curamed Injektionslösung</td><td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rompun 2%, Injektionslösung</td><td>Bayer Animal Health, Monheim, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 ml Spritzen</td><td>Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland</td><td>300015</td><td>sterile Luer-Lok Spritzen mit Nadel</td></tr><tr><td>Gel Loader Spitzen</td><td>PeqLab</td><td>81-13790</td><td>M&micro; ltiFlex Tips</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884-100mg</td><td>Hyaluronidase Typ IV-S aus Rindertest</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Air Liquide, D&uuml; Düsseldorf, Deutschland</td><td>M1001L50R2A001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; heim, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega, Mannheim, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligonukleotide&nbsp;</td><td>Eurofins MWG, Ebersberg, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qiaprep Spin Midiprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>27104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR-DNA-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>28106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image 4.1 Software</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XGI-8 Gasanästhesiesystem</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IVIS Spektrum-Bildgebungssystem&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biophotometer</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

nach der in echtzeit die auswirkungen der pneumokokken-virulenzfaktoren in einer akuten lungenentzündung maus-modells mit biolumineszenz-bakterien

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Lungenentzündung ist eine der wichtigsten Gesundheitsprobleme in Entwicklungsländern und Industrieländern und ist mit erheblichen Morbidität und Mortalität verbunden. Trotz der Fortschritte in Kenntnis dieser Krankheit, die Verfügbarkeit von Intensivstationen (ICU), und der Einsatz von potenten antimikrobielle Mittel und wirksame Impfstoffe, bleiben die Sterblichkeit hoch ein. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Dieser Erreger ist mit einem Arsenal von oberflächenexponierten Adhäsine und Virulenz Faktoren, die zu einer Lungenentzündung und invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) ausgestattet. Die Bewertung der in-vivo-Rolle von bakteriellen Virulenzfaktoren Fitness oder ist von größter Bedeutung, S. entwirren pneumoniae Pathogenität Mechanismen. Murine Modelle von Pneumonie, Bakteriämie, und Meningitis werden eingesetzt, um die Auswirkungen der Pneumokokken-Faktoren zu bestimmen, verschiedenen Stadien der Infektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Überwachung in Echtzeit Pneumokokken-Verbreitung in Mäusen nach intranasaler oder intraperitoneale Infektionen mit Biolumineszenz-Bakterien. Die Ergebnisse zeigen die Vermehrung und Verbreitung von Pneumokokken in die unteren Atemwege und Blut, die visualisiert und ausgewertet werden kann mit Hilfe eines Imaging-System und die dazugehörige Analyse-Software.

Der Erwerb und die Aufnahme von Methionin ist von zentraler Bedeutung für Pneumokokken zu Fitness in ihren Gast Nische 32,33 zu erhalten. Die Methionin-ABC-Transporter-Lipoprotein in D39 von der SPD _ 0151 Gen (TIGR4: sp_0149) codiert und nannte MetQ 32. Pneumokokken weiter produzieren Methionin-Biosynthese-Enzyme (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete und metF). Das Fehlen von Methionin in einem chemisch definierten Medium beeinflusst das Wachstum von P...

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Streptococcus-pneumoniae-Infektion in einem Mausmodell für Aurin-Pneumonie oder Sepsis in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem eine Infektionsdosis von Streptococcus pneumoniae nach Anzucht in dem komplexen Medium THY hergestellt wird. Der zweite Schritt ist die intranasale oder intraperitoneale Infektion von Mäusen mit Streptococcus pneumoniae.Der letzte Schritt ist die Quantifizierung der Biolumineszenzintensitäten der Mäuse oder eines ausgewählten Bereichs der Mäuse, um die Gesamtanzahl der emittierten Photonen zu ermitteln. Letztendlich zeigen die Biolumineszenzintensitäten einer Gruppe von Mäusen die Veränderungen der Infektion über die Zeit. Zusätzlich wird eine Analyse einzelner Bilder biolumineszierender Mäuse durchgeführt.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Bestimmung der bakteriellen Belastung in der Lunge oder in verschiedenen Geweben, liegt darin, dass man die Infektion bei nur einem Tier verfolgen kann. Die Bedeutung dieser Technik reicht in den Bereich der Grundlagenforschung, da sie auch zur Beurteilung der Wirksamkeit bakterieller Faktoren und von Antiinfektiva eingesetzt werden kann. Diese Methode kann Einblicke in diese Charge von Promo Cox bei Mäusen liefern.Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf die Bestimmung der bakteriellen Belastung in Organen. Im Allgemeinen wird es Forschern leichtfallen, diese Methode zu erlernen, da die Anwendung des Bioimaging-Systems einfach ist und Software zur Bildaufbereitung verfügbar ist. Unmittelbar nachdem ich mit dem Bioimaging-System vertraut gemacht wurde, hatte ich die Idee, diese Methode in Infektionsversuchen mit Bios und Primo Oxid anzuwenden.Die Durchführung dieser Methode ist entscheidend, da eine besondere Handhabung der Tiere erforderlich ist und kritische Schritte wie die Inokulation schwer zu erklären sind. Bereiten Sie zunächst einen Vorrat an infektiösen, biolumineszenten Pneumokokken gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Inokulieren Sie dann ein Reagenzglas, das 40 Milliliter THY-Medium mit zugesetztem FBS enthält, mit den Pneumokokken und beginnen Sie eine Kultur mit einem OD600 von 0,08. Inkubieren Sie die Pneumokokken ohne Schütteln bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid für drei bis vier Stunden, bis die Kultur ein OD600 von 0,35 bis 0,40 erreicht hat.Anschließend die Pneumokokken durch Zentrifugation bei 3.750 × g für sechs Minuten gewinnen. Dann den Überstand verwerfen und das bakterielle Pellet in etwa einem Milliliter PBS bei pH 7,4, ergänzt mit 0,5 % FBS, resuspendieren. Den Inokulum in einer Suspension aus 20 Mikrolitern PBS mit 10 % FBS und 90 Einheiten Hyaluronidase auf die gewünschte Konzentration einstellen.Schütteln oder vortexen Sie die Pneumokokken nicht, da dies die Autolyse auslöst. Verwenden Sie anschließend ein optisches Bildgebungssystem, um die Biolumineszenz der pneumokokkalen Oulu zu überprüfen. Betäuben Sie eine sieben bis zehn Wochen alte weibliche nicht-inzüchtige Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin. Überprüfen Sie die geeignete Tiefe der Anästhesie durch Zupinzen des Schwanzes.Wenn die Maus vollständig anästhesiert ist, halten Sie sie zwischen Finger und Daumen mit der Nase nach oben. Geben Sie dann mit einer Pipette mit langem, schmalem Ende jeweils 10 Mikroliter der biolumineszenten Pneumokokken auf jedes Nasenloch. Die Maus inhaliert die Bakterien unwillkürlich.Halten Sie die Maus ein bis zwei Minuten aufrecht, um zu beobachten, ob die Maus niest oder das Inokulum zurückhält. Fertig. Die Inhalation der Infektionsdosis muss sichergestellt sein, sodass die Maus die ausgewählte Infektionsdosis einatmet. Daher muss die Maus langsam und regelmäßig atmen.Vermeiden Sie, dass die Maus niest und Teile der Infektionsdosis verloren gehen. Nach erfolgreicher Inokulation die Schwanzmarkierung zur späteren Identifizierung vornehmen und die Maus in einen neuen Käfig setzen.Als Nächstes, um die Virulenz in einem Sepsis-Infektionsmodell zu beurteilen, injizieren Sie 100 Mikroliter eines Pneumokokkenstamms intraperitoneal in eine anästhesierte Maus. Nachdem Sie den Schwanz markiert haben, bringen Sie die Maus in einen Käfig zurück, um sie als Kontrolle zu verwenden. Injizieren Sie eine weitere Gruppe von Mäusen mit PBS zur Bildgebung.Die Detektion der Pneumokokken erfolgt mithilfe einer Bildanalyse-Software. Stellen Sie zuerst den Bildmodus auf lumineszent und danach die Bildparameter wie folgt ein. Stellen Sie die Belichtungszeit auf eine Minute ein.Ein mittlerer Binning-Grad und ein FOV von 22,5 Zentimetern. Betäuben Sie die Mäuse in der Anästhesiekammer der Bildgebungsausrüstung mit einer Mischung aus Iso, Fluor und Sauerstoff. Wenn die Mäuse langsam atmen, platzieren Sie sie in Rückenlage in der Bildgebungskammer, wobei ihre Nasen in Tuben eingeführt werden, die mit dem Anästhesiesystem verbunden sind.Um die CCD-Kamera auf der Oberseite der Kammer zu aktivieren und die biolumineszente optische Bildgebung zu starten, drücken Sie sofort „acquire“ in der Bildgebungssoftware. Ein Foto der Mäuse in der geschlossenen Kammer erscheint auf dem Bildschirm. Nach einer Minute Messdauer wird eine Überlagerung der Biolumineszenzdaten und des Fotos angezeigt.Beenden Sie die Anästhesie nun etwa 20 Sekunden vor dem Ende der Exposition. Stellen Sie die Mäuse zurück in ihren Käfig und lassen Sie sie die Anästhesie vollständig ausschlafen, bevor der Käfig in das Gestell zurückgestellt wird. Fahren Sie fort, die infizierten Mäuse zusätzlich zur Überwachung ihres Aussehens, Verhaltens und Gewichts alle acht bis zehn Stunden zu bildgebend untersuchen.Verwenden Sie abschließend die Bildanalyse-Software, um die Biolumineszenzintensitäten pro Zeitpunkt und Mausgruppe zu bestimmen, indem die gesamte Photonenemission der biolumineszenten optischen Bildgebung von Mäusen quantifiziert wird, die intranasal mit D 39 lux oder dem isogenen Mutanten D 39 luxe delta MET Q infiziert wurden. Die Bildgebung begann 24 Stunden nach der Infektion und wurde alle acht Stunden fortgesetzt, bis zum Tod oder bis 120 Stunden nach der Infektion in jeder Gruppe. Sieben von 10 Mäusen entwickelten schwere Krankheitszeichen und starben, während die anderen drei Mäuse keine Biolumineszenz zeigten und überlebten.Beachten Sie, dass die Biolumineszenz bei zwei der Mäuse tatsächlich eine Übersprühung von der intensiven Biolumineszenz benachbarter Mäuse ist. Mäuse, die erfolgreich mit dem biolumineszenten Wildtyp D 39 lux infiziert wurden, entwickelten 32 Stunden nach der Infektion eine schwere Lungeninfektion, die innerhalb von acht bis 16 Stunden zu einer Sepsis fortschritt. Alle Mäuse, die nach der Infektion mit D 39 lux eine Pneumonie und Sepsis entwickelten, waren bis 96 Stunden nach der Infektion verendet.Der Funktionsverlust des methioninbindenden Lipoproteins beeinträchtigte die Virulenz der Pneumokokken signifikant. Nach 32 Stunden zeigte nur eine mit dem mEq-Mutanten infizierte Maus eine schwache Lungeninfektion im Vergleich zu Infektionen bei allen empfänglichen D 39 lux-Mäusen. Nach 48 Stunden traten jedoch schwere Lungeninfektionen bei den mit dem Mutanten infizierten Mäusen deutlich hervor.Dadurch entwickelten diese Mäuse 72 Stunden nach der Infektion eine Sepsis und traten später als 72 Stunden nach der Infektion vermehrt auf, was zeigt, dass im akuten Pneumonie-Infektionsmodell der Mangel an met Q die Pneumokokken abschwächt. Die Werte der Biolumineszenzintensitäten der gruppierten Mäuse sind für die angegebenen Zeitpunkte dargestellt. Die Quantifizierung des biolumineszenten Flusses zeigte signifikante Unterschiede zwischen mit Wildtyp infizierten und mit met Q infizierten Mäusen 32 und 40 Stunden nach der Infektion.Daher führt der Funktionsverlust von met q zu einer Abschwächung der Pneumokokken und verursacht eine signifikante Verzögerung der invasiven Infektion, resultiert jedoch nicht in einer virulenten lint-Bakterienform, sobald diese überwunden ist. Diese Technik kann verwendet werden, um zehn Gruppen mit jeweils vier Mäusen innerhalb einer Stunde zu überwachen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die Luminenz vollständig ist und von den Mäusen inhaliert wird. Nach diesem Verfahren können auch andere Methoden wie Ko-Infektionen an Mäusen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich leichter Abschwächung und bakterieller Mutanten nach ihrer Entwicklung.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Infektionsbiologie, um pneumokokkale Pneumonie oder Sepsis bei Mäusen zu untersuchen und sichtbar zu machen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse infiziert und pneumokokkale Infektionen in Echtzeit mithilfe eines Bioimaging-Systems verfolgt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit humanpathogenen Bakterien wie *Streptococcus pneumoniae* gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Arbeiten unter einem Sicherheitswerkbank der Klasse zwei, während dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

following-real-time-impact-pneumococcal-virulence-factors-an-acute

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine gleichzeitige Infektion mit Influenza A-Virus ist einer der Faktoren bei der Induktion von invasiven Pneumokokken-Erkrankung bei asymptomatischen...

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Quelle: Valentine, M. E., et al. Generierung von In-Frame-Gendeletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Test auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Verwendung von Biolumineszenz, um das in vivo-Verhalten von virulenten und abgeschwächten Bakterienstämmen bei Mäusen zu visualisieren und zu vergleichen. Es beschreibt die Herstellung von biolumineszierenden Bakteriensuspensionen und deren intraperitoneale...

Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Eine Methode zur Feststellung von Lungeninfektionen bei immunkompetenten Nagetieren wird beschrieben. Mit Kompetenz kann diese Methode schnell und einfach durchgeführt werden, um eine stabile Infektion mit vielen Isolaten von S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae und A. baumannii zu induzieren.

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Hier beschreiben wir ein einfaches und reproduzierbares Protokoll des Mausmodells der Infektion, um die Dämpfung der genetisch veränderten Stämme von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zur von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Escherichia coli für kommerzielle Anwendungen zu bewerten.

Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Die Infektion von neonatalen Mäusen mit biolumineszierendem E. coli O1:K1:H7 führt zu einer septischen Infektion mit signifikanter Lungenentzündung und Lungenpathologie. Hier beschreiben wir Verfahren zur Modellierung und weiteren Untersuchung der neonatalen Sepsis unter Verwendung von längsinaler intravitaler Bildgebung parallel zur Aufzählung systemischer bakterieller Belastungen, entzündlicher Profilierung und Lungenhistopathologie.

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell für den Übergang von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitsverursachenden Erreger während einer Virusinfektion. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um polymikrobielle und Wirt-Pathogen-Interaktionen während der verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über verschiedene Wirte hinweg zu untersuchen.

Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Lernen Sie die biolumineszente Bildgebung zur Echtzeit-Überwachung von Streptococcus pneumoniae-Infektionen in einem akuten Lungenentzündungs-Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Virulenzfaktoren.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien (Video) | JoVE Journal

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Weitere Videos entdecken