ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, freistehende Nanofasern, Nanostrukturen und 2D-Matrizen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen durch oberflächeninitiierte Assemblierung zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst Polydimethylsoane oder PDMS-Stempel hergestellt werden, indem das PDMS-Prepolymer auf eine topographisch strukturierte Urform gegossen und ausgehärtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die ausgehärteten PDMS-Stempel auszuschneiden und mit einer Lösung zu beschichten, die die gewünschten Proteine der extrazellulären Matrix enthält.

Als nächstes werden die Stempel gewaschen, getrocknet und mit Mikrokontakt auf ein Poly-N-Iso-Propylacrylamid oder ein Rohr-PAM-beschichtetes Glasdeckglas gedruckt. Der letzte Schritt besteht darin, das Deckglas mit warmem, 40 Grad Celsius deionisiertem Wasser zu hydratisieren und die Reduktion der Lösung allmählich abkühlen zu lassen. Eine Temperatur unter etwa 32 Grad Celsius löst die Auflösung der thermisch empfindlichen Rohr-PAM-Schicht und die Freisetzung von zusammengesetzten Protein-Nanofasern oder Nanostrukturen aus.

Letztendlich sind die assemblierten Nanofasern und Nanostrukturen in Lösung, wie durch Phasenkontrast- und/oder Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wurde, freistehend und können in weiteren Anwendungen wie z.B. Tissue-Engineering-Gerüsten eingesetzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Gesichtstrennung oder Elektrospinnen ist die Möglichkeit, EZM-Protein-Nanofasern mit einer Technik zu entwickeln, die die Art und Weise, wie Zellen normalerweise ECM-Fasern in vivo aufbauen, wirklich nachahmt. Die oberflächeninitiierte Assemblierungstechnik hat eine Reihe einzigartiger Vorteile, darunter die Fähigkeit, die Proteinzusammensetzung, die Fasermorphologie und die Gerüstarchitektur zu kontrollieren.

Darüber hinaus können wir EZM-Protein-Nanofasern aus extrazellulären Matrixproteinen wie Faser-Nin-Laminat und Kollagen Typ 4 herstellen, was sich mit anderen Methoden als schwierig erwiesen hat. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, indem sie es Forschern ermöglicht, Konstrukte mit spezifischen und gut definierten physikalischen und chemischen Hinweisen zu entwickeln, um eine Vielzahl von Zellverhaltensweisen wie Adhäsion und Differenzierung zu steuern. Wenn Sie mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, sollten Sie daran denken, die Qualität Ihrer Stiele sowie die Wiedergabetreue der gedruckten Mikrokontaktmuster kontinuierlich zu überprüfen.

Dies ist unerlässlich, um eine ordnungsgemäße Assemblierung der ECM-Nanofasern und Nanostrukturen zu erreichen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie das Polydimethylsoan oder PDMS-Präpolymer vor, indem Sie die Elastomerbasis und das Härter in einem Verhältnis von 10 zu einem Gewichtsprozentsatz kombinieren, wobei typischerweise 80 Gramm Basis und acht Gramm Härter verwendet werden, um sicherzustellen, dass genügend PDMS vorhanden ist, um die Urform mit einer einen Zentimeter dicken Schichtmischung zu bedecken, und DGAs das PDMS mit einem Zentripetalmischer auf die folgende Mischung bei 2000 U/min für zwei Minuten, DGAs bei 2000 U/min für zwei Minuten. Arm genug.

PDMS prepolymer über die Urform zu einer einen Zentimeter dicken Schicht zu formen, hier das PDMS durch Einbrennen bei 65 Grad Celsius für vier Stunden. Schneiden Sie nach dem Aushärten mit einem Skalpell den Bereich mit dem Muster aus, um den PDMS-Stempel zu bilden. Zur Unterscheidung der Feature-Seite von der Rückseite des PDMS-Stempels.

Schneide eine Kerbe aus einer der Ecken auf der Rückseite des Stempels aus. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Glasabdeckgläser mit einem Durchmesser von 25 Millimetern reinigen, die Deckgläser eine Stunde lang in 95 % Ethanol beschallen und dann in einem 65 Grad Celsius heißen Ofen trocknen. Bereiten Sie anschließend die Poly- und Isopropylacrylamid- oder Piam-Lösung vor: Lösen Sie Piam in einem Butanol in einer Konzentration von 10 % auf. Zentrieren Sie eine saubere Glasabdeckung, schieben Sie sie auf das Vakuumfutter des Schleudergeräts und pipettieren Sie 200 Mikroliter der Rohr-Pam-Lösung auf die Glasoberfläche, um die Oberfläche vollständig zu bedecken.

Schleudern Sie den Deckglas eine Minute lang bei 6.000 U/min. Reinigen Sie die PDMS-Stempel durch Beschallung in 50 % Ethanol für 30 Minuten und trocknen Sie sie dann unter einem Stickstoffstrahl und alle nachfolgenden Schritte sollten in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität für Anwendungen zu erhalten, bei denen die extrazelluläre Matrix oder EZM-Nanostrukturen mit Zellen verwendet werden. Der Schritt des Mikrokontaktdrucks ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens.

Es ist wichtig, die PDMS-Stempel vor der Verwendung auf sichtbare Mängel zu überprüfen. Verwenden Sie auch keine Proteinlösung, die älter als zwei Wochen ist. Die PIAM-beschichtete Abdeckung wird in eine geschlossene Petrischale geschoben und mittels UV-Strahlung sterilisiert.

45 Minuten unter dem UV-Licht in einer Biosicherheitswerkbank sind ausreichend. Beschichten Sie die Musteroberfläche jedes PDMS-Stempels mit 200 Mikrolitern der Proteinlösung. Fibronektin oder FN wird hier in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter in sterilem destilliertem Wasser verwendet.

Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, nach einer Stunde die PDMS-Stempel und das destillierte Wasser waschen, um überschüssiges Protein zu entfernen, und gründlich unter einem Stickstoffstrahl trocknen. Es ist wichtig, das Wasser vollständig zu entfernen, um eine vorzeitige Auflösung des Rohres zu vermeiden. Pam-Beschichtung auf dem Deckglas und unsachgemäßer Proteintransfer.

Führen Sie einen Mikrokontaktdruck durch, indem Sie bei Bedarf die Merkmalsseite des PDMS-Stempels in Kontakt mit dem Rohr-PAM-beschichteten Deckglas bringen. Klopfen Sie mit einer Pinzette leicht auf die Rückseite der Stempel, um Luftblasen zu entfernen und nach fünf Minuten einen gleichmäßigen Kontakt zu gewährleisten. Ziehen Sie den PDMS-Stempel vom Deckglas ab.

In dieser Phase. Je nach Studie können zusätzliche EZM-Proteine strukturiert werden, um komplexere und mehrkomponentige Strukturen zu erzeugen. Sobald das ECM-Muster gedruckt wurde, legen Sie das gemusterte Rohr-PAM-beschichtete Deckglas in eine 35-Millimeter-Petrischale und überprüfen Sie die Mustertreue mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie.

Je nach Muster kann eine CCD-Kamera erforderlich sein, um die Merkmale des Musters aufzulösen. Auch die Fluoreszenzmikroskopie kann zur Untersuchung des Musters eingesetzt werden, sofern die EZM-Proteine fluoreszenzmarkiert sind. Nachdem Sie die Mustertreue überprüft haben, geben Sie drei Milliliter 40 Grad Celsius destilliertes Wasser in die Petrischale und lassen Sie das Wasser allmählich abkühlen, bis sich das Rohr

Die PAM-Schicht und die Freisetzung der ECM-Proteinmuster können mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht werden. Um sicherzustellen, dass die Nanostrukturen des ECM-Proteins freigesetzt wurden, wird das Wasser in der Regel auf Raumtemperatur abgekühlt, die weit unter der unteren kritischen Lösungstemperatur von Rohr, Pam, liegt, die 32 Grad Celsius beträgt. Wenn die Anwendung den Einsatz optischer Techniken nicht zulässt, kann die Freisetzung durch Messung der Lösungstemperatur überwacht werden.

Nanofasern und andere Nanostrukturen werden nach dem Lösen der Rohr-PAM-Schicht im Wasser schwimmen. Für weitere Anwendungen müssen die Nanogewebe und andere Nanostrukturen manipuliert werden, aber der genaue Ansatz hängt vom experimentellen Ziel ab. Repräsentative Ergebnisse werden hier vorgestellt, um zu zeigen, dass die oberflächeninitiierte Assemblierung oder SIA in der Lage ist, ECM-Protein-Nanofasern mit präziser Kontrolle über die Faserabmessungen zu entwickeln.

Ein Array von Fibronektin-Rechtecken, 50 Mikrometer lang und 20 Mikrometer breit, wurde auf ein Piam-beschichtetes Deckglas aufgebracht, dem 40 Grad Celsius kaltes Wasser zugesetzt und anschließend unter die untere kritische Lösung abgekühlt wurde. Die Temperatur von Piam löste die Auflösung von Piam und die Freisetzung der Fibroin-Nanofasern bei der Freisetzung aus. Die Fasern zogen sich zusammen, weil sie unter einer inhärenten Vorspannung standen.

Bei der Strukturierung auf der Piam-Oberfläche ergab die Alice-Analyse der Abmessungen der Fibronektin-Nanofasern vor der Veröffentlichung, dass sie monodispers waren, mit einer durchschnittlichen Länge von 50,19 plus oder minus 0,49 Mikrometern und einer durchschnittlichen Breite von 19,98 plus oder minus 0,17 Mikrometern. Bei der Freisetzung zogen sich die Nanofasern merklich zusammen, blieben aber monodispers mit einer durchschnittlichen Länge von 14,15 plus oder minus 0,92 Mikrometern und einer durchschnittlichen Breite von 2,65 plus oder minus 0,32 Mikrometern. Die Rasterkraftmikroskopie lieferte eine höher aufgelöste Perspektive der Faserdimensionsänderungen, die mit dem SIA-Freigabeprozess verbunden sind.

Bemerkenswert ist, dass Fasern vor der Freisetzung eine einheitliche Dicke von etwa fünf Nanometern aufwiesen, während Fasern nach der Freisetzung eine Dicke in der Größenordnung von mehreren hundert Nanometern aufwiesen, während die Länge und Breite abnahm. Mit dem SIA-Verfahren ist es möglich, eine Vielzahl von EZM-Protein-Nanostrukturen mit einstellbarer Größe, Form und Zusammensetzung herzustellen. So wurden beispielsweise Fibronektin-Nanofasern, die zunächst 20 Mikrometer breit und einen Zentimeter lang waren, auf ein Rohr gemustert.

PAM-beschichteter Deckslip beim Abkühlen und Rohr. Bei der Pam-Auflösung wurden die Nanofasern freigesetzt, die lange Fäden mit einer reduzierten Breite von etwa drei Mikrometern bildeten. Da das Muster durch die Oberflächentopographie des PDMS-Stempels definiert wird, der für den Mikrokontaktdruck verwendet wird, ist es außerdem möglich, komplexe ECM-Protein-Nanostrukturen als Machbarkeitsnachweis zu entwickeln.

Es entstanden mehrarmige Fibroinsterne. Die thermische Freisetzung führte zu einer Kontraktion der Arme, nicht aber der zentralen Region des Sterns, wo die Arme miteinander verbunden waren. SIA funktioniert auch mit anderen EZM-Proteinen wie Laminat oder LN, und mehrere EZM-Proteine können in dieselbe Struktur eingebaut werden.

In diesem Beispiel wurden orthogonal miteinander verbundene, 20 Mikrometer breite Linien von Fibronektin, dargestellt in Rot, und 50 Mikrometer breite Linien von Laminin, dargestellt in Grün, die in ein 2D-Nanogewebe integriert waren, gemustert und dann bei der Freisetzung freigesetzt, beide Arten von Nanofasern zogen sich zusammen, aber die Gesamtvernetzung und die quadratische Gitterstruktur blieben erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass SIA verwendet werden kann, um ECM-Materialien mit einer Vielzahl von Zusammensetzungen und Strukturen zu entwickeln. Zuletzt werden einige Fälle von fehlgeschlagener SIA von ECM-Nanofasern gezeigt.

Eine Ursache ist die unsachgemäße Freisetzung eines unvollständigen Musters aufgrund einer schlechten Übertragung des EZM-Proteins auf die Piam-Oberfläche. Beim Mikrokontaktdruck entstehen durch das Vorhandensein von Löchern, unregelmäßigen Kanten und anderen Defekten Nanofasern und Nanostrukturen, die unvollständig und anfällig für Bruch und Fragmentierung bei der Freisetzung sind. Die schnelle Auflösung von Rohr-PAM kann auch zu einer schlechten Mustertreue nach der Freigabe führen.

Zum Beispiel mit 20 Grad Celsius Wasser, einer Temperatur, die bereits unter der unteren kritischen Lösung liegt. Die Temperatur des Piam führt dazu, dass der Piam schnell aufquillt und sich auflöst. Dies kann dazu führen, dass die Nanofasern zurückschnappen und brechen, wie im 32. Bild dargestellt, und zufällige, unorganisierte Konfigurationen bilden, wie im 52. zweiten Bild dargestellt.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, wird der Zustand des PDMS auf Defekte überprüft und es ist sicherzustellen, dass alle Oberflächen frei von Staub sind. Andernfalls verhindert es einen ordnungsgemäßen Proteintransfer und führt zu einer schlechten Assemblierung der A-CM-Strukturen. Nach diesem Verfahren können die freigesetzten Nanofasern oder Nanostrukturen verwendet werden, um eine Reihe von Dingen zu tun, z. B. um die mechanischen Eigenschaften der Proteinfasern zu analysieren, oder als Gerüste für das Tissue Engineering verwendet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen mit abstimmbarer Zusammensetzung, Geometrie und Architektur entwickelt. Insbesondere sollen Sie verstehen, wie man Mikrokontaktdruckmuster von ECM-Proteinen auf pythonbeschichtete Glasdeckscheiben aufträgt und dann die Auflösung der Oberfläche thermisch auslöst, um die ECM-Strukturen zusammenzusetzen.