Name: Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultur neuronaler Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone und dem Gyrus dentatus adulter Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung adulter Neurogenese und individueller Unterschiede.

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TLW wurde durch ein Marie-Curie-Fellowship International Eingehendes unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von der Grundlagen institutionellen Förderung finanziert, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) die Finanzierung und teilweise mit Unterstützung von Schwerpunktprogramm (SFB) 655 bis GK. Die Autoren bedanken sich bei Anne Karasinsky für die Pflege und Wartung aller in dieser Studie verwendeten Tiere und Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Böhme und Richard Wetzel für die Zellkultur und Mikroskopie Unterstützung danken.

1. Basic Setup und Vorbereitung von Kulturmedium <ol><li> Mindestens zwei Tage vor Beginn des Experiments vorbereitet Poly-D-Lysin (PDL) / Laminin beschichteten Platten für adhärente Monolayer-Kulturen. Zur Vorbereitung Wells / Kolben fügen Sie genug PDL (10 mg / ml in dH 2 O), um die Oberfläche und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung aus dem Gericht und dem Gericht waschen dreimal mit dH 2 O. An der Luft trocknen. In Laminin (5 mg / ml in kaltem DMEM: F12) und bei 37 ° C über Nacht. Entfernen Sie die Laminin und entweder die Platten sofort oder zu speichern mit dem Laminin bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten feuerpolierte Pipetten mit &quot;mittel&quot; und &quot;klein&quot; Bohrungen durch rotierende Glaspasteurpipetten in einer Flamme, bis die Kanten abgerundet werden. Autoklav zu sterilisieren. </li><li> Am Tag der Präparation, bereiten Sie die entsprechende Menge an Kulturmedium durch Mischen Neural Basal Medium mit 2% B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml Heparin, 50 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin, 20 ng / ml gereinigtem Maus-Rezeptor-Klasse epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml rekombinantem Rinder-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2). Erwärmen des Kulturmediums auf 37 º C in einem Wasserbad. </li><li> Für die SVZ Dissoziation vorzubereiten 0,05% Trypsin-EDTA und 0,125 mg / ml Trypsin-Inhibitor, enthaltend 0,01 mg / ml DNaseI. Äquilibrieren dieser Lösungen auf 37 ° C </li><li> Eine Dissektionsmikroskop Set und bereiten die notwendigen Werkzeuge, um das Gehirn (Schere und kleinen Spatel) zu entfernen und für SVZ und der GD Dissektionen (Skalpell, 27 G-Nadel auf 1 ml Spritze befestigt, 1 x Nr. 7 Zange, 1 x # 5/45 Zange) durch Eintauchen in 70% Ethanol. </li></ol> 2. Die Ernte der erwachsenen Maus Brains und SVZ / DG Mikrodissektionen <ol><li> Anesthetize einzelnen Erwachsenen (8 Wochen alt)-Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts. Führen Genickbruch. </li><li> Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren und die Menge von Pelz zu minimieren, dass eindHères der Schere und Gehirn. Mit einer scharfen Schere enthaupten das Tier an der Basis des Hirnstamms. </li><li> Halten Sie den Kopf an der Basis des Schädels, schneiden Sie den Schädel zwischen den beiden Riechkolben, indem Sie ein Blatt eines kleinen Schere in jede Augenhöhle und Schneid koronal. Als nächstes stellen zwei seitliche Schnitte an der Basis des Schädels, gefolgt durch einen Längsschnitt durch den Schädel entlang der Pfeilnaht. Vorsicht: sicherzustellen, dass der Winkel der Schere so flach wie möglich zu beschädigen die zugrunde liegende Gehirn ist. </li><li> Setzen Sie das Gehirn durch den Schädel zurück Peeling entweder mit der Klinge der Schere oder einem Paar von gebogenen Pinzette. Befreie das Gehirn aus dem Schädel mit einem kleinen Spachtel und Ort in kaltes PBS. </li><li> Spülen mit PBS Gehirn, Blut und Fell zu entfernen. </li><li> Übertragen Gehirn zu einer 10 cm Kunststoffpetrischale mit PBS </li><li> Zeigen Petrischale mit dem Gehirn unter einem Binokular bei geringer Vergrößerung und die Position der brain auf der Bauchseite. Mit feinen gebogenen Pinzette entfernen Sie die Riechkolben, während das Gehirn hält in Position durch das Kleinhirn. </li><li> Drehen Sie das Gehirn auf den dorsalen und mit einem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das Gehirn auf der Ebene des Chiasma </li><li> Um die SVZ microdissect (detaillierte Anleitung dazu finden Sie auch Azari et al. 10), legen Sie den rostralen Teil des Gehirns, so dass der Schnitt koronalen Oberfläche nach oben zeigt und sich das Mikroskop auf eine höhere Vergrößerung. Entfernen und Entsorgen der Scheidewand mit feinen gebogenen Pinzette. </li><li> Präparieren Sie die SVZ (die dünne Schicht um den Ventrikel Gewebe), indem Sie die Spitze einer Klinge von einer feinen gebogenen Pinzette in der lateralen Ecke des lateralen Ventrikel unmittelbar unter dem Corpus callosum und den anderen etwa 1 mm in das Gewebe sofort angrenzend an den Ventrikel. Drücken Sie die Zange in Richtung der Basis der Schale und in Richtung der ventralen Aspekt der ventrkel, eine kleine dreieckige Stück Gewebe zu entfernen. Legen Sie die seziert SVZ in eine Petrischale auf Eis. </li><li> Um die DG microdissect (detaillierte Anleitung dazu finden Sie auch Hagihara et al. 11), legen Sie die Schwanz Teil des Gehirns, in der Petrischale und entlang der Längsspalte mit einem Skalpell geschnitten. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie das Kleinhirn und Zwischenhirn mit einer Pinzette. </li><li> Refocus das Mikroskop, so dass die Ränder um das DG sind nun sichtbar. Um den Gyrus dentatus zu entfernen, führen Sie die Spitze einer 27 G-Nadel und entlang der Grenze zwischen der DG und Ammonshorn. Mit den feinen Pinzette, befreit das DG aus dem umgebenden Gewebe. </li></ol> 3. SVZ Gewebedissoziation <ol><li> Mince das Gewebe mit einem Skalpell für ca. 1 min bis keine großen Stücke bleiben. </li><li> Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem 15-ml-Röhrchen mit 1 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation für 7 min inein Wasserbad auf 37 ° C eingestellt </li><li> Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, 1 ml Trypsin-Inhibitor enthält DNaseI und mischen Sie den Inhalt durch Schwenken des Rohres. </li><li> Pellet der Suspension durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min und den Überstand verwerfen </li><li> Das Pellet in 1 ml Wachstumsmedium und distanzieren sich ausdrücklich von sanft und Abpipettieren ca. 7-10x mit einem P1000 Pipette. Vorsicht: über Verreiben kann zu erhöhten Zelltod führen und sich negativ auf die nachfolgenden Zellwachstum auswirken. </li><li> In Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml und übergeben die Zellsuspension durch ein 40-mm-Sieb, um Schmutz und undissoziierten Gewebeklumpen zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten, Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der resultierenden Pellets in 200 ml Wachstumsmedium. </li></ol> 4. DG Gewebedissoziation <ol><li> Hackfleisch das Gewebe unter Verwendung einer Skalpellklinge für etwa 1 min bis keine große Stücke bleiben und TransferPDD in vorgewärmtem Enzym-Mix (Papain 2,5 U / ml Dispase 1 U / ml DNase I 250 U / ml). Inkubation für 20 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen des Röhrchens alle 3-5 min. </li><li> Distanzieren das Gewebe mechanisch mit einer mittleren Bohrung, feuerpolierte, Pasteur-Pipette durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig 10x. </li><li> Inkubation für weitere 10 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen des Röhrchens alle 3-5 min. </li><li> Weitere distanzieren das Gewebe mechanisch mit einer kleinen Bohrung, poliert Feuer Pasteur-Pipette durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig 10x. </li><li> Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 1 ml Pufferlösung (1x HBSS, 30 mM Glucose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO 3). Stellen Sie bis zu 10 ml mit Pufferlösung. </li><li> Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. </li><li> Überstand abnehmen und das Pellet in 5 ml 20% Percoll. (So ​​bereiten 90% Percoll, fügen Sie 4,5 ml 100% Percoll zu 0,5 ml 10x PBS verdünnen diese dann weiter auf 20%durch Zugabe von 1,1 ml 90% Percoll auf 3,9 ml 1x PBS). </li><li> Zentrifuge 450 g für 15 min. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml Puffer. </li><li> Zentrifugieren bei 130 × g für 5 min. </li><li> Das Pellet in 200 ul Wachstumsmedium. </li></ol> 5. Erzeugung von adhärenten Monolayer-Kulturen <ol><li> Platte der dissoziierten SVZ oder DG Gewebe in einem einzigen PDL / Laminin Vertiefung einer 96-Well-Platte beschichtet und bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Ungefähr 24 Stunden nach der Plattierung, wenn die Zellen an der beschichteten Oberfläche haftet, tauschen das Wachstumsmedium, um überschüssige Schmutz weiter zu entfernen. </li><li> Jeder weitere 3-4 Tage, Austausch Hälfte des Wachstumsmediums mit frischem Medium, um die Wachstumsfaktoren wieder aufzufüllen. </li><li> Wiederholen, bis die Zellen zu erreichen ca. 80% Konfluenz und sind bereit, agiert werden. Hinweis: die Zeit zwischen der Beschichtung und den ersten Durchgang kann bis zu 2-3 Wochen dauern. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Die Passage von adhärenten Monolayer-Kulturen <ol><li> Wenn die Kulturen etwa 80% Konfluenz entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen mit PBS. Hinweis: Nicht in die Zellen zu 90% Konfluenz überschreiten, da dies zur Ablösung von Zellen und Neurosphärenbildung und darüber hinaus führen, erhöhte Zelltod. </li><li> 50 ml Accutase und bei 37 ° C für 2-3 min (zu überprüfen, ob die Zellen sind gerundet und Haus). </li><li> Entfernen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube und waschen das auch einmal mit PBS und Transfer in das gleiche Rohr. </li><li> Verdünnte Zellen mit 5 ml PBS und Zentrifuge 300 × g für 5 min. </li><li> Für den ersten Durchgang, verdünnten Zellen auf 1 ml und die Platte in eine PDL / Laminin Vertiefung einer 24-Well-Platte überzogen. </li><li> Für die folgenden Passagen, Die Zellen in 200 ml Wachstumsmedium und Zahl mit einer Zählkammer. Teller mit 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in der entsprechenden Größe und beschichtete oder Kolben. </l<html> i&gt; </ol> 7. Differenzierung von adhärenten Monolayer-Kulturen <ol><li> Die anhaftenden Monolayer-Kulturen, Platte proliferierenden Zellen auf PDL / Laminin beschichteten Deckgläschen in einer Dichte von 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in Wachstumsmedium mit 20 ng / ml EGF und 10 ng / ml bFGF unterscheiden. </li><li> Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz (in der Regel 2 Tage) zu erreichen, ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit Medium mit 5 ng / ml bFGF und 0 ng / ml EGF. </li><li> Nach 2 Tage 5 ng / ml bFGF Ersetzen des Mediums mit Wachstumsmedium in Abwesenheit von beiden Mitogene für weitere 3 Tage Anmerkung:. Während dieser Zeit eine signifikante Menge an Zelltod auftritt. </li><li> Nach insgesamt 5 Tage, waschen Sie die differenzierten Zellen mit PBS auf tote Zellen zu entfernen, dann fix mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wieder mit PBS waschen, um alle PFA und speichern Deckgläser in Bohrlöchern in 1 ml PBS bei 4 ° C entfernen </li></ol>jove_title &quot;&gt; 8. Neurosphäre, Kultur und Quantifizierung <ol><li> Verdünnt das dissoziierte SVZ oder DG Gewebe von einem Tier in 20 ml Kulturmedium und der Platte 200 ml / Vertiefung in eine 96-Well-Platte unter Verwendung einer 10 ml Pipette Multidoser. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6-7 Tage SVZ abgeleiteten Neurosphären und 10-12 Tage für DG abgeleiteten Neurosphären. Hinweis: Wachstum für mehr als diese empfohlenen Inkubationszeiten in Überwucherung führen und den Zelltod in der Mitte der Neurosphären und / oder spontane Anhaftung und Differenzierung führen. </li><li> Graf und messen den Durchmesser der Neurosphären mit einem Okular-Strichplatte in eine aufrechte Lichtmikroskop montiert </li></ol> 9. Passagieren der Neurosphären Nachdem die primären Neurosphären wurden gezählt und ihre Größe aufgezeichnet sie über mehrere Passagen beginnen entweder mit einem einzelnen oder einer Neurosphäre Groß Kultur erweitert werden. <ol><li> Massenkultur Neurosphäre Expansion <ol><li> Um Durchgang kombiniert Neurosphären als Massenkultur, entfernen Sie das Medium, das die Neurosphären von der Platte, Transfer in ein 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. </li><li> Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Neurosphären in 1 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> Gleiches Volumen von Trypsin-Inhibitor enthält DNaseI und gut mischen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 300 g, der Überstand entfernt und 1 ml Wachstumsmedium. </li><li> Man reibt auf und ab etwa 10x mit einem P1000 Pipette, um die Neurosphären zu trennen. </li><li> Entfernen 10 ml der Zellsuspension und mit dem gleichen Volumen Trypanblau mischen und durchzuführen, eine Live-Zellzahl mit einer Zählkammer. </li><li> Reseed die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in der geeigneten Größe der Zellkultur gut oder Kolben. </li><li> Bei 37 ° Cmit 5% CO 2 bis sekundären Neurosphären bilden. </li></ol></li><li> Einzelneurosphäre Expansion <ol><li> Um einzelne Durchgang Neurosphären wählen Brunnen, die eine einzelne Neurosphäre enthalten und sorgfältig entfernen und entsorgen ca. 160 ul des Wachstumsmediums von jedem gut ohne die Neurosphäre zu stören. </li><li> 100 ml von 0,05% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung zu agiert werden und bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> 100 l Trypsin-Inhibitor enthält DNAseI, um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Man reibt etwa 10 mal nach oben und unten mit einer Pipette auf P200 brechen die Neurosphäre. </li><li> Übertragen Sie die 200 ml, der die dissoziierten Neurosphären zu einer neuen Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml Wachstumsmedium. Bei 37 ° C mit 5% CO 2 bis sekundären Neurosphären bilden. Hinweis: Um langfristige Potenzial, einer der Kardinal Eigenschaften eines echten Nerven s bestimmenTEM-Zelle sollte Neurosphären für mindestens 5-10 Passagen agiert werden. Siehe auch die Literatur zum Teil umstrittene Interpretation solcher Ergebnisse 14.12. </li></ol></li></ol> 10. Differenzierung der Neurosphäre Kulturen Primär oder agiert Neurosphären unterschieden multipotentiality zu bestimmen. <ol><li> Neurosphären in Suspension entfernen von ihren Kulturplatte oder Kolben und sie auf einer 10 cm Petrischale aus Kunststoff. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop entfernen ca. 15-20 Neurosphären aus dem Medium mit einer Pipette P20 und Transfer zu einer 24-Well-Platte, die die Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren und einer PDL / Laminin beschichteten Deckglas. </li><li> Differenzierung für etwa 7 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die differenzierten Neurosphären mit PBS auf tote Zellen zu entfernen, dann fix mit 4% PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wieder mit PBS waschen rntfernen keine PFA und speichern Deckgläser in Bohrlöchern in 1 ml PBS bei 4 ° C </li></ol> 11. Immunfärbung von Neurosphäre und adhärenten Kulturen Hinweis: Für die Färbung mit dem Antikörper O4 weglassen Triton aus den Sperr-und Färbeschritte und denken Sie daran, eine geeignete IgM Sekundärantikörper zu verwenden. <ol><li> Inkubiere die Deckgläser mit den differenzierten Neurosphären oder adhärente Monolayer-Kulturen in Blockierungslösung (10% normalem Eselserum in PBS, enthaltend 0,2% Triton X-100) für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubation in frischem Blockierungslösung mit primären bIII-Tubulin, Map2a + b, saure Gliafaserprotein (GFAP) oder O4 Antikörper für 60min bei Raumtemperatur. </li><li> 3x Waschen mit PBS. </li><li> Inkubieren in frisch Blockierungslösung, die geeignete Fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörpern und 4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI; 1:5000) für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li&gt; mit PBS waschen dreimal. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger mittels Fluoreszenz-Eindeckmedium und an der Luft trocknen über Nacht im Dunkeln </li><li> Ansicht und Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Beitrag stellt ein ausführliches Protokoll für die Einleitung von neuralen Vorläufer Kulturen, sowohl als Monoschichten haft und Neurosphären, von den beiden großen neurogenen Regionen des adulten Gehirn der Maus. Es gibt eine Anzahl wichtiger Punkte, die, wenn versucht wird diesen beiden Kultursystemen gehalten werden müssen. Zum einen ist die Wahl der Dissoziation Verfahren sehr wichtig und ist gewebeabhängig. In unseren Händen, 0,05% Trypsin-EDTA sehr effektiv für die Dissoziation des SVZ Gewebe und führt zu einer höheren Anzahl von Neurosphären als bei Verwendung einer Papain-Spalttechnik basiert. Für die Dissoziation von DG Gewebe jedoch empfehlen wir dringend eine Papain-basierten Ansatz Dissoziation. Beim direkten Vergleich der beiden Methoden auf Dissoziation DG Gewebe beobachteten wir eine deutlich geringere Ausbeute der lebensfähigen Zellen und ca. 10-fach weniger Neurosphären bei der Verwendung von Trypsin. Dieser Unterschied in der Dissoziation kann durch den Unterschied in der Gewebe compositio seinn zwischen den beiden Regionen. Die kompakte Gewebe des DG ist durch umfangreiche Neuropil umgeben und umfangreiche Schäden zellulärer Prozesse während Dissoziation auftreten. Ein zweiter wichtiger Punkt ist, dass, während der Neurosphäre Assay kann sinnvoll sein, quantitative Aussagen über die Anzahl der Vorläuferzellen in einem bestimmten Gewebeprobe Gegenwart zu machen, einige Vorsicht ist jedoch bei der Interpretation dieser absoluten Zahlen verwendet werden. Fusion von Neurosphären kann ein wichtiger Störfaktor sein. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Neuronen sind sehr beweglich und kann auch unter welche angeblich &quot;klonalen&quot; Bedingungen 7,19 verschmelzen. Die daraus resultierende Neurosphäre Frequenz kann sehr abhängig von Faktoren, einschließlich der mittelfristigen Komponenten, Verfahren der Präparation und der Dissoziation Prozess sein. Auch zwischen erfahrenen Hand gewisse Variation in der Anzahl der Neurosphären von angeblich identischen Proben erzeugt ist offensichtlich (siehe 1A.) Mehr nützlich, ist ein direkter Vergleich der Vorläuferfrequenz zwischen zwei gegebenen Proben (dh Steuer vs behandelt oder Wildtyp-vs-Knock-out) von der gleichen Person in einem einzigen Experiment behandelt, sondern als eine quantitative Aussage der Gesamt Vorläufer-Zellzahl. Bei der Entscheidung, welche der beiden Kulturverfahren am besten geeignet für ein bestimmtes Experiment ist es wichtig zu beachten, dass diese beiden Kultursysteme unterscheiden sich in der Homogenität der erzeugten Zelltypen. Im Vergleich zu vermehren adhärenten Zellkulturen, die eine ziemlich homogene Vorläuferzellpool (~ 98% der Zellen sind Sox2 +) zeigen 20 sind Neurosphären heterogener und enthalten sowie wuchernden Vorläuferzellen differenzierten Neuronen und Astrozyten 21,22. Es ist wichtig, dass die Neurosphären sind nicht für längere Zeiträume zwischen den Kanälen größer ist als die kultivierten Neurosphären werden, desto wahrscheinlicher ist es, um differenzierte Zelltypen in ihrem Kern zu finden. Wir initiieren traditionell adhärenten Mono neuralen Vorläuferkulturen aus dem DG Gewebe zwischen 5-8 Mäusen. Deshalb, wenn Sie versuchen, die adhärenten Monolayer-Kulturen von der DG oder SVZ von einem einzigen Mausklick zu etablieren, muss die Sorgfalt während der Gewebedissoziation Verfahren, um zu treffen, um übermäßigen Zelltod durch über Verreiben des Gewebes zu vermeiden, oder sich verlängert Zeit zwischen der Präparation und letzten Kultivierungsschritte. Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die Erzeugung von adhärenten Monovorläuferkulturen vor der SVZ und DG einzelner Tiere. Es gibt viele Fälle, in denen der Vergleich der Vorläufer Proliferation und Differenzierung muss auf einem einzigen Tier Basis erfolgen. Dazu gehören die Möglichkeit, direkt zu vergleichen, die DG und SVZ der einzelnen Tiere mit gepaart Statistiken und Daten zur Kultur mit individuellen Verhaltens-oder physiologische Daten 9 koppeln. Einzeltier Kulturen auch alNieder der Einsatz von transgenen Tieren selten, wo alterspass einen Pool von 5-8 Spendern pro Kultur nicht möglich ist, sowie einzigartige Tiere (zB F2 oder Kreuze aus gezüchteten Tieren) für genetische Assoziationsstudien.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 &#181;g/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 &#181;g/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 &#181;g/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 &#181;m sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 &#181;l growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 &#181;l Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 &#181;l growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 &#181;l/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 &#181;l of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 &#181;l of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 &#181;l containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 &#181;m.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does the Figure 1 description in Results.

Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Die Neurosphäre Assay 1,2 und die adhärenten Monolayer-Kultur 3,4, die beide in den frühen 1990er Jahren entwickelt, immer noch der Goldstandard in vitro neuronale Stammzellassays. In diesen Assays wird Primärgewebe Mikro von einer bestimmten Hirnregion seziert, dissoziiert in eine Einzelzellsuspension in Gegenwart von Mitogenen der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor kultiviert-2 (FGF2) zu bilden, freischwimm Cluster (Neurosphären) oder adhärenten Monoschichten. Beide Systeme haben eine Reihe von Vor-und Nachteilen und reiflicher Überlegung sollte auf die Frage, die angesprochen werden, bevor eine oder das andere System gewählt wird, ist gegeben. Neurosphären ermöglichen eine einfache Auslesen der Unterschiede in der Vorläuferzellzahl und Potenzial. Darüber hinaus sind auch Neurosphären ein nützliches Werkzeug zur Festlegung der inneren Zellen zu untersuchen, wenn sie von ihrem normalen Außenumgebung entfernt. Extrinsic Signale können durch einfaches Hinzufügen der Faktor von Interesse in das Wachstumsmedium und zur Quantifizierung der Anzahl und Größe der erzeugten Neurosphären untersucht werden. Der Hauptnachteil der Neurosphären ist jedoch, dass sie ihre eigene Nische bilden, wobei die Zellen in der Mitte der Neurosphären (besonders großen Neurosphären) wobei differenzierter als die auf der Oberfläche 5. Neurosphären enthalten eine Mischung von Stammzellen, Vorläuferzellen gebunden und differenzierten Zellen und die Zell-Zell-Wechselwirkungen in den Neurosphären wirken der Wartung der Stammzellen. Deshalb Neurosphären enthalten nur eine geringe Anzahl von wahren Stammzellen 6-8. Adhärenten Monolayer-Kulturen bieten auch eine gute In-vitro-System, um in vivo die Proliferation zu modellieren. Adhärenten Kulturen, in denen die Zellen bleiben mehr getrennt und homogen ist, kann die heterogene Natur der Neurosphäre zu beseitigen. Unter diesen Wachstumsbedingungen die Vorläuferzellen vermehren rapidly und fast alle Zellen teilen und drücken die charakteristischen Marker Nestin neuralen Vorläufer, Sox2 und BLBP. Der Hauptnachteil der Monokultur-System im Vergleich zu der Neurosphäre Assay ist, dass einzelne Vorläufer abgeleitete Klone werden nicht beobachtet und quantifiziert werden. Ein Nachteil der meisten Protokolle für beide Arten von Kulturen war die Notwendigkeit, eine relativ große Anzahl von Tieren zu verwenden, da die Ausbeute der Isolation Strategien oft schlecht gewesen. Zur gleichen Zeit hat sich gezeigt, dass adulte Neurogenese trägt zur Individualisierung des Gehirns 9, was die Notwendigkeit für individuelle Ex-vivo-Modelle. Diese Bedürfnisse können durch &quot;One-Maus-ein-Kultur&quot; Protokolle wie in diesem Bericht beschrieben erfüllt werden. Die folgende Sicht Protokoll beschreibt die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferkulturen sowohl aus der SVZ und der GD der einzelnen Tiere entweder als haft monolayers oder als Neurosphären. Die Erzeugung von Kulturen von individuellen Tieren ist besonders nützlich, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen behandelten Tier oder verschiedenen individuellen transgenen und Wildtyp-Mäusen erforderlich sind. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die gleichzeitige Mikrodissektion der SVZ und der GD Regionen aus erwachsenen Mäusen, deren Dissoziation in einer Einzelzellsuspension, in-vitro-Kultur als entweder adhärenten Monolayer-Kulturen oder Neurosphären und Analyse von multipotentiality und langfristiges Potenzial, die zwei Kardinal Eigenschaften eines Knochen-fide-Stammzelle.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>Glas Pastuer Pipetten</td><td>Volac</td><td>BS5732</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1:1) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Neuronales Basalmedium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Nahrungsergänzungsmittel (50x)</td><td>Leben Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Penacillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003120</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (mit Calcium und Magnesium)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>Roth X997.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>K39347429847</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen&nbsp;</td><td>Braun</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>27 G Nadeln</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Skalpelle (#22 Einweg)</td><td>Braun</td><td>BA222</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzette</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5/45 Pinzette</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>FST</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Irisspatel</td><td>FST</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Kolben/Vertiefungsplatten</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>PFA (4%)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>NDS</td><td>Millipore</td><td>530</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler bIII-Tubulin-Antikörper für die Maus</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Polyklonaler Antikörper gegen saures Gliafibrilläres Protein</td><td>Dako</td><td>20334</td><td></td></tr><tr><td>O4&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Map2a+b</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Maus Cy3 Antikörper&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-505-151</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen Alexa488&nbsp;</td><td>Dianova</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Polysciences Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Kombispitzen</td><td>Eppendorf</td><td>30089677</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff 10 ml und 25 ml serologische Pipetten</td><td>Corning</td><td>4488/4489</td><td></td></tr><tr><td>AUSRÜSTUNG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra Biosciences</td><td>521942</td><td></td></tr><tr><td>Multidoser Pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; C:5% CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr></tbody></table>

eine maus, zwei kulturen: isolierung und kultur von adulten neuralen stammzellen aus dem zwei neurogene zonen der einzelnen mäuse

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Die Neurosphären Assay und die anhaftende Monoschichtkultur-System sind wertvolle Werkzeuge, um das Potential (Proliferation oder Differenzierung) von adulten neuralen Stammzellen in vitro zu bestimmen. Diese Assays können verwendet werden, um das Potenzial der Vorläuferzellen von genetisch unterschiedlichen oder unterschiedlich behandelten Tieren isoliert zu vergleichen, um die Wirkung von exogenen Faktoren auf neurale Vorläuferzellproliferation und Differenzierung zu bestimmen und um neurale Vorläuferzelllinien, die auf kontinuierliche Passagen untersucht werden können, zu erzeugen. Die Neurosphäre Assay wird traditionell für die post-hoc-Identifizierung Stammzellen verwendet, vor allem wegen der mangelnden endgültigen Marker, mit denen sie von primärem Gewebe isoliert werden und hat den großen Vorteil, dass eine schnelle Schätzung der Vorläuferzellzahlen im Hirngewebe von einzelnen Tieren. Adhärenten Monolayer-Kulturen hingegen sind nicht traditionell verwendet, um die Proliferation zwischen den einzelnen Tieren zu vergleichen, Da jede Kultur wird im Allgemeinen aus dem kombinierten Gewebe zwischen 5-8 Tieren begonnen. Allerdings haben sie den großen Vorteil, dass, anders als Neurosphären, einer überwiegend homogenen Population von Vorläuferzellen bestehen, und sie sind nützlich für die nach der Differenzierung in einzelne Zellen. Hier beschreiben wir im Detail die Erzeugung von Neuro Kulturen und zum ersten Mal, adhärenten Kulturen einzelner Tiere. Das hat viele wichtige Auswirkungen einschließlich gepaart Analyse der Proliferation und / oder Differenzierungspotenzial sowohl in der Subventrikularzone (SVZ) und Gyrus dentatus (DG) der behandelten oder genetisch unterschiedlichen Mauslinien, sowie eine signifikante Reduktion in der Tiernutzung.

Obwohl die beiden neurogenen Regionen des adulten Maushirn enthalten beide neuralen Vorläuferzellen können diese Zellen sehr unterschiedlich verhalten, wenn sie in vitro kultiviert. Die adhärenten Monolayer-Kulturen von beiden Regionen erzielt erscheinen morphologisch (1A), aber die SVZ abgeleiteten adhärenten Kulturen vermehren sich schneller und müssen agiert werden im Durchschnitt 1-2 Tage früher als die von dem DG abgeleitet. Als Neurosphären, die SVZ abgeleiteten Vorläuferzellen schneller proliferieren und auch größer Neurosphären zu bilden (Fig. 1B) als die DG-abgeleiteten Vorläuferzellen (Fig. 1C). Während SVZ abgeleiteten Neurosphären werden in der Regel nach 6-7 Tagen in Kultur gezählt werden abgeleitet DG-Neurosphären in der Regel nach 10 bis 12 Tagen quantifiziert. Zusätzlich ist eine weit größere Anzahl von neuronalen Vorläuferzellen in der SVZ liegen im Vergleich zu der DG, wie durch die nahezu 10-fach höhere Anzahl von Neurosphären, die Gattungen sein kann bewiesenten aus der Region (SVZ: 1.173 ± 74,9 vs DG: 145,3 ± 26,4, p = &lt;0,0001, n = 10 Tiere pro Gruppe; 2A). Studien haben gezeigt, dass die Vorläuferzellen innerhalb des SVZ und DG reagieren auf verschiedene Reize. Die Vorläuferzellen in der DG durch bestimmte Typen von räumlichen Lernen und durch Reize wie Umwelt Anreicherung und Bewegung aktiviert, während die SVZ Vorläuferzellen werden durch Lernen und olfaktorische Geruchs Anreicherung aktiviert. In Übereinstimmung damit, einer von uns (TLW) zuvor gezeigt, dass die GD enthält eine Population von latenten Stamm-und Vorläuferzellen, die durch die Erregung aus 15-18 aktiviert werden können. Im Gegensatz dazu fanden wir, dass die SVZ Vorläuferzellen reagieren sehr unterschiedlich auf diesen Reiz, mit einer Abnahme der Neurosphäre Nummer in Reaktion auf depolarisierenden Stufen von KCl 17. Hier haben wir dieses Experiment wiederholt, Überzug Hälfte der isolierten Zellen aus der SVZ und der GD ind abgeleitetividual Tiere in depolarisierende Ebenen der KCl und die andere Hälfte in Steuer KCl Ebenen. Wir zeigen, wie früher, dass, während die DG-Vorläuferzellen werden durch Depolarisation (101,2 ± 17,4 vs 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 Tiere) aktiviert ist, ist die Verbreitung der SVZ-abgeleiteten Zellen in der Tat deutlich gesunken ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 Tiere; 2B). Um langfristige Potenzial, einer der Kardinal für einen wahren Stammzelle, Einzelneurosphären oder adhärenten Monolayer-Kulturen bestätigen muss in der Lage erweiterte Expansion dh über mindestens 10 Passagen sein. Bei jedem Durchgang nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Anzahl der Zellen wird gezählt, und die Falte Expansion berechnet. Die theoretische Gesamt Zelle wird dann durch Multiplikation des fache Expansion in diesem Durchgang durch die theoretische Gesamt aus dem vorherigen Durchgang berechnet. Dies ist disp<html> als Liniendiagramm mit der Anzahl Durchgang gelegt aufgetragen gegen den log10 der theoretischen Gesamtzellzahl (siehe Beispiel 3). Um multipotentiality bestätigen können beide Monolayer-Kulturen und Neurosphären durch Mitogen Rückzug differenziert und gezeigt Vorrücken in beiden Neuronen geben, und Glia (Abbildung 4). <img alt="Figur 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> .. Abbildung 1 Erwachsener Maus Vorläuferzellen können als adhärente Monolayer-Kulturen (A) oder als Neurosphären (: SVZ, C: B DG) kultiviert werden. Maßstabsleiste ist 50 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Deutlich mehr Neurosphären werden von der SVZ erzeugt im Vergleich zu der DG von einzelnen Mäusen (A). Die SVZ und die GD-Vorläuferzellen reagieren unterschiedlich auf die in-vitro-Depolarisation (B). <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> 3. Um Langzeitpotenzierung bestätigen, werden Neurosphären über 10 Passagen erweitert. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> Abbildung 4. Neurosphären kann in bIII-rohr differenziert werdenlin + Neuronen (A: rot), GFAP + Astrozyten (A: grün), O4 + Oligodendrozyten (B: rot) und MAP2ab + Neuronen (C: rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die gleichzeitige Erzeugung von Kulturen neuronaler Vorläuferzellen als adhärente Monolayer oder Neuro­sphären aus der subventrikulären Zone und dem Gyrus dentatus einzelner erwachsener Mäuse. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einzelner erwachsener Mäuse entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Regionen der subventrikulären Zone und des Gyrus dentatus mikro­chirurgisch zu isolieren.Anschließend wird das Gewebe in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Vorläuferzellen entweder als adhärente Monolayer oder als Neurosphären zu kultivieren. Letztendlich sind der Neurosphären-Assay und das Kultursystem mit adhärenten Monolayern wertvolle Werkzeuge, um das Proliferations- oder Differenzierungspotential adulter neuronaler Stammzellen zu bestimmen.Im In-vitro-Ansatz ermöglicht es uns, einige sehr interessante Fragen auf dem Gebiet der adulten Neurogenese zu untersuchen. Damit können wir Zellen einzelner Tiere betrachten und miteinander vergleichen, was insbesondere im Hinblick auf individuelle Unterschiede oder beispielsweise Unterschiede zwischen einzelnen transgenen oder Knockout-Mäusen im Vergleich zu ihren Kontrollen von Interesse ist. Tara Walker, eine leitende Wissenschaftlerin in meiner Arbeitsgruppe, wird diese Methode vor der Gehirn-Dissektion präsentieren.Bereiten Sie die feuerpolierten Pipetten mit mittleren und kleinen Bohrern vor, indem Sie die Glas-Pasteurpipetten in einer Flamme drehen, bis die Kanten abgerundet sind. Anschließend sterilisieren Sie sie im Autoklaven. Überführen Sie zunächst das Gehirn in eine 10 cm große Kunststoff-Petri-Schale, die PBS enthält.Platzieren Sie eine Petrischale mit dem Gehirn unter einem Stereomikroskop bei niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung, wobei das Gehirn auf seiner ventralen Fl&auml;che liegt. Entfernen Sie anschlie&szlig;end mit feinen gebogenen Pinzetten die Riechkolben, w&auml;hrend Sie das Kleinhirn festhalten. Drehen Sie danach das Gehirn auf die dorsale Seite.Führen Sie mit einem Skalpell einen koronaren Schnitt durch das Gehirn auf der Ebene der Chiasma optica durch, um die SVZ mikrodissektieren zu können. Stellen Sie den rostralen Teil des Gehirns so in die Schale, dass die koronare Schnittfläche nach oben zeigt. Entfernen und verwerfen Sie unter höherer Vergrößerung das Septum.Dann dissezieren Sie die SVZ, eine dünne Gewebeschicht, die das Ventrikel umgibt, indem Sie die Spitze einer der beiden Klingen der feinen gebogenen Pinzette in die seitliche Ecke des Seitenventrikels einführen. Unmittelbar unter dem Balken und mit der anderen Klinge etwa einen Millimeter tief in das dem Ventrikel benachbarte Gewebe eindringen. Drücken Sie die Pinzette nach unten in Richtung der Unterseite der Petrischale und in Richtung der ventralen Seite des Ventrikels, um ein kleines dreieckiges Gewebestück zu entfernen.Danach das präparierte SVZ in eine auf Eis liegende Petrischale geben, um den DEG-Bereich, den kaudalen Teil des Gehirns in der Petrischale, unter dem Präparationsmikroskop mit einem Skalpell entlang des Sulcus longitudinalis zu dissezieren. Das Kleinhirn und das Diencephalon entfernen. Das Mikroskop neu fokussieren, sodass nun die Grenzen um das DG sichtbar sind.Um das DG zu entfernen, setzen Sie die Spitze einer 27-Gauge-Nadel an und führen Sie sie entlang der Grenze zwischen dem Gyrus dentatus (DG) und dem Ammonshorn. Lösen Sie anschließend das DG mit feinen Pinzetten von dem umgebenden Gewebe. Für die Dissoziation des SVZ-Gewebes zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Rasierklinge etwa eine Minute lang, bis keine größeren Stücke mehr vorhanden sind.Dann resuspendieren. Das zerkleinerte Gewebe mit einem Milliliter vorgewärmter 0,05 %igen Trypsin-Lösung in EDTA suspendieren. Anschließend in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen und sieben Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren.Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, geben Sie ein Milliliter Trypsininhibitor, der DNA-Schwan enthält, hinzu und mischen den Inhalt, indem Sie das Gefäß leicht anstoßen. Anschließend pelletieren Sie die Suspension durch Zentrifugation bei 300 Gs für fünf Minuten und eine Narbe. Danach resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Wachstumsmedium und assoziieren Sie durch Gly.Etwa sieben bis zehn Mal mit einer P-1000-Pipette auf und ab pipettieren. Anschließend das Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern ergänzen und die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb filtrieren, um Verunreinigungen und nicht assoziierte Gewebeklumpen zu entfernen. Danach zentrifugieren bei 300 ×g für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und verwerfen Sie ihn. Suspendieren Sie das resultierende Pellet in 200 Mikrolitern Wachstumsmedium für die DG-Gewebedissoziation. Zerkleinern Sie das Gewebe mithilfe einer Skalpellklinge etwa eine Minute lang, bis keine größeren Stücke mehr vorhanden sind.Als Nächstes überführen Sie das zerkleinerte Gewebe in die vorgewärmte PDD-Enzymmischung. Inkubieren Sie es 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und mischen Sie es, indem Sie das Gefäß alle drei bis fünf Minuten vorsichtig umdrehen. Danach dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, indem Sie es vorsichtig zehnmal mit einer mittelgroßen, feuerpolierten Pasteurpipette auf- und abpipettieren. Anschließend wird weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert und alle drei bis fünf Minuten durch leichtes Anstoßen des Gefäßes gemischt. Weiter.Lösen Sie das Gewebe mechanisch auf, indem Sie es vorsichtig zehnmal mit einer kleinen, feuerpolierten Pasteurpipette auf- und abpipettieren. Anschließend zentrifugieren Sie es bei 130 ×g für fünf Minuten. Danach entfernen Sie das Überstand und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Pufferlösung.Fülle mit Pufferlösung auf bis zu 10 Milliliter auf. Nach der Zentrifugation bei 130 ×g für fünf Minuten. Entferne das Überstand-S und resuspendiere das Pellet in fünf Milliliter 20 % pro Zelle.Danach bei 450 ×g für 15 Minuten zentrifugieren. Den Überstand entfernen und das Pellet in 10 Milliliter Puffer resuspendieren. Abschließend bei 130 ×g für fünf Minuten zentrifugieren und das Pellet in 200 Mikroliter Wachstumsmedium resuspendieren; für adhärente Kulturen 200 Mikroliter Zellen je einzelner Vertiefung in eine mit PDL-Laminin beschichtete 96-Loch-Platte ansäen; für Sphärokulturen mit Wachstumsmedium auf 20 Milliliter verdünnen und 200 Mikroliter pro Vertiefung auf eine unbeschichtete 96-Loch-Platte ansäen; danach bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren; nach sechs bis zwölf Tagen Anzahl und Durchmesser der Neurosphären mit einem an ein aufrechtes Lichtmikroskop angeschlossenen IP-Gradiometer erfassen.Diese Abbildung zeigt, dass die Vorläuferzellen von erwachsenen Mäusen als adhärente Monolayerkulturen oder als Neurosphären im SVZ und DG kultiviert werden können. Aus dem SVZ bilden sich signifikant mehr Neurosphären als aus dem DG einzelner Mäuse, und die Vorläuferzellen aus SVZ und DG reagieren zudem unterschiedlich auf eine in-vitro-Depolarisation zur Bestätigung der langzeitigen Potenzierung. Dargestellt ist, dass die Neurosphären über 10 Passagen hinweg expandiert wurden.Neurosphären können in beta-tubulin-III-positive Neuronen (rot dargestellt), GFAP-positive Astrozyten (grün), O4-positive Oligodendrozyten (rot) und MAP2AB-positive Neuronen (rot) differenziert werden, wie anhand dieses Verfahrens gezeigt. Weitere Methoden wie das Verpacken der Zellen oder Neurosphären über mehrere Generationen oder die Differenzierung der Neurosphären gefolgt von einer histologischen Analyse können durchgeführt werden. Dies wird helfen, weitere Fragen hinsichtlich Multivalenz und Langzeitpotenzial zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus der subkallosalen Zone des Mäusegehirns. Dabei geht es um das Präparieren von Gewebe, die enzymatische Dissoziation und die Kultivierung mit Differenzierungsfaktoren, um sich zu reifen Nervenzellen zu entwickeln.

Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subkallosalen Zone der Maus

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Erfahren Sie die Isolierung und Kultur neuronaler Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone und dem Gyrus dentatus adulter Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung adulter Neurogenese und individueller Unterschiede.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse (Video) | JoVE Journal

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

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