Testen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen einfachen Y-Labyrinth-Test zur Untersuchung des Geruchssinns bei Drosophila melon Gaster bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem die Fliegen zunächst 16 bis 18 Stunden lang entwöhnt werden, damit sie motiviert sind, neue Umgebungen mit flüchtigen Reizen zu erkunden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Y-Labyrinth-Aufbau zusammenzustellen, der die Duftquellen auf Filterpapier enthält, beispielsweise Essigsäure in Lösungsmittel im Vergleich zu reinem Lösungsmittel.

Der dritte Schritt besteht darin, die Fliegen schnell und vorsichtig in die Beladegefäße einzubringen. Nach mehreren Stunden erfolgt der letzte Schritt, bei dem die Position der Fliegen im Labyrinth ausgewertet wird. Letztendlich können die Ergebnisse eine Reaktion auf das Duftstoffsignal anhand der mit dem Y-Labyrinth gewonnenen Daten zeigen.

Wir kamen zunächst auf die Idee für diese Methode, als wir beschlossen, eine einfache und kostengünstige Methode zu entwickeln, um die olfaktorische Reaktion von Stämmen zu testen. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Optionen besteht darin, dass sie den Fliegen ermöglicht, eine Entscheidung zu treffen, ohne zu viel Stress ausgesetzt zu sein. Die Durchführung des Verfahrens wird Megan Simon demonstrieren, eine Doktorandin aus meinem Labor. Für dieses Protokoll bereiten Sie eine isogenisierte Fliegenlinie mit stabilen, ausgeprägten Verhaltensphänotypen vor. Jeder solche Stamm kann als Referenzkontrolle für den olfaktorischen Test dienen; kreuzen Sie den zu untersuchenden genetischen Stamm hierfür fünf Generationen lang mit dem Referenzstamm zurück.

Paaren Sie jeweils einzelne Weibchen der experimentellen Stämme mit mehreren isogenen Männchen für jeden Rückkreuzungsschritt. Für olfaktorische Experimente halten Sie die Drosophila auf einem standardmäßigen Maismehlmedium mit einem Antibiotikum unter einem 12:12-Licht-Dunkel-Zyklus und bei 25 Grad Celsius.

Die Experimente sollten stets bei 25 Grad Celsius und unter Licht im fernen Rotbereich, das für Drosophila unsichtbar ist, durchgeführt werden. Es muss zudem möglich sein, den Raum zwischen den Experimenten vollständig zu lüften, bevor am folgenden Morgen der Assay durchgeführt wird. Am Ende des Tages überführen Sie Kolonien von 10 bis 20 experimentellen Linien in Glasgefäße, wobei die Feuchtigkeit durch ein feuchtes Tuch bereitgestellt wird.

Die Fliegen müssen innerhalb von 16 bis 18 Stunden getestet werden, da sie andernfalls aufgrund von Dehydrierung oder Hunger am nächsten Tag sterben könnten. Bauen Sie das Y-Labyrinth zusammen. Beginnen Sie damit, den Y-förmigen Verbinder mithilfe von Schaumstoffverbindern mit abgeschnittenen Pipettenspitzen an zwei Glasgefäße anzuschließen, wodurch die Leitungen entstehen; ihre sich verjüngende Form sorgt dafür, dass es sich um Einwegpassagen handelt.

Der dritte Ast des Y-förmigen Rohres ist mit einem Lade-Röhrchen verbunden, das aus dem größeren Teil einer Pipettenspitze hergestellt ist und ermöglicht den Durchgang von dem Beladegefäß zum Entscheidungspunkt des Labyrinths. Hinter jedem sich verjüngenden Tunnel befindet sich ein Glasgefäß, von denen eines mit einem Duftstoff beladen werden muss. Diese werden als 40 µL-Bolus in 28 mm große Quadrate aus Papiertuch getränkt.

Welcher der beiden den Duftstoff enthält, sollte zufällig wechseln, um den Test zunächst durchzuführen. Kühlen Sie kurz die Fliegen auf Eis ab, damit sie verlangsamt werden. Dies sollte unter fernrotem Licht von LED-Lampen und bei 25 Grad Celsius erfolgen; geben Sie die Fliegenkolonne vorsichtig in die Beladegefäße und laden Sie das Y-Labyrinth mit den Testfliegen.

Verwenden Sie keine Gasanästhesie. Es ist äußerst wichtig, die Fliegen sowohl schnell als auch schonend auf die Beladegefäße zu übertragen. Tatsächlich ist dies der schwierigste Schritt dieses Experiments, da die Fliegen sich rasch erholen müssen, bevor die anderen in der Y-Masse diffundieren.

Die Fliegen sollten 24 Stunden lang das Labyrinth erkunden können, damit eine maximale Anzahl von Fliegen in eines der beiden Glasgefäße wandert. Die Anzahl der Fliegen in den verschiedenen Röhrchen dient zur Berechnung des olfaktorischen Index. Auf diesen Wert, der aus dem Verhalten von bis zu 10 Fliegen gewonnen wird, sollten standardmäßige statistische Methoden angewendet werden.

Wenn 10 Fliegen-Kohorten keine konsistenten Ergebnisse liefern, können die Versuche mit 20 Fliegen-Kohorten durchgeführt werden. Zum Reinigen der Labyrinthbestandteile diese zerlegt über Nacht in RBS 35 MD einweichen. Anschließend erfolgen Spülungen mit Leitungswasser und ein abschließender Spülgang mit entsalztem Wasser, bevor sie luftgetrocknet werden.

Standardreaktionen auf einen Duftstoff. Mithilfe des Y-Labyrinths lassen sich Anziehung, Gleichgültigkeit oder Vermeidung beobachten. Beispielsweise meiden Fruchtfliegen 10 % Essigsäure stark, während sie 10 % Phenylessigsäure nicht meiden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass dieser Wellen-Assay eine künstliche Umgebung für die Fliegen darstellt. Nach Anwendung dieses Verfahrens können Methoden wie Teamkollegen erfüllte Arena- oder Innen-Assays durchgeführt werden, um die olfaktorischen Reaktionen der Fliegen unter verschiedenen Bedingungen zu bestätigen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man olfaktorische Reaktionen von Filano Gaste einfach mit dem SW-Assay testet.