Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Musterzellen auf einer elastischen Membran aus Polydimethylsiloxan oder PDMS zu dehnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine PDMS-Schicht hergestellt und anschließend ein Mikromuster auf das PDMS aufgebracht wird. Die mikrostrukturierte PDMS-Schicht wird dann auf die Dehneinrichtung montiert, und ein Medium-haltender Pool wird darauf platziert.

Anschließend werden die Zellen auf die Oberfläche des mikrostrukturierten PDMS-Blattes aufgebracht und an das Muster anhaften lassen, bevor nicht angeheftete Zellen durch Spülen entfernt werden. Im letzten Schritt wird eine Dehnung auf das zellhaltige PDMS ausgeübt, um die Zellen zu strecken. Letztendlich wird mittels Videomikroskopie gezeigt, dass die Anwendung von Kräften auf die Retraktionsfasern mitotischer Säugetierzellen während der Zellstreckung zu einer Verformung der Zelle führt.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Biomechanik beantworten, beispielsweise welche Auswirkungen äußere Kräfte auf zelluläre Prozesse wie die Teilung haben. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir Kräfte auf eine sich teilende Zelle ausüben wollten, um damit zu beginnen, ein Stück PDMS in einer Größe von etwa 35 mal 20 Millimetern aus einem vorgefertigten Blatt auszuschneiden. Hier wird ein handelsübliches dünnes PDMS-Blatt verwendet, da es reproduzierbarer ist und im Vergleich zu selbst hergestelltem PDMS weniger leicht bricht.

Entfernen Sie die oberen und unteren Schutzschichten aus Kunststoff und verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS in eine Kunststoff-Petri-Schale zu legen. Waschen Sie anschließend das PDMS fünf Minuten lang mit 70 % Ethanol auf einem Rotator bei 30 Oszillationen pro Minute. Nach dem Waschen trocknen Sie die Oberfläche, indem Sie Luft darüber strömen lassen.

Beleuchten Sie anschließend das PDMS fünf Minuten lang mit tieffrequenter ultravioletter Strahlung aus einem Abstand von etwa fünf Zentimetern zu den UV-Lampen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine E-D-C-N-H-S-Lösung gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Die Lösung muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden, da ihre Reaktivität innerhalb weniger Stunden abnimmt.

Überführen Sie die PDMS-Blätter von der Petrischale auf den Deckel der Petrischale, der nicht beleuchtet wurde. Dadurch wird sichergestellt, dass die Umgebung des PDMS stark hydrophob ist und den nächsten Schritt erleichtert.

Pipettieren Sie die E-D-C-N-H-S-Lösung auf das PDMS und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation spülen Sie überschüssiges E-D-C-N-H-S mit Wasser ab.

Fügen Sie anschließend die Lösung aus PLL-gepfropftem PEG hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation spülen Sie überschüssiges PLL-gepfropftes PEG mit Wasser von dem PDMS ab. Das PDMS ist nun mit PLL-gepfropftem PEG passiviert oder funktionalisiert und kann mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um das PDMS zu strukturieren, legen Sie ein PDMS-Blatt auf eine synthetische Quarz-Fotomaske, die die mikrostrukturierten Merkmale für die Strukturierung trägt.

Platzieren Sie die PDMS-Seite mit der PLL-gepfropften PEG-Oberfläche der Chromseite der Fotomaske gegenüber. Belichten Sie anschließend sieben Minuten lang durch die Fotomaske aus einem Abstand von etwa fünf Zentimetern zu den UV-Lampen. Nach der Belichtung.

Wasser auf die Maske und das PDMS geben und das PDMS dann langsam von der Maske abziehen. Das zuvor passivierte PDMS auf der Dehvorrichtung befestigen. Eine Seite des PDMS am festen Teil des Dehngeräts befestigen. Die andere Seite am beweglichen Teil des Dehngeräts fixieren, wobei nicht zu viel vom PDMS-Blatt eingespannt wird.

Wenn das PDMS zu stark geklemmt wird, wird es kürzer, und dies kann zu einem Bruch führen, da die Spannung bei gleicher Dehnungsstrecke größer ist. Achten Sie darauf, dass die Schrauben gut angezogen sind, da sonst das PDMS-Blatt verrutschen wird, sobald die Dehnung beginnt oder später im Verlauf des Experiments. Anschließend inkubieren Sie das PDMS eine Stunde lang mit Fibronectin-Lösung.

Bei Raumtemperatur können andere extrazelluläre Matrixproteine verwendet werden, diese wurden jedoch nicht mit diesem Protokoll getestet. Als letzten Schritt spülen Sie das PDMS mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung ab. Schneiden Sie anschließend ein Rechteck aus PDMS aus einer dicken PDMS-Scheibe aus.

Schneiden Sie dann ein weiteres Rechteck nach innen ein. Um einen Behälter zu erhalten, der die Zellen und das Medium hält, geben Sie Silikonfett unter diesen rechteckigen PDMS-Ausschnitt und platzieren Sie ihn auf dem PDMS-Blatt, um einen mediumhaltenden Behälter zu erzeugen. Das Fett ermöglicht das Gleiten des Behälters über das PDMS-Blatt während der Dehnung, um die Zellen zu mustern.

Zunächst lösen Sie die Zellen aus einem Kulturgefäß bei 50 % Konfluenz ab. Sobald sich die Zellen in Suspension befinden, pipettieren Sie sie mehrmals mit einer 200-Mikroliter-Spitze, um Aggregate aufzubrechen, wodurch sichergestellt wird, dass einzelne Zellen an das Muster binden. Fügen Sie anschließend ein Milliliter der Zellsuspension in das Reservoir hinzu.

Lassen Sie die Zellen je nach Zelltyp 10 bis 30 Minuten lang an die Muster binden. Typischerweise erfolgt dies in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Sobald die Zellen an den Mustern angeheftet sind, spülen Sie die nicht angehefteten Zellen vorsichtig mit equilibriertem Medium ab.

Entfernen Sie das Medium mit einer aspirierenden Pipette, während Sie gleichzeitig frisches Medium hinzufügen. Es ist entscheidend, einen ausreichenden Durchfluss aufrechtzuerhalten, um nicht angeheftete Zellen wegzuspülen, und gleichzeitig sicherzustellen, dass die Zellen stets im Medium eingetaucht bleiben. Anschließend legen Sie eine Deckglasplatte auf die Flüssigkeitsoberfläche, um Verdunstung und Mediumaustritt zu verhindern, falls das PDMS reißt, und lassen Sie die Zellen einige Stunden lang auf den Mustern ausbreiten.

Platzieren Sie anschließend das Gerät auf einem umgekehrten Mikroskop und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Verwenden Sie keine Öl-Immersion-Objektive, da diese aufgrund von Fokussierungsproblemen nicht funktionieren. Um die mikrostrukturierten Zellen zu dehnen, drehen Sie die Feinmessschraube, während Sie die Stufenposition in den X-, Y- und Z-Achsen korrigieren.

Die Stellung des Objekttisches muss korrigiert werden, um die Verbreiterung des PDMS und den Verlust der Fokussierung auszugleichen. Die in diesem Video-Protokoll vorgestellte Technik ermöglichte die Anwendung von Kräften auf die Retraktionsfasern mitotischer Säugetierzellen, indem das Substrat zu Beginn der Metaphase gedehnt wurde. Einige dieser Retraktionsfasern wurden vom Zellkörper weggezogen, wodurch eine mechanische Kraft auf die Zellkortex der mitotischen Zelle vor der Dehnung ausgeübt wurde; zu diesem Zweck wird die Zelle auf ein ovales Muster aufgebracht.

Die Musterung erfolgt, indem das PDMS während des Abdrucks runder Muster durch die Fotomaske gedehnt wird. Nach dem Dehnen wird das Substrat so weit gestreckt, dass das Muster kreisförmig wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Zellen auf makroskopischen Mustern kultivieren und anschließend Dehnungskräfte auf das Substrat ausüben können.