Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der Drosophila Antennen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die olfaktorischen Rezeptorneuronen mit Hilfe der Färbung ganzer Mount-Antennen sichtbar zu machen. Betäuben Sie zuerst die Fliege, um ihren Kopf vertikal zu schneiden. Legen Sie als nächstes den sezierten Fliegenkopf auf eine Apfelplatte.

Schneiden Sie dann das dritte Segment der Antenne ab und legen Sie es auf die Kulturschale mit Glasboden, um eine Immunhistochemie durchzuführen. Nachdem wir die Antennen in ein Objektträgerglas montiert haben, können wir die verschiedenen Arten von olfaktorischen Rezeptorneuronen durch konfokales mikroskopisches hi sichtbar machen. Wir arbeiten an einem olfaktorischen System.

Das olfaktorische System dient dazu, zwischen einer Vielzahl anderer Moleküle zu unterscheiden. Die große Bandbreite an unterschiedlichen Geruchsneuronen, die in diesem System vorhanden sind, ermöglicht die präzise und koordinierte Übertragung von Informationen von Zielrezeptoren zu Neuronen im Gehirn. Heute beschreiben wir die gesamte Färbung der Mount-Antenne, um die Diversifikation dieser Geruchsrezeptor-Neuronen zu erkennen.

Um eine erfolgreiche Färbung der gesamten Halterung und der Antenne zu gewährleisten, ist es wichtig, unmittelbar vor Beginn des Protokolls eine neue Charge Fixiermittel vorzubereiten. Betäuben Sie die Fliege Und schneiden Sie dann den Fliegenkopf senkrecht ab, indem Sie seinen Körper mit einer Pinzette festhalten. Lege nun die zerlegte Antenne vorsichtig auf eine Apfelplatte.

Schneide das dritte Segment der Antenne mit einer feinen Präparierschere ab. 90 Mikroliter Fixierlösung in die Mitte der Schüssel geben. Übertragen Sie die präparierte Antenne mit einer scharfen Nadel vorsichtig direkt in die Fixierlösung.

Lassen Sie nun die Fixierung 40 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur ablaufen, um die Fixierung zu beenden. Waschen Sie die Antennen dreimal mit PBST für 10 Minuten pro Waschgang, während Sie die Waschlösung entfernen. Bringen Sie zuerst alle Antennen mit einer Nadel in die Mitte der Schale.

Entfernen Sie dann die Lösung von der Seite der Schüssel. Rühren während der Inkubation ist unnötig. Um sich auf die Färbung vorzubereiten, entfernen Sie die letzte Wäsche von PBST und blockieren Sie die festen Antennen, indem Sie die Kammer mit 90 Mikrolitern 5%Pferdeserum in 0,1%PBST füllen. Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch Primärantikörper, die in einer Mischung aus 5%Pferdeserum verdünnt sind.

Bei PBST werden primär Anti-GFP-Antikörper für die Maus verwendet, eins zu 400 und anti-eof-Antikörper der Ratte, die auf eine Konzentration von eins zu 200 verdünnt werden, um ein Austrocknen der Antennenproben zu verhindern. Legen Sie ein feuchtes Taschentuch in den Deckel der Kulturschale und umwickeln Sie es mit dem Paraform. Stellen Sie dann die Kulturschale in einen Plastikbehälter mit feuchtem Taschentuch.

Inkubieren Sie die Antennen in den Primärantikörpern nach 48 Stunden 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Reinigen Sie die ungebundenen Primärantikörper mit sechs Waschgängen in PBST für 10 Minuten pro Waschgang. Ähnlich wie das zuvor beschriebene Verfahren zur Entfernung des Fixiermittels.

Nach einer Stunde PBST-Waschungen fügen Sie eine sekundäre Antikörperlösung hinzu, die in einer Mischung aus 5 % Pferdeserum verdünnt ist. In PBST in diesem Beispiel sind die Antikörper SI zwei Anti-Kaninchen-IgG und SI drei Anti-Ratten-IgG. Decken Sie den Behälter von diesem Punkt an mit Alufolie ab, um Fluoro Four zu vermeiden. Beim Photobleaching wird die Antenne anschließend 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius im Sekundärantikörper inkubiert.

Zu diesem Zeitpunkt ist die Antenne nun bereit für die Montage, um die Antenne zu montieren. Entfernen Sie so viel PBST wie möglich aus der Kulturschale und beginnen Sie allmählich, Glycerin in die Antennen einzuführen. Geben Sie anschließend ein bis zwei Minuten lang 40 % Glycerin in das Gericht, entfernen Sie es und fügen Sie 80 % Glycerin hinzu und lassen Sie es fünf Minuten einwirken.

Die Fluoreszenzfärbung zeigte Elof-positive Neuronen und die anvisierten Geruchsneuronen. Durch die Kombination dieses Verfahrens mit anderen ähnlichen Methoden, einschließlich der Generation olfaktorischer Neuronen-Genetik-Mosaike, hoffen wir, die mechanisch steuernde Diversifizierung der olfaktorischen Neuronen zu initiieren und andere wichtige wissenschaftliche Fragen zu beantworten.