Name: Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Dynamik von Stress-Granula in primären Zellen durch Live-Bildgebung mit konfokaler Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von G3BP1 in Maus-Fibroblasten und hippocampalen Neuronen.

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Die Autoren möchten die Montpellier Rio Imaging (MRI)-Plattform, wo die Übernahmen wurden durchgeführt, zu bestätigen. Sie danken Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot und Virginie Georget für ihre Hilfe in verschiedenen Teilen des Protokolls. Diese Arbeit wurde von der Fondation la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745) unterstützt gießen.

Alle Tier-Verfahren in diesem Protokoll sind die strikte Einhaltung der Richtlinien der Richtlinie vom 24. November 1986 (86-609/EEC) European Community Council. Haus die Mäuse in der Gruppe, so dass Nahrung und Wasser ad libitum. Pflegen sie in einer kontrollierten Umgebung (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% Luftfeuchtigkeit) mit einem 12 Std.: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus (Licht an um 7.00 Uhr). 1 Kultur von murinen Primärzellen:. Embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) <ol><li> Autoklav dünnen Pinzette sowie gebogene Pinzette und Schere sezieren. Bewahren Sie in einem sterilen Behälter. Sterile D-PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Vorbereitung abgeschlossen MEFs Medium: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / F12 mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 1 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,5 mM 2-Mercaptoethanol ergänzt und warm bei 37 ° C </li><li> Euthanize eine schwangere Maus (13,5 Tage nach coitum (dpc)), Durch zervikale Dislokation. Entfernen Sie die Gebärmutterhörner von der Maus mit 90% EtOH desinfiziert. Unter einer sterilen Haube und sauber, legen die Hörner mit den Embryonen in 37 ° C vorgewärmt D-PBS. Die Hörner, Ort öffnen die Embryonen in einem 100 mm sterile Kunststoffpetrischale, reinigen Sie sie aus der Nabelschnur Material und waschen Sie sie mit warmem D-PBS, um den Blutüber entfernen. Unter einem Fernglas, entfernen des Embryos Gliedmaßen, die inneren Organe und der obere Teil des Kopfes, welche die Gehirn. </li><li> In einer neuen Petrischale, die Hackfleisch Embryonen in sehr kleine Stücke mit einer sterilen chirurgischen Klinge Schere oder (zumindest für 1 min). Im Fall von Embryonen verschiedener Genotypen, vorsichtig sein, jeden einzelnen Embryo in Petrischalen gelegt und halten den Schwanz oder die oberen Kopf für die Genotypisierung. </li><li> Bedecken Sie den Embryo mit 1x Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 1 mM EDTA). Inkubation für 30 min bis 1 h in einem 37 ° C Inkubator. 10 ml KomplettMEFs mittel-bis Trypsin-Reaktion zu stoppen. Pipette auf und ab, um alle Aggregate zu entfernen. Lassen Sie sich die Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen (gefüllt mit Komplettmedium) für 10 min zentrifugiert und der Überstand für 5 Min. bei 300 × g bei Raumtemperatur. Das Pellet in Vollmedium (6 ml für 1 Embryo). Lebensfähige kernhaltigen Zellen können mit Trypanblau gezählt werden blau (Etwa 5 x 10 6 Zellen können von einem Embryo zu erwarten). Plate 3 ml pro 60 mm Petrischale. </li><li> Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und damit die Zellen wachsen, bis die Gerichte werden konfluent. Viele Zelltypen zu erkennen, sondern nur Fibroblasten Subkultur überleben. </li><li> Teilen Sie die Zellen und es ihnen ermöglichen, in 35 mm-Schalen mit Glasboden (wichtig für Zeitraffer-Experiment) wachsen, bis 50-70% Konfluenz für die Transfektion. Test auf Mykoplasmen und Maus Pathogene. </li></ol> 2. Kultur Adaptations im Fall von Neuronen <ol><li> Am Tag vor der Kultur, Fell 35 mm Glasboden-Petrischalen mit Poly-L-Lysin (200 ul von 0,1 mg / ml) unter einer sterilen Haube und sauber, und lassen Sie über Nacht. </li><li> Am nächsten Morgen gründlich mit sterilem reinem Wasser, zweimal für 5 Minuten und einmal 45 Minuten bis 1 Stunde. Ersetzen mit 2 ml DMEM plus 10% FBS-Medium und halten in einem 37 ° C-Inkubator. </li><li> Dissect Embryonen bei 18,5 dpc. Unter einer sterilen Haube und sauber, legen die Hörner mit den Embryonen in kaltem sterilem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) in 100 mm Petrischale. Neugeborenen Welpen können auch anstelle von Embryonen, um die Lebensdauer des Dammes zu erhalten, und um weitere Nachkommen zu erzeugen, insbesondere im Falle von transgenen Tieren, die schwierig zu erhalten sein können verwendet werden. In einzelnen Petrischalen, nehmen Sie jede Embryo oder Neugeborenen und schneiden den Kopf mit einer Schere. Halten Sie den Kopf durch das Einfügen einer gebogenen Pinzette in die Augen, schneiden Sie die Haut und öffnen Sie vorsichtig das weiche Schädel von der Rückseiteder Kopf, bis die Augen, auf jeder Seite des Kopfes. Schneiden Sie die Sehnerven und Hirnstamm, entfernen Sie das Gehirn, und steckte es in eine neue Petrischale mit HBSS. Unter einem Stereoskop, entfernen Sie alle Hirnhäute mit zwei dünnen Pinzette. Trennen den Hippocampus, den Kortex oder einem anderen Teil des Gehirns abhängig von der Struktur zu untersuchen. </li><li> Tauchen Sie den sezierten Hirnstruktur in 4,5 ml kaltem HBSS zuvor vorbereitet in 15-ml-Röhrchen und auf Eis zu halten, bis die Verdauung mit Trypsin. 0,5 ml von 2,5% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 15 min bis 20 min. Spülen Sie die Trypsin 3x mit HBSS, äußerst vorsichtig, um die Hirnteile nicht verdaut zu verwerfen. </li><li> Resuspendieren in 500 ul (Hippocampus) auf 1 ml (Cortex) DMEM plus 10% FBS und und abpipettieren mehrmals mit einer 1 ml-Mikropipette mit einer 1 ml-Spitze ausgestattet ist, dann mit 1 ml plus 200 ul Spitzen ausgestattet, bis es keine sichtbaren Aggregat. </li><li> Verteilen 100-200 ul Zellsuspension in jede 35 mm Glas bottom Schale mit DMEM plus 10% FBS und lassen die Neuronen haften bei 37 ° C für mindestens 3 Stunden. Ersetzen durch vorgewärmte Neuron Vollmedium (Neurobasalmedium, ergänzt mit 250 uM L-Glutamin und NS21, hergestellt wie in Chen et al. Beschrieben 19) und lassen bei 37 ° C, um neuronale Wachstum zu ermöglichen. Transfektion die Neuronen bei 5 bis 14 Tagen in vitro (div) (die Effizienz der Transfektion höher nach ein paar div aber synaptischen Verbindungen besser 7-10 div etabliert sind). </li></ol> 3. Transfektion von EGFP-Konstrukt G3BP1 Transfizieren der Zellen mit einem Vektor, der die cDNA des Proteins von Interesse (jede Komponente des DMS) mit einem fluoreszierenden Marker (GFP, YFP, etc.) fusioniert, unter Verwendung von 3 ug gereinigte Plasmid pro 35 mm-Schale. <ol><li> Transfektion die MEFs mit einem handelsüblichen Verfahren, nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). </li><li> Transfektion die Neuronen mit einem Calcium-Phosphat-Methode von Xia et al 20 Kurz angepasst.: <ol><li> Bereiten Sie die Lösungen: DMEM-Wasch: DMEM mit 25 mM KCl; Transfektionslösung: DMEM-Wasch aus 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl 2 10 mM, Phenol-Rot); und Schock Lösung: HeBS 1x, 1x DMKY und DMSO 2% (v / v); und halten sie bei 37 ° C </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Neuronen, Filtrat, und halten Sie sie bei 37 ° C Waschen mit DMEM-Wasch dann mit Transfektionsmediums ersetzen und bei 37 ° C zu halten während der Herstellung der Calciumphosphat-Plasmid-DNA ausfällt. </li><li> In einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen (in dieser Reihenfolge) Braun Wasser (Endvolumen 50 &amp;mgr; l), 5 &amp;mgr; l 2,5 M CaCl 2, und 3 &amp;mgr; g Plasmid-DNA. Lassen Sie diese Mischung auf 50 ul HeBS 2x bereits in einem Rund Polypropylen-Röhrchen eingeführt. Mischen Sie den Schlauch durch die Drehung zusammen mit dem Ablegen. Den Niederschlag Form bei Raumtemperatur während 30 min. </li><li> Fügen Sie den precipitate tropfenweise auf die Nervenzellen und lassen bei 37 ° C während 30 bis 50 min. </li><li> Ersetzen mit Schock-Lösung für 1 min, dann mit DMEM-Wasch spülen und schließlich die Wiedereinführung vorkonditioniert Medium. Halten der Zellen bei 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualisierung von G3BP Enthält SGs Versammlung und Dynamics <ol><li> Ersetzen Sie das Medium der Zellen, die Phenol-Rot von Phenolrot-freiem Medium enthält. </li><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit Fluoreszenz für die Akquisitionen ausgestattet. Schalten Sie die Mikroskopsysteme: Quecksilberlampe, Computer und Laser. Wärmen Sie die Kammer auf 37 ° C mindestens 20 min vor Beginn der Akquisitionen. </li><li> Die Überexpression von G3BP induziert die spontane Bildung einer Art von SGs. Die Zellen können daher für die Montage der SGs 24 Stunden direkt nach der Transfektion ohne Stressinduktion beobachtet werden. Alternativ können Stress induziert werden, um weitere induzieren die von SGs. In 0,5 mM Natriumarsenit und Sternet die Übernahme kurz nach der Zugabe der Verbindung (Granulat wird gut innerhalb 1 Stunde gebildet werden.) </li><li> Öl in der Immersionsobjektiv (40X oder 63X verwenden Ziele) und installieren Sie die Petrischale vor dem Ziel, in der 35 mm angepasst Mikroskop Halter stabilisiert Halter auf der Bühne. Überprüfen Sie, dass das Gericht ansonsten flachen die Akquisitionen verändert werden. Einschalten des Fluoreszenzlichts nach der entsprechenden Fluorophors und visualisieren transfizierten Zellen. Schalten Fluoreszenz sobald eine Zelle von Interesse ist im Bereich um die Bleich und Zytotoxizität zu minimieren. </li><li> In der &quot;erwerben Reiter&quot;, wählen Sie die Laser in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge des Tags Fluorophor (488 nm in unserem Protokoll, das EGFP-markierten G3BP verwendet), und wählen Sie den Emissionslänge angepasst für den PMT (Photomultiplier). Stellen Sie die Laserleistung (in der Regel nicht mehr als 10%), um Rauschen und Übersättigung sowie Toxizität zu minimieren, und stellen Sie den Gain-und Offset, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verändern.Schnelle Scannen (1000 Hz), um die Dauer der Laser Exposition (Linie 2 Durchschnitt, Rahmen Durchschnitt 1) ​​zu minimieren. Wenn gewünscht, stellen Sie die Parameter für die Z-Stapel in der Lage sein, um das Bild in 3D (Z ein Schritt von 1 um ist in der Regel gut mit Zellen) zu rekonstruieren. Bestimmen Sie das Zeitintervall zwischen jedem Erwerb: kleinere Intervalle erlauben, eine kohärentere Film zu erhalten, aber dies kann Photobleaching und Toxizität (ein Intervall von 20 Sekunden wurde in den beschriebenen Experimenten verwendet) zu induzieren. Dauer der gesamten Anschaffungs je nach Belastung variieren. Viele G3BP haltigen SGs sehr schnell unter Arsenit Behandlung gebildet und sind gut sichtbar nach 1 Stunde der Behandlung: in diesem Fall, wählen Sie die Zellen schnell zu filmen und starten Sie die Akquisitionen direkt nach dem Stress, mit einer Gesamtdauer von Akquisitionen von 15 - 20 Minuten weitgehend ausreichend, um die Montage mehrerer SGs zu beobachten. </li><li> Speichern Sie die Bilder und rekonstruieren die Stapel-und Film mit ImageJ Software. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die wichtigsten Schritte im Protokoll betreffen die Transfektion und insbesondere der Zeitraffer-Akquisitionen, die sorgfältig, um weiter unten die Zytotoxizität überwacht werden müssen. Kultur von Primärzellen ist nicht eine schwierige Teil, solange sterilen Bedingungen eingehalten werden und Vorsicht, um Schäden während der Präparation und Zelldissoziation Schritte zu verhindern. MEFs kann in frühen Passagen eingefroren werden. Neuron Transfektion mit Calciumphosphat wurde gezeigt, dass gu...

Stress Granulate (SGs) nicht membranöse zytoplasmatischen Foci als zelluläre Schutz Reaktion auf Umweltstress, z. B. erhöhte Temperatur, oxidativer Stress, Hypoxie, osmotischen Schock, UV-Bestrahlung, Glukoseentzug oder virale Infektion 1 gebildet. Sie können chemisch durch Behandlung mit Verbindungen wie Natriumarsenit, die oxidativen Stress auslöst, induziert werden. SGs akkumulieren installiert Übersetzung verhaftet Messenger ribonucleoprotein (mRNPs)-Komplexe 2, Maskierungs mRNAs von der Translationsmaschinerie und deren Montage kann durch die Phosphorylierung von eIF2a (eukaryotische Initiationsfaktor α 2) ausgelöst werden. SGs sind dynamische Strukturen, die Komponenten mit den Polysomen und andere Granulate, wie die P-Gremien auszutauschen. Sie bilden eine &quot;Triage-Zentrum&quot;, wo mRNAs werden sortiert und entweder für Übersetzung, Reinitiierung, Abbau oder Verpackung in stabilen, nicht-polysomaler mRNPs 3 verarbeitet. Die Montage ist schnell SGs but ist es ein schleichender Prozess mit Anfangs zahlreiche kleine Aggregate, die in größere Körnchen zusammenwachsen. Die Verwendung von chemischen Inhibitoren, die stören oder Mikrotubuli stabilisieren zeigt, dass das Mikrotubulus-Netzwerk für SG Dynamik einschließlich Montage und Demontage Koaleszenz Verfahren erforderlich sind. Die dynamische Anordnung von SGs auch durch Aggregation von spezifischen RNA-bindenden Proteinen (RNA-BP) wie TIA-1 (T-Zell-Antigen-Innen 1) und gefördert TIAR (TIA-1-verwandtes Protein), die in der Lage sind, zu dimerisieren und zu fördern Polysom ​​Demontage und das Routing von mRNAs in SGs 4. G3BP (RasGAP SH3-Domäne-bindendes Protein) ist ein solches RNA-BP, die SGs lokalisiert, wenn die Zellen mit Arsenit oder Hochtemperatur betont, und die Überexpression von dephosphoryliert G3BP können SGs Anordnung 5 induzieren. G3BP ist eine evolutionär konservierte RNA-BP, die zunächst durch die Interaktion mit einem Ras-GTPase-aktivierendes Protein gekennzeichnet war (p RasGAP120 6); aber diese Wechselwirkung wurde vor kurzem überarbeitet 7. Die Familie G3BP zwei Mitglieder bei Säugetieren, G3BP1 (als G3BP genannt) und G3BP2 8. Beide Proteine ​​co-lokalisieren in SGs, wenn die Zellen auf Stress 9 unterzogen. Den kanonischen RNA-Erkennungsmotiv (RRM) mit konservierten RNP1 und RNP2 Motive: G3BPs umfassen eine N-terminale Domäne NTF2 vorgeschlagen, um ihre Lokalisation und Oligomerisierung, gefolgt von Prolin-reiche (PxxP) Motive zu beeinflussen, dann C-terminalen Motive mit RNA-Bindung verbunden durch eine Arginin-Glycin reichen (RGG) Feld gefolgt. Interessanterweise ist die Analyse der verschiedenen Teile des Proteins durch Konstruktion verschiedener Domänen EGFP fusioniert zeigte, dass die NTF2-ähnliche Domäne und die RNA-Bindungsdomäne waren die effizient SGs rekrutiert, was auf die Bedeutung der Eigenschaften der Dimerisierung und RNA-Bindung in die Montage der SGs. Diverse Modelle haben unterschiedliche Funktionen von Proteinen in vitro G3BP 10-13 offenbart.Unterbrechung G3BP in Mäusen haben die Bedeutung dieses Proteins in der Entwicklungs Wachstum und Überleben 14, sowie eine wichtige Rolle für G3BP in das zentrale Nervensystem (ZNS), von Ataxie und Defekte in der räumlichen Arbeitsspeicher 15 gekennzeichnet dargestellt. G3BP Mangel führt zu veränderten neuronalen Plastizität und Calcium-Homöostase und stellt eine direkte Verbindung zwischen SG Bildung und neurodegenerative Erkrankungen 15. Es ist daher wichtig, um die Dynamik der SGs in primären Zellen wie Neuronen zu studieren. Dieses Protokoll bietet einen einfachen Weg, um die Montage von G3BP1 haltigen SGs in primären Zellen unter Arsenit Behandlung zu beobachten. Es kann verwendet werden, um DMS Anordnung unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, zum Beispiel verschiedene Arten von Spannungen werden. Es kann auch zu anderen Granulaten oder anderen Bestandteilen der SGs angepasst werden. Tatsächlich konzentriert sich dieses Protokoll auf G3BP1, aber es gibt andere Stress Granulat Marker wie TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein-Syndrom) 16, TDP-43 (transaktiven Reaktion DNA-bindendes Protein 43) 18 17 oder Staufen. Insbesondere Proteine ​​wie TIA-1 / R sind wie G3BP, Keim RNA-bindende Proteine, die SGs Montage induzieren kann, wenn überexprimiert wird, auch wenn die verschiedenen geformt SGs in Funktion, Regulation und zugehörigen Transkripte unterscheiden. Transfektion von Fluorophor-markierte Version eines dieser Schlüsselkomponenten oder Nucleatoren von SGs können, um bestimmte Bild SGs Montage und Dynamik durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Vorwärmen bei 37 > C</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Glasboden B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Behandelt oder nicht (behandelt: erhöht die Anheftung anhaftender Zellen)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Vorwärmen bei 37 > C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Vorwärmen bei 37 &deg; C</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Sehr dünn, Spitzen 0,1 mm (nützlich zum Entfernen von Hirnhäuten)</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Sehr dünn, Spitzen 0,1 mm</td></tr><tr><td>Kleine Schere</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Kann nützlich sein, um Hippocampi</td></tr><tr><td>zu entfernen Polyplus Transfektion JetPEI Reagenz&nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs Transfektion, folgen Sie dem Vorwärtsprotokoll</td></tr><tr><td>Inverses konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von g3bp stress-granulat dynamics live primärzellen

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs in Zellen durch Immunfärbung von spezifischen Proteinkomponenten oder polyA + mRNAs visualisiert werden. SGs sind sehr dynamisch und die Untersuchung ihrer Montage und Schicksal ist wichtig, um die zelluläre Reaktion auf Stress zu verstehen. Der Mangel an Schlüsselfaktoren der SGs wie G3BP (RasGAP SH3-Domäne Binding Protein) führt zu Entwicklungsstörungen bei Mäusen und Veränderungen des zentralen Nervensystems. Um die Dynamik von SGs in Zellen aus einem Organismus, man kann Kultur primären Zellen zu untersuchen und folgen Sie der Lokalisierung eines transfizierten markierten Komponente der SGs. Wir beschreiben Zeitraffer-Experiment zu beobachten G3BP1 haltigen SGs in embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF). Diese Technik kann auch verwendet werden, um G3BP enthaltenden DMS in lebenden Neuronen zu untersuchen, die von entscheidender Bedeutung ist, wie es vor kurzem gezeigt, dass diese SGs sind beim Einsetzen von neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit, gebildet werden. Dieser Ansatz kann auf jeden anderen Zellkörper und Granulat Proteinkomponente angepasst und durchmit transgenen Tieren, so dass die Live-Studie von Granulaten Dynamik zum Beispiel in der Abwesenheit eines spezifischen Faktors dieser Granulate.

Stress Granulatbildung in der Reaktion der Zellen auf Stress wichtig, was eine zelluläre Adaption mit Übersetzung ins Stocken geraten, bis die Belastung behoben ist, der Verhinderung der Apoptose assoziiert sind. Dieser Test ermöglicht es, die SGs in primären Zellen zu untersuchen, indem Sie die Lokalisierung von Schlüssel SGs Proteinkomponenten (Abbildung 1). G3BP, ein Schlüsselfaktor für SGs Montage ist derzeit eher diffus im Zytoplasma von kultivierten Neuronen oder MEFs (2A a und <s...

Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Dynamik von Ribonukleoprotein-Granula in Primärzellen zu untersuchen, insbesondere die Bildung von Stress-Granula. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen wie embryonale Fibroblasten oder hippocampale Neuronen von interessierenden Tieren kultiviert werden. Als zweiter Schritt wird eine markierte Komponente der Stress-Granula transfiziert, um deren Visualisierung zu ermöglichen.Anschließend werden die Zellen einer Stressbelastung ausgesetzt und mittels zeitraffender konfokaler Mikroskopie überwacht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Dynamik von G-3-P-bisphosphat-haltigen Stressgranula in Mythen- oder Spiegel- und hippocampalen Neuronen, basierend auf ihrer direkten Visualisierung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Stressantwort in Zellen wie Neuronen zu beantworten.Beispielsweise wurden bei Mäusen nach der Herunterregulation von RNA und der Unterdrückung von Proteinen, die für die Bildung von Stress-Granula unerlässlich sind, neuronale Defekte beobachtet. Diese Methode kann daher dazu beitragen, die Mechanismen hinter diesen Beobachtungen zu verstehen. Nach der Tötung einer trächtigen Maus im Stadium E 13,5 die Maus mit 90%igem Ethanol desinfizieren und die Uterushörner unter sterilen Bedingungen entnehmen.Überführen Sie die Hörner in DPBS bei 37 Grad Celsius und entfernen Sie die Embryonen. Überführen Sie die Embryonen in eine 100 Millimeter-Dish. Entfernen Sie das überschüssige Gewebe und waschen Sie es mit warmem DPBS ab.Entfernen Sie nun unter dem Mikroskop die Gliedmaßen, die inneren Organe und den oberen Teil des Kopfes, der das Gehirn enthält. Die Schwanz- oder Kopfabschnitte können für die Genotypisierung verwendet werden. Zerkleinern Sie das verbleibende Gewebe in einer separaten Schale mindestens eine Minute lang.Genotypen nicht kombinieren, wenn sie innerhalb des Wurfes variieren sollten. Das zerkleinerte Gewebe mit einem x Trypsin-EDTA bedecken und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend 10 Milliliter komplettes Mes-Medium hinzufügen.Um die Reaktion zu stoppen, lösen Sie das Gewebe mit einer Pipette auf und überführen die resultierende Suspension in einen 50-Milliliter-Probengefäß. Füllen Sie das Gefäß mit Medium auf und lassen Sie den Inhalt absetzen. Anschließend gießen Sie die suspendierten Zellen vorsichtig ab.Als Nächstes zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 Gs für fünf Minuten. Wieder suspendieren Sie das Pellet bei Raumtemperatur in sechs Milliliter komplettem Medium pro Embryo. Die Anzahl der lebensfähigen kernhaltigen Zellen sollte etwa 5 Millionen pro Embryo betragen.Dann 60-Millimeter-Platten mit drei Millilitern Zellsuspension beladen und die Zellen kultivieren. Am nächsten Tag das Kulturmedium wechseln und die Zellen bis zur Konfluenz wachsen lassen. Bei der Subkultivierung überleben nur Fibroblasten.Teilen Sie die konfluenten Platten auf 35-Millimeter-Glasbodenkulturschalen auf. Kultivieren Sie diese Schalen bis zu einer Konfluenz zwischen 50 und 70 % und führen Sie anschließend die Transfektion durch.Für jede 35-Millimeter-Schale benötigen Sie drei Mikrogramm gereinigtes Plasmid für die Transfektion. Die Verwendung eines handelsüblichen Transfektionskits ist ausreichend. In diesem Beispiel wird ein Vektor verwendet, der die RAs-Lücke exprimiert.Das SSH-Dreidomänen-Bindungsprotein wird transfiziert. Es ist eine wichtige Komponente von Stress-Granula. Das Verfahren ist natürlich anwendbar zur Untersuchung jedes beliebigen Vektors von Interesse in Fibroblasten am Tag vor der Entnahme des Welpen.Bereiten Sie die mit Paulin-Lysin beschichteten Petrischalen vor, indem Sie Embryonen von 18,5 DPC alten Dams sammeln und in eine große Schale mit HBSS überführen. Falls gewünscht, können neugeborene Welpen verwendet werden, um das Töten der Mutter zu vermeiden. Schneiden Sie den Kopf ab und entfernen Sie das Gehirn.Danach die Gehirne der Nachkommen unter dem Mikroskop mit HBSS in eine saubere Schale gewinnen. Alle Hirnhäute mit feinen Pinzetten entfernen. Anschließend die gewünschten Gehirnareale wie die Hippocampi voneinander trennen.Überführen Sie die Gewebe in 4,5 Milliliter kalte HPSS in 15-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie diese auf Eis. Verdauen Sie die Gewebe, indem Sie 0,5 Milliliter einer 2,5 %igen Trypsinlösung hinzufügen. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten.Anschließend wird die Trypsinlösung durch drei Waschvorgänge mit HBSS abgespült, wobei darauf zu achten ist, dass kein Gewebe verloren geht. Nun wird das Gewebe in einer halben bis einer Milliliter DMM mit 10 % FBS resuspendiert. Danach wird das Gewebe homogenisiert, indem es mehrfach durch eine Pipette auf- und abgesaugt wird.Danach auf eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze wechseln und die Lösung solange pipettieren, bis keine sichtbaren Aggregate mehr vorhanden sind. Anschließend 100 bis 200 Mikroliter der Zellsuspension zu 35-Millimeter-Glasbodenkulturschalen hinzufügen, die mit DMM-FBS-Medien vorbereitet wurden, und die Schalen inkubieren. Nach drei Stunden Kultivierung das Medium für die verbleibende Kulturzeit durch vorgewärmtes neuronales Komplettmedium ersetzen.Nach fünf bis 14 Tagen in der Kultur übertragen Sie die Neuronen mittels der Calciumphosphat-Methode. 24 Stunden nach einer erfolgreichen Transfektion beginnen sich Stress-Granula aufgrund der Überexpression von G3BP zu bilden. Zusätzlicher Stress fördert die Bildung von Stress-Granula weiter; erwärmen Sie die Komponenten des konfokalen Mikroskops mindestens 20 Minuten vorher, einschließlich der Erwärmung der Probehalterung auf 37 Grad Celsius.Für die Visualisierung der Zellen wird ein 35-Millimeter-Plattenhalter benötigt. Gehen Sie folgendermaßen vor: Ersetzen Sie zunächst jedes Zellmedium, das Phenolrot enthält, durch ein Medium ohne Phenolrot.Beginnen Sie unverzüglich mit der Aufnahme der Zellen. Stress-Granula bilden sich innerhalb einer Stunde, daher wird der Stress erst nach der Visualisierung der Zellen ausgelöst. Es ist wichtig, die Aufnahmen so schnell wie möglich nach der Induktion des Stresses zu starten und zwei Parameter genau an Ihren Zelltyp und Ihr Zielprotein anzupassen.Die Laserintensität und die Dauer der Aufnahmen niedriger halten, um die Zytotoxizität zu verringern. Danach die Zellen mit einer 40x- und 63x-Ölimmersionsobjektiv betrachten. Sicherstellen, dass die Platte flach im Halter liegt, und das fluoreszierende Licht möglichst wenig verwenden.Wenn ein interessierendes Feld lokalisiert ist, verwenden Sie die Software, um Bilder aufzunehmen. Beginnen Sie mit einer Laserleistung von 10 % oder weniger und stellen Sie Verstärkung (Gain) und Offset so ein, dass das bestmögliche Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird. Scannen Sie mit 1000 Hertz, um die Belastung der Zellen durch den Laser zu minimieren, legen Sie den Bildstapel nach Bedarf fest und halten Sie das Scannintervall so lang wie möglich, um die Gesundheit der Kultur besser zu erhalten.Sammeln Sie Daten so lange, wie benötigt wird; in MEFs bilden sich Granula innerhalb von 10 Minuten und sind innerhalb einer Stunde deutlich sichtbar. In Neuronen verläuft der Prozess etwas langsamer. G drei BP sollte unter Verwendung der beschriebenen Techniken mindestens 45 Minuten lang ein angemessen starkes Signal liefern.Die Bildung von Stress-Granula wurde in kultivierten Zellen beobachtet. Die Lokalisation des mit G3BP markierten Proteins war in den Zellkulturen und auch in den Neuronen diffus im Zytoplasma verteilt. Nach Behandlung mit Arsenit lokalisierten sich die Proteine deutlich in definierte und größere Foci in beiden Zelltypen.Das sind die Stress-Granula. Die aufgenommenen Bilder können zu einem Zeitrafferfilm rekonstruiert werden. Das erste und zweite Video zeigen Fibroblasten, die auf Stress reagieren.Das dritte Video zeigt dasselbe. In einem hippokampalen Neuron ermöglichen Zack-Rekonstruktionen die 3D-Lokalisierung des markierten G-three-B-beta und bieten somit eine andere Perspektive beim Tracking. Mithilfe dieses Verfahrens kann die Immunzytochemie eingesetzt werden, um die Granulakomponenten nach verschiedenen Arten von Stress und nach Selbstfixierung sichtbar zu machen.Dies kann quantitative Fragen zur Größe und Anzahl der verschiedenen zellulären Strukturen unter verschiedenen Bedingungen beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Dieses Video zeigt einen Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren, die aus mRNAs, RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und verschiedenen anderen Proteinen bestehen.

Ein Immunfluoreszenz-Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren

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Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

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