Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen als entweder adhärente Monoschichten oder Neurosphären aus der subventrikulären Zone und dem Gyrus dentatus einzelner adulter Mäuse. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einzelner erwachsener Mäuse entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die subventrikuläre Zone und die Gyrus dentatus zu mikrodisezieren.

Als nächstes wird das Gewebe in eine einzellige Suspension dissoziiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Vorläuferzellen entweder als adhärente Monoschichten oder Neurosphären zu kultivieren. Letztendlich sind der Neurossphären-Assay und das adhärente Monolayer-Kultursystem wertvolle Werkzeuge, um das Potenzial für Proliferation oder Differenzierung in adulten neuralen Stammzellen zu bestimmen.

In vitro ermöglicht uns diese Methode, einige sehr interessante Fragen auf dem Gebiet der adulten Neurogenese zu beantworten. Damit können wir uns Zellen von einzelnen Tieren anschauen und sie vergleichen, und das ist im Zusammenhang mit der Betrachtung individueller Unterschiede interessant, oder zum Beispiel der Unterschiede zwischen einzelnen transgenen oder Knockout-Masken im Vergleich zu ihren Kontrollen. Tara Walker, eine leitende Wissenschaftlerin in meiner Gruppe, würde diese Methode vor der Hirndissektion vorstellen.

Bereiten Sie die feuerpolierten Pipetten mit mittleren und kleinen Wildschweinen vor, indem Sie die Weidepipetten aus Glas in einer Flamme drehen, bis die Ränder abgerundet sind. Anschließend sterilisieren Sie sie in einem Autoklaven. Zuerst wird das Gehirn in eine 10 Zentimeter große Petrischale aus Plastik übertragen, die PBS enthält.

Platzieren Sie eine Petrischale mit dem Gehirn unter einem Präpariermikroskop bei geringer Vergrößerung, wobei das Gehirn auf seiner Bauchfläche positioniert wird. Verwenden Sie anschließend die fein gebogene Pinzette, um die Riechkolben zu entfernen, während Sie das Kleinhirn halten. Drehen Sie als Nächstes das Gehirn auf den dorsalen Aspekt.

Machen Sie mit einem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das Gehirn auf Höhe des Chiasmas opticum, um die SVZ zu mikrodisezieren. Legen Sie den rostralen Teil des Gehirns so gegen die Schale, dass die geschnittene koronale Oberfläche nach oben zeigt. Unter einer höheren Vergrößerung das Septum entfernen und entsorgen.

Präparieren Sie dann die SVZ, eine dünne Gewebeschicht, die den Ventrikel umgibt, indem Sie die Spitze einer Klinge der fein gebogenen Pinzette in die laterale Ecke des lateralen Ventrikels legen. Unmittelbar unter dem Corpus callosum und der anderen Klinge, etwa einen Millimeter in das Gewebe unmittelbar neben dem Ventrikel. Drücken Sie die Pinzette in Richtung des Bodens der Schale und in Richtung der ventralen Seite des Ventrikels, um ein kleines dreieckiges Stück Gewebe zu entfernen.

Danach legen Sie das präparierte SVZ in eine Petrischale auf Eis, um die DEG-Stelle, den verwöhnten Teil des Gehirns in der Petrischale, zu mikrodisezieren und mit einem Skalpell unter einem Präpariermikroskop entlang der Längsfissur zu schneiden. Entfernen Sie das Kleinhirn und den Farbstoff Cephalon. Fokussieren Sie das Mikroskop so, dass die Ränder um die DG jetzt sichtbar sind.

Um die DG zu entfernen, die Spitze einer 27-Gauge-Nadel einführen und am Rand zwischen DG und Amenhorn entlangschieben. Befreien Sie dann das DG mit der feinen Pinzette vom umgebenden Gewebe Für die SVZ-Gewebedissoziation. Hacken Sie das Gewebe mit einer Skalpellklinge eine Minute lang, bis keine großen Stücke mehr übrig sind.

Dann Reanimation. Suspendieren Sie das Hackfleisch mit einem Milliliter Prewarm 0,05%trips in EDTA. Anschließend wird es in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und sieben Minuten lang in einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Wasserbad inkubiert.

Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, fügen Sie einen Milliliter Trypsin-Inhibitor hinzu, der DNA-Schwan enthält, und mischen Sie den Inhalt, indem Sie das Röhrchen schnippen. Als nächstes pelletieren Sie die Suspension durch Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten und eine Narbe. Der Sennett resuspendiert danach die Pellets in einem Milliliter Wachstumsmedium und assoziiert sie mit Gly.

Pipettieren Sie etwa sieben bis 10 Mal mit einer P 1000-Pipette auf und ab. Geben Sie dann das Wachstumsmedium zu einem Gesamtvolumen von fünf Millilitern hinzu und passieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb, um Ablagerungen und nicht zugehörige Gewebeklumpen zu entfernen. Anschließend wird es fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert.

Verwerfen Sie das Supinat und den Reus. Suspendieren Sie das resultierende Pellet in 200 Mikrolitern Wachstumsmedium für die Dissoziation des DG-Gewebes. Hacken Sie das Gewebe mit einer Skalpellklinge etwa eine Minute lang, bis keine großen Stücke mehr übrig sind.

Übertragen Sie anschließend das Hackfleisch in die vorwarme PDD-Enzymmischung. Inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und mischen Sie es, indem Sie das Röhrchen alle drei bis fünf Minuten umdrehen. Als nächstes dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer feuerpolierten Weidepipette mit mittlerer Bohrung 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren, dann weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und mischen, indem Sie das Röhrchen alle drei bis fünf Minuten schnippen. Weiter.

Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, indem Sie es mit einer kleinen Wildschweinfeuer-polierten Weidepipette 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Anschließend zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 130 g. Entfernen Sie anschließend das Supinat und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Pufferlösung.

Stellen Sie bis zu 10 Milliliter mit Pufferlösung her. Nach der Zentrifugation bei 130 GS für fünf Minuten. Entfernen Sie den S-Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern à 20 % pro Anruf.

Dann zentrifugieren Sie es bei 450 GS für 15 Minuten. Entfernen Sie die Schlinge und suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Puffer. Zum Schluss zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 130 GS und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Wachstumsmedium für adhärente Kulturen. Platten Sie 200 Mikroliter Zellen in jede einzelne Vertiefung einer PDL Lamin ENC-beschichteten 96-Well-Platte für Sphe-Kulturen, verdünnen Sie sie mit Wachstum, Medium auf 20 Milliliter und plattieren Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung über eine unbeschichtete 96-Well-Platte, inkubieren Sie dann bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 nach sechs bis 12 Tage zählen und messen den Durchmesser der Neurosphären mit einem IP Gradi, der an einem aufrechten Lichtmikroskop angebracht ist.

Diese Abbildung zeigt, dass die adulten Maus-Vorläuferzellen als adhärente Monolayer-Kulturen oder als Neurosphären in der SVZ und dg kultiviert werden können. Es wurde beobachtet, dass aus der SVZ signifikant mehr Neurosphären erzeugt werden als aus der DG einzelner Mäuse, und die SVZ- und DG-Vorläuferzellen reagieren auch unterschiedlich auf in vitro Depolarisation, um eine Langzeitpotenzierung zu bestätigen. Es wird gezeigt, dass sich die Neurosphären über 10 Passagen ausgedehnt haben.

Neurosphären können nach diesem Verfahren in Beta-drei Tubulin-positive Neuronen unterschieden werden, wie in rot gezeigt, GFAP-positive Astrozyten in grün, O vier positive Oligodendrozyten in rot und zwei AB-positive Neuronen in rot. Andere Methoden, wie z.B. das Verpacken der Zellen oder Neurosphären über mehrere Generationen oder die Differenzierung der Neurosphären mit anschließender histologischer Analyse, können durchgeführt werden. Dies wird helfen, weitere Fragen wie Multi-Potentialität und langfristiges Potenzial zu beantworten.