Name: Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der Drosophila Antennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Lernen Sie die Whole Mount Immunfärbung von Drosophila-Antennen zur Visualisierung olfaktorischer Rezeptorneuronen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in molekulare Mechanismen der Neuronendiversifizierung im Riechsystem.

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Diese Studie wurde von MEXT-unterstützte Programm für die strategische Forschungs Stiftung an Privatuniversitäten und JSPS Young Scientist B Zuschuss für HT Wir möchten Ohtake Norihito danken, die Videoclips zu bearbeiten unterstützt.

1. Bereiten Apfel Platte <ol><li> Mischen 12,5 g Agar, 125 ml 100% im Handel erhältlichen Apfelsaft, 12,5 g Glucose und 375 ml H 2 O. Mikrowellen die Mischung für 1 bis 2 Minuten und gießt auf 3 cm Zellkulturschale. Lagern bei 4 ° C </li></ol> 2. Genetische Quer <ol><li> Verwenden Sie die folgenden repräsentativen genetischen Kreuz: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / Cyo x w 1118 3. Dissection und Färbungsprotokoll <ol><li> Anesthetize die Fliege und dann schneiden Sie die Fliege Kopf vertikal, indem Sie sie mit einer Pinzette. </li><li> Legen Sie das Antennen enthaltende Teil auf einer Apfelscheibe. </li><li> Schneiden Sie das dritte Segment der Antenne mit feinen Sezierung Schere. </li><li> Platzieren 90 ul der Fixierungslösung (4% Paraformaldehyd in 0,1% PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100)) zu der Mitte einer Glasboden-Kulturschale. </li><li> Vorsichtig überweisen Sie den seziert antennae mit einer spitzen Nadel direkt an den Fixierungslösung. Wenn nötig, physisch tauchen die Antennen in die Lösung mit Nadel. </li><li> Inkubation für 40 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Antennen in 0,4% PBST (PBS mit 0,4% Triton X-100), 3 x 10 min in jeweils, halten sie in der gleichen Schale. Verwenden gelbe Spitzen zu entfernen und PBST-Lösung hinzufügen. Verwenden 90 ul der Waschlösung jedes Mal. HINWEIS: die Schale legen Sie nicht in einen Shaker während Immunhistochemie. Vor dem Entfernen oder Hinzufügen der Lösung in der Schale, bringen all die Antennen in die Mitte der Schale mit der Nadel und vorsichtig oder entfernen Sie die Lösung vom Rand der Schale. </li><li> Sperrung der Antennen mit 90 &amp;mgr; l von 5% normalem Pferdeserum in 0,1% PBST 20 min bei RT. </li><li> Nach dem Entfernen der Blockierungslösung, Inkubation der Antennen mit 90 &amp;mgr; l primärer Antikörper in 0,1% PBST, enthaltend 5% Pferdeserum für 48 Stunden bei 4 ° C in einem befeuchteten Behälter wie zuvor beschrieben <sbis&gt; 8. </li><li> 6x 10 Minuten in 0,4% PBST waschen die Antennen. </li><li> Inkubieren der Antennen mit 90 ul sekundären Antikörper in 0,1% PBST, enthaltend 5% Pferdeserum für 48 Stunden bei 4 ° C. Mit 0,4% PBST waschen 6x 10 Minuten. </li><li> Um die Antenne zu befestigen, zu entfernen PBST von der Kulturschale so weit wie möglich nach und nach zwei verschiedenen Konzentrationen von Glycerin zu den Antennen einzuführen. Zuerst werden 40% Glycerin in die Schale für 1 bis 2 Minuten; dann entfernen Sie diese, und fügen Sie 80% Glycerin. </li><li> Die Antennen (inkl. 80% Glycerin) vorsichtig Auszug aus der Kulturschale mit gelber Spitze und legen Sie sie auf eine Folie. Sanft statt ein Deckglas auf und Deckglasränder mit Nagellack. Die Antennen sind nun bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Präparation des Drosophila Antennen wir beschreiben, ist einfach und leicht in einer Laborumgebung durchzuführen. Um eine erfolgreiche Präparation zu gewährleisten, ist es unerlässlich, feinkantigen Schere zu nutzen. Während der Immunfärbung seziert Antenne, ist es wichtig, sie in einer feuchtigkeitsgefüllten Behälter, um Verdunstung der Antikörperlösung zu vermeiden inkubieren. Die sezierten Antenne hat eine Tendenz, in der Lösung schweben. Verwendung von 0,1% Triton in PBS während der Fixierung und Blocki...

Das olfaktorische System wird verwendet, um zwischen einer ungeheuren Vielfalt von Geruchsmolekülen zu unterscheiden und anschließend die sich ergebende Information zu den höheren Zentren des Gehirns zu senden. Dieser Eingang wird verwendet, um präzise zu steuern fundamentale Tierverhalten, wie Fütterung und Gegen 1-6. Da jedes Neuron Geruchstyp wird mit einem bestimmten Satz von Gerüchen, die Diversifizierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen verbunden (ORN) s ist für die richtige Funktion olfaktorische System 7. Drosophila-Genetik können wir Einzelzellebene Untersuchung, die molekularen Mechanismen, mit ORN Entwicklung und physiologische Funktion 8-16 zugeordnet sind. Whole Mount-Immunfärbung von Drosophila Antennen hat uns ermöglicht, im Detail zu verstehen, die molekularen Mechanismen bei der Diversifizierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen beteiligt (ORN) s 7. Wir bieten hier eine umfassende Beschreibung einer einfachen Methode, um achieve diese.

<table><tbody><tr><td>Stemi DV4 Seziermikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Bodenkulturschalen aus Glas</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-ELAV</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>7E8A10</td><td>Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Maus Anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ratte IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Verdünnung 1:200</td></tr></tbody></table>

ganze berge immunmarkierung der olfaktorischen rezeptorneuronen in der<em&gt; drosophila</em&gt; antennen

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Duftmoleküle binden an die Zielrezeptoren in einer präzisen und koordiniert. Jeder Rezeptor erkennt ein spezifisches Signal und leitet diese Informationen an das Gehirn. Als solche Bestimmung, wie Geruchsinformation an das Gehirn übertragen, Modifizieren sowohl der Wahrnehmung und des Verhaltens, Vorzüge Untersuchung. Interessanterweise gibt es Anzeichen dafür, dass Zellübertragung und Transkriptionsfaktoren sind in der Diversifizierung der Geruchsrezeptor Neuron beteiligt. Hier bieten wir eine robuste ganze montieren immunologischen Markierungsverfahren, in vivo Geruchsrezeptor Neuron Organisation zu untersuchen. Mit dieser Methode haben wir alle olfaktorischen Rezeptorneuronen identifiziert mit Anti-ELAV Antikörper, einer bekannten pan-neuronalen Marker und Or49a-mCD8 :: GFP, einem Geruchsrezeptor Neuron speziell in NBA Neuron mit Anti-GFP-Antikörper exprimiert.

Sicherzustellen, dass sowohl die Präparation und die Fixierung rasch durchgeführt wird, ein wichtiger Faktor für den Erfolg mit diesem Protokoll. Mit feinen Schere und Pinzette ist auch entscheidend. Nach Immunfärbung wurden fluoreszenzmarkierte Antennen unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. Wir nehmen normalerweise 1 um Abschnitte mit einem 20-fach-Objektiv. Wir markierten NBA 7 ORNs mit Or49a-mCD8 :: GFP und zählte die Anzahl der NBA ORNs in Wildtyp-Antenne. Die mCD8-GFP Reporters Zellmembran lokalis...

Hierin beschreiben wir den Prozess der Ganz-Mount-Immunfärbung von Drosophila-Antennen, der es uns ermöglicht, die molekularen Mechanismen, die an der Diversifizierung von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN) beteiligt sind, besser zu verstehen.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die olfaktorischen Rezeptorneuronen mittels Ganzpräparat-Färbung der Antennen sichtbar zu machen. Betäuben Sie zuerst die Fliege, um ihren Kopf vertikal zu präparieren. Anschließend bringen Sie den präparierten Fliegenkopf auf eine Apfelplatte.Danach schneiden Sie das dritte Segment der Antenne ab und legen es in die Kulturschale mit Glasboden, um eine Immunhistochemie durchzuführen. Nachdem die Antennen auf einem Objektträger montiert wurden, können wir die verschiedenen Typen olfaktorischer Rezeptorneuronen mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar machen. Wir forschen am olfaktorischen System.Das Geruchssystem wird verwendet, um zwischen einer riesigen Vielfalt an Molekülen zu unterscheiden. Die große Bandbreite an unterschiedlichen olfaktorischen Neuronen, die in diesem System existieren, ermöglicht die präzise und koordinierte Weiterleitung von Informationen von Zielrezeptoren zu Neuronen im Gehirn. Heute beschreiben wir die Ganzpräparat-Färbung der Antenne, um die Differenzierung dieser olfaktorischen Rezeptorneuronen nachzuweisen.Um eine erfolgreiche Ganzpräparat- und Antennenfärbung sicherzustellen, ist es entscheidend, unmittelbar vor Beginn des Protokolls eine frische Charge Fixierungslösung herzustellen. Betäuben Sie die Fliege und schneiden Sie dann den Fliegenkopf vertikal durch, indem Sie den Körper mit einer Pinzette halten. Platzieren Sie die präparierte Antenne nun vorsichtig auf einer Apfelplatte.Schneiden Sie das dritte Segment der Antenne mit einer feinen Dissektionspinzette ab. Geben Sie 90 µL Fixierungslösung in die Mitte der Petrischale. Überführen Sie die präparierte Antenne mit einer scharfen Nadel vorsichtig direkt in die Fixierungslösung.Lassen Sie nun die Fixierung 40 Minuten lang bei Raumtemperatur ungestört, um die Fixierung abzuschließen. Waschen Sie die Antennen dreimal mit PBST, wobei jeder Waschschritt 10 Minuten dauert, unter Entfernung der Waschlösung. Bringen Sie zunächst alle Antennen mit einer Nadel in die Mitte der Petrischale.Entfernen Sie anschließend die Lösung von der Seite der Schale. Eine Agitation während der Inkubation ist nicht erforderlich. Zum Vorbereiten der Färbung entfernen Sie die letzte Waschung mit PBST und blockieren Sie die fixierten Antennen, indem Sie die Kammer mit 90 Mikrolitern 5 % Pferdeserum in 0,1 % PBST füllen. Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch Primärantikörper, die in einer Mischung aus 5 % Pferdeserum verdünnt wurden.In PBST werden die primären Antikörper Maus-anti-GFP 1:400 und Ratte-anti-eof verwendet, die auf eine Konzentration von 1:200 verdünnt wurden, um zu verhindern, dass die Antennenproben austrocknen. Legen Sie ein feuchtes Tuch in den Deckel der Kulturschale und wickeln Sie ihn mit Parafilm ein. Stellen Sie dann die Kulturschale in einen Plastikbehälter, der feuchte Tücher enthält.Die Antennen nach 48 Stunden 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius mit den primären Antikörpern inkubieren. Die nicht gebundenen primären Antikörper durch sechs Waschungen in PBST zu je 10 Minuten entfernen. Ähnlich wie bei dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Entfernung des Fixierungsmittels.Nach einer Stunde PBST-Spülungen Sekundärantikörperlösung hinzufügen, die in einer Mischung aus 5 % Pferdeserum in PBST verdünnt ist. In diesem Beispiel handelt es sich bei den Antikörpern um SI zwei Anti-Hasen-IgG und SI drei Anti-Ratte-IgG. Ab diesem Zeitpunkt den Behälter mit Aluminiumfolie abdecken, um eine Fluoro-Vier-Photobleiche zu verhindern. Anschließend die Antennen 48 Stunden bei vier Grad Celsius in der Sekundärantikörperlösung inkubieren.An diesem Punkt ist die Antenne nun bereit zur Montage. Entfernen Sie so viel PBST wie möglich aus der Kulturschale und fügen Sie nach und nach Glycerin zu den Antennen hinzu. Anschließend geben Sie 40 % Glycerin in die Schale und belassen es dort eine bis zwei Minuten lang. Danach entfernen Sie es und geben 80 % Glycerin hinzu, das fünf Minuten lang verbleibt.Die fluoreszenzgefärbte Darstellung zeigte Elof-positive Neuronen und die gezielten olfaktorischen Neuronen. Durch die Kombination dieses Verfahrens mit anderen ähnlichen Methoden, einschließlich der Erzeugung genetischer Mosaiken olfaktorischer Neuronen, hoffen wir, die mechanischen Vorgänge bei der Diversifizierung olfaktorischer Neuronen aufzuklären und andere wichtige wissenschaftliche Fragen zu beantworten.

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Forschung

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