Name: Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Lernen Sie die Methode zur Dehnung von Zellen auf mikrostrukturierten PDMS-Membranen für Zellbiologie und Biomechanik. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte mechanische Stimulation von Zellen zur Untersuchung ihrer Reaktion auf externe Kräfte.

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Diese Arbeit wurde vom Institut Curie, Paris, Frankreich gegründet. Die mechanische Bahre wurde von Damien Cuvelier (Institut Curie) entworfen und wird von GREM hergestellt (mecanique-grem.com). Die Strukturierung auf PDMS wurde von Ammar Azioune (Bordeaux II University) entwickelt.

1. Passivierung der PDMS <ol><li> Ein Stück des PDMS ca. 35 mm x 20 mm aus einer bereits geformten Folie (zum Beispiel GelPak, wie in der Tabelle aufgeführten Materialien). </li><li> Entfernen Sie die obere und die untere Schutzschichten aus Kunststoff (falls erforderlich) und mit Hilfe einer Pinzette, um die PDMS in einer Kunststoff legen (nicht zellkulturbehandelte) Petrischale. </li><li> Waschen Sie die PDMS mit 70% Ethanol für 5 Minuten auf einem Schüttler bei 30 Schwingungen / min. </li><li> Trocknen Sie die Oberfläche durch strömende Luft auf sie. </li><li> Illuminate mit tiefen UV (λ = 180 nm) für 5 min bei einem Abstand von den UV-Lampen von etwa 5 cm (siehe Materialien Blatt für Lampe Referenz; Parameter für verschiedene Lampen variieren). </li><li> Planen 200 ul EDC / NHS-Lösung für jedes Stück PDMS (muss unmittelbar vor der Verwendung hergestellt, da die Reaktivität der Lösung zerfällt in wenigen Stunden werden). Für 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl-Puffer bei pH 6,0, fügen 11,5 mg Sulfo-NHS und 19,2 mg EDC. </li><li> Übertragen Sie diePDMS Blätter von der Petrischale mit dem Deckel der Petrischale, die nicht belichtet worden ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Umgebung des PDMS sind sehr hydrophob und ermöglichen den nächsten Schritt. </li><li> In EDC / NHS-Lösung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen EDC / NHS mit Wasser. </li><li> Hinzufügen PLL-g-PEG-Lösung (0,5 mg / ml in 10 mM HEPES pH 8.6) und Inkubation von 3 h bis über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die PLL-g-PEG mit Wasser. Passi PDMS (mit PLL-g-PEG funktionalisiert) kann für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden </li></ol> 2. Strukturieren der PDMS <ol><li> Nehmen Sie ein PDMS Blatt und legen Sie es auf einem synthetischen Quarzphotomaske tragen die Mikroformen zur Strukturierung (siehe Abbildung 1). Legen Sie die PDMS seitigen Lager die PLL-g-PEG mit Blick auf den Chrom Seite der Photomaske. </li><li> Beleuchten 7 Minuten durch die Photomaske in einem Abstand von der UV-Lampen von etwa 5 cm.</li><li> Fügen Sie Wasser auf die Maske + PDMS und schälen Sie die PDMS langsam aus der Maske. </li><li> Inkubieren mit Fibronectin-Lösung bei 50 mg / ml in HEPES-Puffer bei pH 8,6 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Es ist möglich, andere ECM-Proteine ​​zu verwenden, aber diese sind nicht mit diesem Protokoll getestet. </li><li> Spülen mit PBS. </li></ol> 3. Das Gerät montieren <ol><li> Montieren Sie die zuvor passivierten PDMS auf die Spannvorrichtung (siehe Diskussion zur Fehlersuche). <ol><li> Befestigen einer Seite des PDMS zu dem feststehenden Teil der Trage. </li><li> Befestigen Sie die andere Seite mit dem Mobilteil der Trage ohne Spann zu viel von der PDMS Blatt. </li></ol></li><li> Schneiden Sie ein Rechteck von PDMS (22 mm x 19 mm) in einer dicken PDMS Stich-und Schnitt ein weiteres Rechteck im Inneren, um einen Pool (oder Rahmen) haben, die die Zellen-und Medien behalten werden (siehe Abbildung 2). </li><li> In Silikonfett unter diese PDMS Pool und legen Sie es auf der PDMS-Blatt zu erstellen med.ium Haltebecken. Das Fett wird die Gleitfähigkeit des Pools über das PDMS Blatt beim Strecken zu ermöglichen. </li></ol> 4. Strukturieren der Zellen <ol><li> Lösen Sie die Zellen aus einer 50% Konfluenz Kulturflasche mit Versene. </li><li> Zähle die Zellen zu resuspendieren und diese in einer Konzentration von 200.000 Zellen / ml. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in den Pool (siehe Diskussion für weitere Details). </li><li> Sei (je nach Zelltyp, RPE-1-Zellen werden 10 min und HeLa-Zellen 20 min dauern) die Zellen zu binden, um die Muster für 10-30 min. </li><li> Vorsichtig spülen Sie die schwimmenden Zellen mit ins Gleichgewicht Medium (ins Gleichgewicht mittel Inkubator). </li><li> Lassen Sie die Zellen verteilt für ein paar Stunden auf die Muster (RPE-1 ist mindestens 2 Stunden brauchen, HeLa-Zellen wird 3 Stunden brauchen). </li><li> Fügen Sie ein Deckglas auf den Pool, um Verdunstung und mittlere Leckage bei der PDMS Pausen zu vermeiden. </li><li> Legen Sie das Gerät auf einem inversen Mikroskop und starten Bildgebung. Vermeiden Sie die Verwendung von Ölimmersion objectives, da es nicht durch Fokussierung Probleme funktionieren. </li></ol> 5. Dehnung <ol><li> Die Mikrometerschraube drehen, während die Korrektur der Tischposition in x-, y-und z-Achse (hauptsächlich x). Die Bühnenposition muss korrigiert, die Erweiterung des PDMS und den Verlust des Fokus entgegenzuwirken. (Siehe &quot;Bei der Strecke&quot; Absatz in der Diskussion). </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Obwohl diese Technik wurde mehrfach verwendet und wird gründlich getestet, gibt es mehrere kritische Schritte, die zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen kann. Über die PDMS: Für diese Arbeit GelPak ein handelsüblicher Dünn PDMS Blatt, verwendet. Alternativ PDMS Blätter können direkt von PDMS-Mischung gegossen werden. Wir empfehlen die Verwendung GelPak, weil es mehr reproduzierbar, und ist weniger wahrscheinlich zu brechen Vergleich zu maßgeschneiderten PDMS. ...

Die Zellen Zusammensetzen eines Gewebe in höheren Organismen unterliegen mechanischen Spannungen und Dehnungskräfte kommen entweder von der äußeren Umgebung oder von umgebenden Zellen 1,2. Die Zellen müssen sich anzupassen und zu widerstehen, diese Kräfte, um die Gewebeintegrität aufrecht zu erhalten. Solche Kräfte sind auch für Gewebe-Morphogenese während der Entwicklung 3,4. Anwenden von mechanischen Kräften auf kultivierte Zellen ist ein Weg, zu imitieren, was in einem Gewebe passieren könnte, aber mit einer quantitativen und unabhängige Steuerung der Zellform und Zellverformung 5,6. Hierzu könnten verschiedene Techniken verwendet werden. Man kann auf die Zellen (die ganze Zelle oder einen Teil davon), beispielsweise mit AFM oder Derivate 7,8 oder strecken das Substrat die Zellen wachsen auf zu drücken. Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren zeigt, wie ein Flugzeug Substrat mit Zellen plattiert dehnen. Auf m Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um beurteilen die Rolle der Streitkräfte ausgeübtitotic Säugetierzellen 9. Mitotische Zellen bleiben mit dem Substrat verbunden, durch Zurückziehen und Strecken der Fasern Membran ausgeübt wird, eine Kraft auf jene Fasern, die wiederum provozierte die Rotation der mitotischen Spindel. Das Interesse der Kombination von Klebstoff und Mikro Recken um eine unabhängige Steuerung von Kräften und Form der einzelnen Zellen zu erreichen. Es ist beispielsweise möglich, eine eiförmige Zelle in eine perfekt runde Form isotropen strecken, während einachsige Dehnung angewendet wird. Wenn die Zellen nicht auf Mikro geflochten, uniaxiales Strecken Ergebnisse in Zellstreckung, wobei die meisten Zellen, die ein mit dem Streckachse ausgerichtet langen Achse. Es ist dann schwierig, den Effekt der Ausrichtung der langen Achse und der Wirkung der Ausdehnung auf die Zellen zu trennen. Das Gerät eignet sich für alle lebenden Zellen, einschließlich Langzeitablauf Fluoreszenz-Mikroskopie, und Medikamente können während des Experiments hinzugefügt werden. Die tiefe Mikrostrukturierungsverfahren 10 UVswurde im Detail in Azioune et al. 11 Musterung auf PDMS wurde beschrieben in Azioune et al. 12 Die vorliegende Streck Protokoll ist ein Video-Version Carpi et al. 13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>Verschiedene Dicken/Klebrigkeiten sind erhältlich. Eine Alternative könnte darin bestehen, Ihr PDMS zu casten&nbsp; dich.</td></tr><tr><td>Silikonfett</td><td>GE Bayer Silikone</td><td>Baysilone-Paste</td><td>Dies ist biokompatibel</td></tr><tr><td>Dehnungsgerät</td><td>GREM m&eacute; canique</td><td>Stretcher 2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimidhydrochlorid)</td><td>Sigma</td><td>3450</td><td>Stabil 6 Monate bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>Vor Feuchtigkeit schützen</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td><td>SurfaceSolutions (Zürich)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Synthetische Quarz-Photomaske</td><td>Toppan</td><td></td><td>Nehmen Sie die binäre Standard-Fotomaske in</td></tr><tr><td>Quarz-Fibronektin aus Rinderplasma</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

stretching-cells auf einer mikrostrukturierten pdms-membran

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanische Kräfte auf Zellen ausgeübt und / oder Gewebe spielen eine wichtige Rolle in zahlreichen Prozessen. Wir haben ein Gerät an Zellen auf einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membran, mit bildgebenden kompatibel vernickelt strecken entwickelt. Dieses Verfahren ist reproduzierbar und vielseitig. Die PDMS-Membran, um Zellen oder Gewebe zu einem bestimmten Geometrie beschränken mikrostrukturiert werden. Der erste Schritt ist die Mikrostrukturen auf den PDMS-Membran mit einem tiefen UV-Technik gedruckt. Die PDMS-Membran wird dann auf einer mechanischen Trage befestigt. Eine Kammer ist auf der Oberseite der Membran mit biokompatiblen Fett damit Gleiten während der Strecke gebunden. Die Zellen werden ausgesät und für mehrere Stunden auf den Mikro verbreiten. Die Probe kann mehrere Male unter Verwendung einer Mikrometerschraube gespannt und ungestreckte werden. Es dauert weniger als eine Minute, um die Strecke in vollem Umfang (rund 30%) anzuwenden. Die hier vorgestellte Technik nicht eine motorisierte Vorrichtung, die für eine erforderliche umfassenpplying wiederholter Dehnungszyklen schnell und / oder Computer-kontrolliertes Recken, aber dies kann realisiert werden. Dehnen von Zellen oder Gewebe kann von Interesse für die Fragen, um die Zellkräfte, Zell-Antwort gegen mechanische Beanspruchung oder Gewebemorphogenese bezogen werden. Diese Video-Präsentation wird zeigen, wie die typischen Probleme, die, wenn Sie diese Art von scheinbar einfachen Experiment entstehen könnten.

<html> Die in diesem Video-Protokoll vorgestellte Technik erlaubt die Anwendung von Kräften auf die Rückzugs Fasern mitotischer Säugerzellen. In der Tat, während der Zellteilung, bei der mitotischen Phase, Säugetierzellen zurückziehen, um die Form einer Kugel nehmen und hinterlassen dünnen Aktin-Kabel von Membran umgeben, die auf dem Substrat befestigt sind. Diese Kabel (Rückzug Fasern), sind die Erinnerung an die Zellgeometrie, bevor er in Division. Machen Mikro mit tiefen UV durch eine Photomaske auf PDMS Dünnschicht <...

Dieses Manuskript stellt eine Technik, um auf adhärenten Zellen oder Gewebe gelten oder freiKräfte mit unidirektionalen Stretching.

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Musterzellen auf einer elastischen Membran aus Polydimethylsiloxan oder PDMS zu dehnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine PDMS-Schicht hergestellt und anschließend ein Mikromuster auf das PDMS aufgebracht wird. Die mikrostrukturierte PDMS-Schicht wird dann auf die Dehneinrichtung montiert, und ein Medium-haltender Pool wird darauf platziert.Anschließend werden die Zellen auf die Oberfläche des mikrostrukturierten PDMS-Blattes aufgebracht und an das Muster anhaften lassen, bevor nicht angeheftete Zellen durch Spülen entfernt werden. Im letzten Schritt wird eine Dehnung auf das zellhaltige PDMS ausgeübt, um die Zellen zu strecken. Letztendlich wird mittels Videomikroskopie gezeigt, dass die Anwendung von Kräften auf die Retraktionsfasern mitotischer Säugetierzellen während der Zellstreckung zu einer Verformung der Zelle führt.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Biomechanik beantworten, beispielsweise welche Auswirkungen äußere Kräfte auf zelluläre Prozesse wie die Teilung haben. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir Kräfte auf eine sich teilende Zelle ausüben wollten, um damit zu beginnen, ein Stück PDMS in einer Größe von etwa 35 mal 20 Millimetern aus einem vorgefertigten Blatt auszuschneiden. Hier wird ein handelsübliches dünnes PDMS-Blatt verwendet, da es reproduzierbarer ist und im Vergleich zu selbst hergestelltem PDMS weniger leicht bricht.Entfernen Sie die oberen und unteren Schutzschichten aus Kunststoff und verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS in eine Kunststoff-Petri-Schale zu legen. Waschen Sie anschließend das PDMS fünf Minuten lang mit 70 % Ethanol auf einem Rotator bei 30 Oszillationen pro Minute. Nach dem Waschen trocknen Sie die Oberfläche, indem Sie Luft darüber strömen lassen.Beleuchten Sie anschließend das PDMS fünf Minuten lang mit tieffrequenter ultravioletter Strahlung aus einem Abstand von etwa fünf Zentimetern zu den UV-Lampen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine E-D-C-N-H-S-Lösung gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Die Lösung muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden, da ihre Reaktivität innerhalb weniger Stunden abnimmt.Überführen Sie die PDMS-Blätter von der Petrischale auf den Deckel der Petrischale, der nicht beleuchtet wurde. Dadurch wird sichergestellt, dass die Umgebung des PDMS stark hydrophob ist und den nächsten Schritt erleichtert.Pipettieren Sie die E-D-C-N-H-S-Lösung auf das PDMS und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation spülen Sie überschüssiges E-D-C-N-H-S mit Wasser ab.Fügen Sie anschließend die Lösung aus PLL-gepfropftem PEG hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation spülen Sie überschüssiges PLL-gepfropftes PEG mit Wasser von dem PDMS ab. Das PDMS ist nun mit PLL-gepfropftem PEG passiviert oder funktionalisiert und kann mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um das PDMS zu strukturieren, legen Sie ein PDMS-Blatt auf eine synthetische Quarz-Fotomaske, die die mikrostrukturierten Merkmale für die Strukturierung trägt.Platzieren Sie die PDMS-Seite mit der PLL-gepfropften PEG-Oberfläche der Chromseite der Fotomaske gegenüber. Belichten Sie anschließend sieben Minuten lang durch die Fotomaske aus einem Abstand von etwa fünf Zentimetern zu den UV-Lampen. Nach der Belichtung.Wasser auf die Maske und das PDMS geben und das PDMS dann langsam von der Maske abziehen. Das zuvor passivierte PDMS auf der Dehvorrichtung befestigen. Eine Seite des PDMS am festen Teil des Dehngeräts befestigen. Die andere Seite am beweglichen Teil des Dehngeräts fixieren, wobei nicht zu viel vom PDMS-Blatt eingespannt wird.Wenn das PDMS zu stark geklemmt wird, wird es kürzer, und dies kann zu einem Bruch führen, da die Spannung bei gleicher Dehnungsstrecke größer ist. Achten Sie darauf, dass die Schrauben gut angezogen sind, da sonst das PDMS-Blatt verrutschen wird, sobald die Dehnung beginnt oder später im Verlauf des Experiments. Anschließend inkubieren Sie das PDMS eine Stunde lang mit Fibronectin-Lösung.Bei Raumtemperatur können andere extrazelluläre Matrixproteine verwendet werden, diese wurden jedoch nicht mit diesem Protokoll getestet. Als letzten Schritt spülen Sie das PDMS mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung ab. Schneiden Sie anschließend ein Rechteck aus PDMS aus einer dicken PDMS-Scheibe aus.Schneiden Sie dann ein weiteres Rechteck nach innen ein. Um einen Behälter zu erhalten, der die Zellen und das Medium hält, geben Sie Silikonfett unter diesen rechteckigen PDMS-Ausschnitt und platzieren Sie ihn auf dem PDMS-Blatt, um einen mediumhaltenden Behälter zu erzeugen. Das Fett ermöglicht das Gleiten des Behälters über das PDMS-Blatt während der Dehnung, um die Zellen zu mustern.Zunächst lösen Sie die Zellen aus einem Kulturgefäß bei 50 % Konfluenz ab. Sobald sich die Zellen in Suspension befinden, pipettieren Sie sie mehrmals mit einer 200-Mikroliter-Spitze, um Aggregate aufzubrechen, wodurch sichergestellt wird, dass einzelne Zellen an das Muster binden. Fügen Sie anschließend ein Milliliter der Zellsuspension in das Reservoir hinzu.Lassen Sie die Zellen je nach Zelltyp 10 bis 30 Minuten lang an die Muster binden. Typischerweise erfolgt dies in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Sobald die Zellen an den Mustern angeheftet sind, spülen Sie die nicht angehefteten Zellen vorsichtig mit equilibriertem Medium ab.Entfernen Sie das Medium mit einer aspirierenden Pipette, während Sie gleichzeitig frisches Medium hinzufügen. Es ist entscheidend, einen ausreichenden Durchfluss aufrechtzuerhalten, um nicht angeheftete Zellen wegzuspülen, und gleichzeitig sicherzustellen, dass die Zellen stets im Medium eingetaucht bleiben. Anschließend legen Sie eine Deckglasplatte auf die Flüssigkeitsoberfläche, um Verdunstung und Mediumaustritt zu verhindern, falls das PDMS reißt, und lassen Sie die Zellen einige Stunden lang auf den Mustern ausbreiten.Platzieren Sie anschließend das Gerät auf einem umgekehrten Mikroskop und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Verwenden Sie keine Öl-Immersion-Objektive, da diese aufgrund von Fokussierungsproblemen nicht funktionieren. Um die mikrostrukturierten Zellen zu dehnen, drehen Sie die Feinmessschraube, während Sie die Stufenposition in den X-, Y- und Z-Achsen korrigieren.Die Stellung des Objekttisches muss korrigiert werden, um die Verbreiterung des PDMS und den Verlust der Fokussierung auszugleichen. Die in diesem Video-Protokoll vorgestellte Technik ermöglichte die Anwendung von Kräften auf die Retraktionsfasern mitotischer Säugetierzellen, indem das Substrat zu Beginn der Metaphase gedehnt wurde. Einige dieser Retraktionsfasern wurden vom Zellkörper weggezogen, wodurch eine mechanische Kraft auf die Zellkortex der mitotischen Zelle vor der Dehnung ausgeübt wurde; zu diesem Zweck wird die Zelle auf ein ovales Muster aufgebracht.Die Musterung erfolgt, indem das PDMS während des Abdrucks runder Muster durch die Fotomaske gedehnt wird. Nach dem Dehnen wird das Substrat so weit gestreckt, dass das Muster kreisförmig wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Zellen auf makroskopischen Mustern kultivieren und anschließend Dehnungskräfte auf das Substrat ausüben können.

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