Name: Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Kryo-Elektronenmikroskopie zur Strukturbestimmung von Faktor VIII auf Lipid-Nanotubes. Diese Methode kombiniert helikale Organisation mit 3D-Rekonstruktion für strukturbiologische Erkenntnisse.

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10SDG3500034 und UTMB-NZB-Start-up-Fonds zu SSM: Diese Arbeit wird durch einen Nationalen Entwicklungs Scientist Zuschuss von der American Heart Association unterstützt. Die Autoren erkennen die Cryo-EM und Wissenschaftliches Rechnen Einrichtungen des Sealy Zentrum für Strukturbiologie am UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ) sowie Drs. Steve Lüdtke und Ed Egelman Hilfe zu den 2D-und 3D-Wendelrekonstruktionsalgorithmen.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Pufferaustausch menschlichen FVIII-BDD 14 und Schweine-FVIII BDD 15 gegen HBS-Ca-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) und konzentriert, um 1,2 mg / ml. Halten der Proteinlösung bei -80 ° C. </li><li> Vorbereitung Lipidnanotubes (LNT) durch Mischen Galactosylceramid (GC) und Phosphatidylserin (PS) bei 1.04 w / w-Verhältnis in Chloroform. Verdampfe das Chloroform unter Argon und Solubilisierung der Lipide in HBS-Puffer auf 1 mg / ml. Halten Sie die LNT-Lösung bei 4 ° C </li></ol> 2. Kryo-Elektronenmikroskopie von FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Probenvorbereitung <ol><li> Glimmentladung das 300 mesh Quantifoil R2 / 2 Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W. </li><li> Mischen der FVIII und LNT Lösungen in HBS-Ca-Puffer im Verhältnis 1:1 w / w-Verhältnis und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie einen Tropfen 2,5 ulFVIII-LNT Probe auf die hydrophilen Rasterelektronenmikroskopie im Vitrobot Mark IV befeuchteten Kammer (100% Luftfeuchtigkeit). </li><li> Blot und Flash einfrieren das Raster (ein Blot für 3,5 sec, tupfen Kraft 1) in flüssiger C 2 H 6, abgekühlt durch flüssige N 2 zu amorphem Eis zu erhalten. </li><li> Shop Netze in Lagerboxen unter flüssigem N 2 (LN2). </li></ol></li><li> Cryo-EM Data Collection HINWEIS: Die JEM2100-LaB6 (Jahr 2010) wird mit einem TemCon Betriebssystem, bestehend aus einem Computer mit dem Elektronenmikroskop, einem Bildschirm mit Fenstern Lesen der Vakuumanlage, Beleuchtungssystem, HT, Linsenströme und so weiter, und zwei miteinander verbundene ausgestattet Platten: links und rechts, auf beiden Seiten der Säule befindet. Die Strahlverschiebung X-, Y-Knöpfe (SHIFT Y, Y SIFT) und das Multifunktionsgerät (DEF / STIG) Knöpfe sind auf beiden Platten. Auf der linken Seite ist die Beleuchtung (Brigthness) Knopf. Auf der rechten Seite sind: die Vergrößerung (MAG / CAM-Länge) und Fokus (FOCUS) und die drei Knöpfe imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) und ein Beugungs Modi-Tasten (DIFF). Wir erwerben unsere Daten in MAG1 bei alpha 2. Die Mindestdosis Beleuchtungsbedingungen (MDS) für Kryo-EM Datenerfassung erforderlich sind mit F1 bis F6-Tasten, obere Reihe auf der RECHTEN Bedienfeld einstellen. In diesem Protokoll die allgemeinen Einstellungen werden verwendet: F1 - heben / senken Bildschirm, F2 - SEARCH-Modus, F3 - FOCUS Modus F4 - FOTO-Modus F5 - MDS OFF / ON und F6 - BEAM BLANK, verwendet, um die Probe von der Strahlung abschirmen Schäden, die durch Ablenken des Strahls. <ol><li> Legen Sie die Kryo-Halter in die Kryo-Station und füllen Sie den Dewar des Halters und der Kryo-Station mit LN2. Wenn die Temperatur erreicht -192 ° C, offener Blende am Halter Spitze, Platz vorher eingefroren Cryo-EM Gitter in die vorgesehene Stelle und mit einem Klemmring. </li><li> Legen Sie die Kryo-Halter in das Elektronenmikroskop. Füllen Sie den Dewar der Kryo-Halter und dem Anti-contaminator Kammer mit LN2. Warten Sie, bis der Halter für 30-60 min zu stabilisieren. Drücken Sie F6 auf unddrehen Sie den Faden auf. Wenn der Faden gesättigt ist, drücken Sie F6 aus und offener Blende auf Halter, um das Raster zu sehen. </li><li> Presse Low Mag / alpha 1 (bei 200X mag eingestellt), und suchen Bereiche mit dünnen Eis auf dem Netz. </li><li> Wechseln Sie zu MAG 1/alpha 2 bis Mindestdosis (MDS) eingestellt und Cryo-EM-Daten zu erwerben bei niedrigen Elektronendosen, ohne Beschädigung der Probe. <ol><li> Drücken Sie F2, um den Suchmodus eingestellt. Stellen Vergrößerung bei 40.000 x. Vergrößern Strahl mit brigtness Knopf, um minimale Elektronendosis ~ 0,04 E - / Å 2 · s. Presse DIFF zu Beugungsmodus zu wechseln. Stellen Sie die Kamera auf 120 cm Länge mit MAG / CAM LÄNGE Knopf. Suchen Flächen auf dem Gitter in den vorgewählten Bereichen in LOWMAG die Lipid-Nanoröhren in den Löchern des Kohlenstofffilms haben. </li><li> Drücken Sie F4, Foto-Modus bei 40.000-facher Vergrößerung eingestellt und stellen Sie Beleuchtung mit Helligkeitsknopf in Dosen von 16 bis 25 E - / Å 2 · s. Standard-Fokus-Taste drücken, um den Fokus Bedingungen eingestellt Einstellung der Z-Höheder Probe mit der Z-UP / DOWN-Tasten (rechts-Bedienung). Unschärfe-Set zwischen -1.5 und -2.5 um. </li><li> Richten Sie SEARCH und Fotomodus, indem ein Platz in der LIVE-VIEW-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor im Suchmodus entsprechend den in PHOTO-Modus abgebildet werden. </li><li> Drücken Sie F3, um Fokusmodus bei 100.000-facher Vergrößerung eingestellt. Fokus Beleuchtung, um die CCD-Chips decken (ca. 4 - 5 cm Radius) und von der Achse, um die Gegend in PHOTO-Modus abgebildet werden nicht bestrahlen. Stellen Defokus auf ~ -1.5 -2.5 und um mit dem FOCUS-Knopf und korrigieren Astigmatismus des Bildes mit DEF / STIG Knöpfe. </li></ol></li><li> Wählen Sie das FVIII-LNT im SEARCH-Modus durch den Erwerb von Live-Bildern in der Liveansicht-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor abgebildet werden. Zentrieren Sie die FVIII-LNT auf dem Platz auf der Live-View-Fenster gezogen. </li><li> Nehmen Sie ein digitales Bild auf der CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung und 0,5 sec Belichtungs durch Umschalten in den Fotomodus und auf die AcquirE-Taste auf der digitalen Kamera-Aufnahme-Monitor. Die Bildaufnahmebedingungen sind wie die Beam-Blank (TERS) öffnen sich nur, wenn das Bild im Foto-Modus erworben gesetzt. </li><li> Prüfen Sie die Qualität und Defokussierung des aufgenommenen Bildes durch Drücken von STRG-F zu erhalten, eine Fast-Fourier-Transformation (FFT). </li></ol></li></ol> 3. 3D-Rekonstruktion HINWEIS: Die Bildanalyse-Software für die 2D-und 3D-Analyse verwendet: EMAN2 IHRSR und sind frei verfügbar. EMAN2 aus http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install heruntergeladen werden. Egelman@virginia.edu: Die IHRSR Software kann von Professor Egelman erhalten werden. Die endgültigen IHRSR Weiterbildungen sind auf der Texas Advanced Computing Center laufen Cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ an der Universität von Texas, Austin. Die in Fig. 1 dargestellte 3D-Rekonstruktionsalgorithmus besteht aus zwei Schritten: zuerst einen homogenen Satz von helikalen Segmenten (Partikel) mit dem 2D-freien Referenz alignmein EMAN 2 nt (RFA) Algorithmen implementiert, die zweite Erreichen einer 3D-Rekonstruktion auf der Grundlage der Wendel Parameter und Rückprojektionsalgorithmen in IHRSR eingebaut. Der erste Schritt für die Auswahl nutzt die homogene Partikelmengen für die 3D-Rekonstruktion mit Single Particle SPA (Algorithmen), für die EMAN2 wurde speziell entwickelt und vertrieben entwickelten Programme: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Dieser Schritt wurde den Cryo-EM-Daten angepasst. Der zweite Schritt wird mit dem IHRSR Algorithmus, der spezifisch für die Art der Schraubenanordnungen mit den rekombinanten Faktor VIII-Formen erhalten gestaltet erreicht. Dieser Algorithmus ist weitgehend durch die wissenschaftliche Literatur 12 dokumentiert. <ol><li> Führen 2D-Bildanalyse mit dem EMAN2 wissenschaftliche Bildverarbeitungssuite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 bis homogene Partikel (Wendelsegment) Sätze für Wendel Rekonstruktion auswählen. <ol><li> Wählen Cryo-EM mikroskopischen Aufnahmen mit straigmit der Digitalkamera-Software-und Visualisierungstools ht und gut organisierte Wendelrohre. </li><li> Umkehren, normalisieren und Filter für Röntgenbildpunkte in der GUI e2workflow.py, Einzelpartikel Rekonstruktion (spr) Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importieren der invertierten normierten und Röntgen gefilterten Pixelbilder in der e2helixboxer.py GUI. Wählen FVIII-LNT Wendelrohre und Segment bei 256 x 256 Pixel (2,9 Å / pix) mit 90% Überdeckung mit: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Bewerten Sie die Unschärfe-mikroskopische Aufnahmen von den ursprünglichen und gelten Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Korrektur (nur Phasenkorrektur) auf die spiralförmige Segmente aus den gleichen Mikroaufnahmen mit der e2ctf.py Option in der e2workflow.py eingebaut: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Generieren ersten Partikel (Wendelsegmente) setzt in der e2workflow.py GUI - SPR Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Berechnen 2D-Klasse mit Durchschnittswerten der Referenz e2refine2d.py Algorithmus Anwendung kostenlos k-Mittelwert Klassifizierung für einheitliche Datensätze mit dem gleichen Durchmesser LNT und der Grad der spiralförmigen Ordnung (Abbildung 2) zu wählen, nach dem Skript: &quot;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Eingang = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = Phase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = Mittelwert - normproj-classkeepsig &#39;, die Änderung der NCL-Wert entsprechend. <ol><li> Klassifizieren Sie die Anfangsdaten in 150 Klassen NCLs = 151 &#39;über 8 Iterationen mit&#39; classkeep = 0,8 &#39;gesetzt, was bedeutet, dass Partikel mit weniger als 80% Ähnlichkeit zu dem Klassendurchschnitt werden aus der gegebenen Klasse ausgeschlossen. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Merge-Partikel aus der Klasse Mittelwertemit ausgeprägten spiralförmigen Beugungs in e2display.py Zwischendatensatz zu erstellen. </li><li> Klassifizieren Sie die Zwischendaten in 50 Klassen NCLs = 51 &#39;gesetzt, um Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung zu unterscheiden. </li><li> Merge Partikel aus Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung in e2display.py, um die endgültige Datensatz für die dreidimensionale Rekonstruktion zu erstellen: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Führen Sie mit dem spiralförmigen Wiederaufbau Iterative Helical Real Space Wiederaufbau (IHRSR)-Algorithmus, wie in Egelman 17, 18 beschrieben. <ol><li> Schätzung der Anstieg &amp;Dgr; z (Å) des FVIII-LNT Helix aus dem kombinierten Fourier-Transformation der Teilchen in dem endgültigen Datensatz. </li><li> Definieren Sie den Azimutwinkel ΔΦ (º) durch mit einem konstanten Az parallel IHRSR Verfeinerungen, die Erhöhung von 5 ΔΦ76; bis 60 ° in 5 °-Schritten. </li><li> Führen Sie 100 aufeinanderfolgenden Zyklen IHRSR für jeweils endgültige Daten mit einer gesichtslosen Zylinder als ein Anfangsvolumen und den ersten Wendel Parameter Az und ΔΦ wie in 3.2.1 definiert ist. und 3.2.2. </li><li> Überprüfen Sie die letzten Bände für die Konvergenz der Schraubenparameter und Korrespondenz zwischen Klassendurchschnittswerte aus dem 2D-Klassifizierung des Datenkörpers und die Vorsprünge aus der letzten IHRSR Wiederaufbau. </li><li> Symmetrie aufzuerlegen, um den endgültigen 3D-Rekonstruktionen, die der asymmetrischen Einheit in der endgültigen Verteilung asymmetrisch 3D-Volumen beobachtet: 4-fach für den menschlichen FVIII-LNT und 5-fach für Schweine-FVIII LNT. Führen Sie weitere 100 Verfeinerung Zyklen, um eine endgültige symmetrisierten 3D-Rekonstruktion zu erzeugen. </li><li> Berechnen Sie die Fourier Shell Correlation-Kurve für beide Mengen, indem man zuerst die entsprechenden Daten in gerade und ungerade gesetzt: &quot;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Dann führen Sie in Folge 100 IHRSR Verfeinerungen wie in 3.2.3 beschrieben. Berechnen Sie die FSC der 3D-Volumen aus den geraden und ungeraden Datensätze erstellt: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc. </li></ol></li><li> Visualisieren und Segment die FVIII-LNT Volumen in UCSF Schimäre. </li><li><ol><li> Öffnen Sie die letzten Bände von Schritt 3.2.5. in UCSF Chimera und stellen Sie die Kontur Ebene zu 0,005 in der TOOLS&gt; VOLUME DATA&gt; Volume Viewer-Option. </li><li> In TOOLS&gt; VOLUME DATA&gt; SEGMENT MAP, wählen Volumen in SEGMENT Registerkarte MAP und klicken Sie auf Segment zu Segment ist die Lautstärke. </li><li> Konzernsegmente, die einer Einheitszelle, indem Sie mit STRG + SHIFT und Klicken-Gruppe. </li><li> Farbe der Segmente durch Elementarzelle und Helix mit AKTIONEN&gt; COLOR Option, um die Strukturmerkmale betonen. </li></ol></li></ol> 4. Elektronentomographie <ol><li> Negativ gefärbten FVIII-LNT Probenvorbereitung <ol> &lt;li&gt; Bereiten FVIII-LNT Proben wie für die Cryo-EM Experimenten. </li><li> Glimmentladungen kohlenstoffbeschichtete 300-Mesh-Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W für Kryo-EM-Experimenten. </li><li> Geben Sie einen Tropfen 2,5 ul FVIII-LNT Suspension mit 6-nm kolloidalem Gold-Nanopartikel in das Netz, trocknen Sie die überschüssige Flüssigkeit und negativ, indem 5 ul 1% Uranylacetat-Lösung für 2 min färben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit und Luft trocknen das Raster. </li></ol></li><li> Elektronentomographie Data Collection <ol><li> Übertragen Sie das Gitter in den einzelnen Kipphalter. </li><li> Übertragen des Halters in dem Elektronenmikroskop. </li><li> Sammeln Kippserie automatisch mit der Software SerialEM 19 bei 2 °-Schritten in einem Winkelbereich von -60 ° bis +60 ° und die Aufnahme von Bildern mit einer CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung, -6 bis -10 um-Unschärfe und Elektronendosis von 150 - 170 electrons / Å 2 · s pro Schnittbild. </li></ol></li><li> Elektronentomographie Rekonstruktion der FVIII-LNT Hinweis: Rekonstruieren Sie das pFVIII-LNT LNT-und hFVIII gekippt Serie in 4.2 erworben. mit der Möglichkeit, die Software IMOD ETomo nach dem Tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> Mit einem Terminal-Fenster, öffnen Sie das Schnittbild in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin das Tomogramm von 4 mit dem IMOD BINVOL Befehl, um die Größe des Schnittbildes zu verringern. </li><li> Wählen Sie den richtigen Winkel, um den Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse in der klassierten Schnittbild mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL drehen. </li><li> Drehen Sie den vollen Schichtaufnahme mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL. </li><li> Schneiden Sie das ausgewählte Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse mit der CLIP RESIZE Befehl IMOD orientiert. </li><li> Öffnen Sie das zugeschnittene Unterschichtbild mit 3DMOD. </li><li> Klicken Tomogramms, die Anordnung der Faktor VIII-Moleküle entlang visualisierendie Schichten in Z-Achse und entlang der Y-Achse in der Sub-Tomogramm Volumen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Konkurrenz finanzielles Interesse und sie können direkt über eine der in dieser Handschrift veröffentlichten Verfahren kontaktiert werden.

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um zwischen zwei Membrangebundene von hochhomologen Proteinen unterscheiden: Human-und Schweine-FVIII selbstorganisierten auf den Lipidstoffnanoröhren in die Bedingungen im menschlichen Körper auftreten. Bei dem beschriebenen Verfahren, Mensch und Schwein FVIII erfolgreich schraubenförmig auf Lipid-Nanoröhren organisiert, was der wichtigste Schritt ist. Der nächste kritische Schritt ist, um die Probe in dünnen amorph...

Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) ist ein großes Glykoprotein von 2.332 Aminosäuren in sechs Bereiche unterteilt: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Thrombin nach Aktivierung FVIII wirkt als Cofaktor, Faktor IXa in der Membran-gebundenen Tenasekomplex. Die Bindung von FVIII aktiviert (FVIIIa) zu FIXa in einer Membran-je nach Art und Weise verbessert FIXa proteolytischen Effizienz von mehr als 10 5-fache, die entscheidend für die effiziente Blutgerinnung 4 ist. Trotz der wichtigen Rolle FVIII spielt bei der Koagulation und der Tenasekomplexes Bildung, noch die funktionelle Membran-gebundenen FVIII-Struktur gelöst werden. Um dies zu beheben, haben einzelne Lipid-Doppelschicht-Nanoröhren (LNT) reich an Phosphatidylserin (PS), die zur Bindung FVIII mit hoher Affinität 8, 9 und die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnlich entwickelt worden 10. Aufeinanderfolgende spiralförmigen Organisation von FVIII zu LNT gebunden ist erwiesen, wirkungs zu seinve für die Strukturbestimmung von FVIII-Membran-gebundenen Zustand von Cryo-EM-5. Funktionalisierten LNT sind ein ideales System, um Protein-Protein-und Protein-Membran-Wechselwirkungen von spiralförmig organisierten Membran-assoziierten Proteinen, die durch Kryo-EM 11, 12 zu untersuchen. Kryo-EM hat den Vorteil gegenüber herkömmlichen Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie und NMR, als die Probe in der Nähe des physiologischen Umgebung (Puffer, Membran-pH-Wert) erhalten, ohne Additive und Isotope. Im Fall von FVIII, die Untersuchung der Membran-gebundenen Struktur mit dieser Technik ist noch physiologisch relevant, da die LNT ähneln eng durch Größe, Form und Zusammensetzung der Pseudopodien der aktivierten Thrombozyten, wo die Komplexe Tenase Zusammenbau in vivo. Mängel und Mangel an FVIII Ursache Hämophilie A, einer Erkrankung, die schwere Blutungen 1 in 5.000 Männern der menschlichen Bevölkerung 4, 6. Die meisten Eirksame Therapie für Hämophilie A ist lebenslange Verabreichung von rekombinantem humanem FVIII (hFVIII). Eine signifikante Komplikation des rekombinanten FVIII-Hämophilie-A-Therapie ist die Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern gegen den menschlichen Form, die bei etwa 30% der Patienten mit Hämophilie A 13. In diesem Fall wird Schweine-FVIII (pFVIII) Konzentrat verwendet, wie Schweine-FVIII-Displays geringe Kreuzreaktivität mit inhibitorische Antikörper gegen menschliches FVIII und Formen funktionalen Komplexen mit menschlichen FIXa 7. Gründung der membrangebundene Organisation von sowohl Schweine-und Menschen FVIII Formen ist wichtig, die strukturelle Basis von FVIII-Cofaktor-Funktion und Auswirkungen auf Blut Blutstillung zu verstehen. In dieser Studie beschreiben wir eine Kombination von Lipid Nanotechnologie, Cryo-EM-und Strukturanalyse entwickelt, um die membrangebundene Organisation von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen. Die vorgestellten Cryo-EM-Daten und 3D-Strukturen für spiralförmig organisiert porcine und Menschen FVIII auf negativ geladenen LNT zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Nanotechnologie als Grundlage für die Strukturbestimmung von FVIII und Membran-gebundenen Gerinnungsfaktoren und Komplexe in einer physiologischen Membranumgebung.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 mit LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>betrieben bei 200 kV</td></tr><tr><td>mit der TEMCON Software</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Kryo-Halter</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>gekühlt auf -175 &deg; C</td></tr><tr><td>mit Temperiergerät</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan 4K x 4K CCD-Kamera</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4.096 x 4.096 Pixel bei 15 &mu; m/Pixel physikalische Auflösung</td></tr><tr><td>Solarus Modell 950 Plasmareiniger</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon-beschichtetes 300-Mesh-Kupfergitter</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>Plasmareinigung für 10 Sekunden auf</td></tr><tr><td>Hochleistungs-Quantifoil R2/2 300 Mesh</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>Kohlenstoffbeschichtete 300-Mesh-Cu-Gitter mit 2 mm Durchmesser Löcher&nbsp;</td></tr><tr><td>Uranylacetat-Dihydrat</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>1%ige Lösung, gefiltertes</td></tr><tr><td>Galactosyl-Ceramid</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serin</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>EM-Software Digital Micrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM Software EMAN</td><td>kostenloser Download</td><td></td><td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM Software Spider</td><td>kostenloser Download</td><td></td><td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EM Software IHRSR</td><td>kostenloser Download</td><td></td><td>Von Edward H. Egelman verfügbare http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr> <tr><td>EM Software (IMOD)</td><td>kostenloser Download</td><td></td><td><ein href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM Software (SerialEM)</td><td>kostenloser Download</td><td></td><td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>kostenloser Download</td><td></td><td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

helical organisation der blutgerinnungsfaktor viii auf lipid-nanotubes

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) 1 ist ein leistungsfähiges Konzept für die funktionale Struktur von Proteinen und Komplexen in einem hydratisierten Zustand und 2 Membranumgebung zu untersuchen. Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) 3 ist ein Multi-Domain-Blutplasma-Glykoprotein. Defekt oder Mangel an FVIII ist die Ursache für Hämophilie Typ A - eine schwere Blutgerinnungsstörung. Nach der proteolytischen Aktivierung bindet FVIII an den Serin-Protease Faktor IXa auf der negativ geladenen Plättchenmembran, die entscheidend für die normale Blutgerinnung 4 ist. Trotz der zentralen Rolle spielt in FVIII-Koagulation, Strukturinformationen für die Membran-gebundenen Zustand ist unvollständig 5. Rekombinanten FVIII-Konzentrat ist das wirksamste Medikament gegen Hämophilie Typ A und im Handel erhältlichen FVIII als menschliche oder Schweine, beide bildende funktionelle Komplexe mit menschlichem Faktor IXa 6,7 ausgedrückt. &quot;&gt; In dieser Studie stellen wir eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), angewandte Nanotechnologie Lipid-und Strukturanalyse, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen:. Mensch und Schwein Die in unserem Labor entwickelte Methodik schraubenförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT) beschrieben. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass unser Ansatz ist empfindlich genug, um die Unterschiede in der Schrauben Organisation zwischen den beiden hoch homolog in Folge (86% Sequenzidentität zu definieren )-Proteine. Detaillierte Protokolle für die Schrauben Organisation Kryo-EM und Elektronentomographie (ET) Datenerfassung werden. Die zweidimensionale (2D angegeben) und dreidimensionale (3D) Struktur-Analyse angewendet, um die 3D-Rekonstruktionen von Mensch und Schwein erhalten FVIII-LNT wird diskutiert. Die vorgestellten Mensch und Schwein FVIII-LNT Strukturen zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Methodik zur kalkulierte die funktionale, membrangebundene Organisation von Blutgerinnungsfaktor VIII bei hoher Auflösung.

Rekombinante humane FVIII und Schweine wurden erfolgreich spiralförmig organisiert negativ auf einzelne Doppelschicht LNT erhoben, die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnelt. Die spiralförmige Organisation der Mensch und Schwein FVIII-LNT war konsistent durch die gesammelten digitalen Aufnahmen (Abbildung 2). Die Steuerung und der LNT Mensch und Schwein FVIII-LNT Wendelrohre wurden ausgewählt und mit der GUI und e2helixboxer.py anfänglichen Datensätze mit dem e2workflow.py GUI-, Optio...

Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben.

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die Struktur von Faktor-VIII-Heli, die auf Lipid-Nanoröhren organisiert ist, durch Kryo-Elektronenmikroskopie definiert werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst helikalgereinigter Faktor VIII auf Lipid-Nanoröhren organisiert und Kryo-Elektronenmikroskopie-Daten bei flüssigem Stickstoff und niedrigen Elektronendosen gesammelt werden. Als nächstes wird die faktor-VIII-membrangebundene Struktur durch die Kombination von Einzelpartikeln und helikalen 3D-Rekonstruktionsalgorithmen berechnet.Dann werden die Elektronentomographie-Daten gesammelt und die 3D-Rekonstruktion erstellt. Letztendlich werden die berechneten Faktor-VIII-Lipid-Nanoröhren-Strukturen validiert, indem die 3D-Volumina segmentiert und mit den Tomographie-Rekonstruktionen verglichen werden. Die demonstrierte Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Strukturbiologie und Blutgerinnung zu beantworten, z. B. wie die membrangebundene Organisation von Faktor VIII aussieht und wie sie mit seiner Funktion bei der Gerinnung zusammenhängt.Die GM 2100 lab six ist mit einem Bediensystem von TE ausgestattet, das aus einem Rechner besteht, der mit dem Elektronenmikroskop verbunden ist. Auf beiden Paneelen befinden sich ein Bildschirm mit Fenstern für das Vakuumsystem, das Beleuchtungssystem, die HT-Linsenströme und zwei Paneele links und rechts, die auf beiden Seiten der Säule angebracht sind, die Strahlverschiebung, die XY-Knöpfe und die Multifunktions- oder Taubstabknöpfe. Auf der linken Seite befindet sich der Beleuchtungs- oder Helligkeitsknopf.Auf der rechten Seite befinden sich die Vergrößerungs- und Fokusknöpfe sowie die drei Tasten für die Aufnahme von Mag 1, Mag Two und Low Mag sowie eine für den Beugungsmodus. Erfassen Sie für dieses Protokoll Daten in mag eins bei Alpha zwei mit generischen Einstellungen. Stellen Sie die für die Kryo-EM-Datenerfassung erforderliche Mindestdosis, die Beleuchtungsbedingungen (MDS) mit den Tasten F1 bis F in der oberen Reihe des rechten Bedienfelds ein.Verwenden Sie F1, um den Bildschirm anzuheben oder zu senken, F zwei für den Suchmodus und F drei zum Fokussieren. Wählen Sie F vier für den Fotomodus, F fünf zum Aus- und Einschalten des MDS und F sechs für den Strahlblind, der verwendet wird, um die Probe durch Ablenkung des Strahls vor Strahlenschäden zu schützen. Nach der Vorbereitung der Kryo-EM-Proben gemäß dem Textprotokoll setzen Sie den Kryohalter in die Kryostation ein und befüllen Sie mit flüssigem Stickstoff den Halter und die Kryostation.Wenn die Temperatur minus 192 Grad Celsius erreicht, öffnen Sie den Verschluss an der Halterspitze, legen Sie das zuvor eingefrorene Kryo-EM-Gitter an die dafür vorgesehene Stelle und sichern Sie es mit einer Ringklemme. Setzen Sie anschließend den Kryohalter in das Elektronenmikroskop ein und verwenden Sie flüssigen Stickstoff, um den Doer des Kryohalters und der Antiatorkammer nachzufüllen. Nachdem sich der Halter 30 bis 60 Minuten stabilisiert hat, schalten Sie das Filament ein.Wenn das Filament gesättigt ist, drücke F sechs ab und öffne den Verschluss an der Halterung. Um das Raster anzuzeigen, drücken Sie die Tastenkombination alpha one mit niedrigem Gehalt und lokalisieren Sie Bereiche auf dem Raster mit dünnem Eis. Wechseln Sie dann zu mag one alpha two, um die Mindestdosis einzustellen, oder MDS-Modus und erfassen Sie Kryo-EM-Daten bei niedrigen Elektronendosen, um die Probe nicht zu beschädigen.Wählen Sie F zwei, um den Suchmodus einzustellen, und stellen Sie die Vergrößerung auf 40.000 x ein. Verwenden Sie den Helligkeitsregler, um den Strahl auf die minimale Elektronendosis von etwa 0,04 Elektronen pro Angström zum Quadrat mal Sekunden zu vergrößern. Drücken Sie dann Diff, um mit dem Mag-Nockenlängenregler in den Beugungsmodus zu wechseln.Stellen Sie die Kameralänge auf 120 Zentimeter ein. Lokalisieren Sie dann Bereiche auf dem Gitter, die Lipid-Nanoröhren in den Löchern des Kohlenstofffilms innerhalb der vorausgewählten Bereiche aufweisen. Drücken Sie anschließend F vier, um den Fotomodus auf 40.000-fache Vergrößerung einzustellen, und stellen Sie mit dem Helligkeitsregler die Beleuchtung auf Dosen von 16 bis 25 Elektronen pro Angström mal Sekunden ein.Drücken Sie dann die Standard-Fokustaste, um die Fokusbedingungen einzustellen, und stellen Sie die Z-Höhe der Probe mit den Z-Tasten ein. Stellen Sie die Unschärfe zwischen minus 1,5 und minus 2,5 Mikrometern ein. Richten Sie Such- und Fotomodus aus, indem Sie im Suchmodus im Live-View-Fenster auf dem Monitor der Digitalkamera ein Quadrat zeichnen, das dem Bereich entspricht, der im Fotomodus abgebildet werden soll, und drücken Sie F drei, um den Fokusmodus auf 100.000-fache Vergrößerung einzustellen. Fokussieren Sie dann die Beleuchtung, um den CCD-Chip abzudecken und außerhalb der Achse, um den abzubildenden Bereich nicht zu bestrahlen.Stellen Sie im Fotomodus den Unschärfegrad zwischen minus 1,5 und minus 2,5 Mikrometern ein, um bei Bedarf den Astigmatismus des Bildes zu korrigieren. Wählen Sie im Suchmodus die F acht L und T aus, die durch die Aufnahme von Live-Bildern im Live-View-Fenster in der Mitte des Digitalkamera-Monitors aufgenommen werden sollen, die F eight L und T in dem Quadrat, das auf dem Live-View-Fenster gezeichnet wird. Wechseln Sie in den Fotomodus und klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" auf dem Monitor der digitalen Mikrograph-Kamera.Um ein digitales Bild auf der CCD-Kamera aufzunehmen, drücken Sie STRG F, um eine schnelle Fourier-Transformation zu erhalten und die Qualität und Unschärfe des aufgenommenen Bildes zu überprüfen. Nach der Verwendung der kostenlosen wissenschaftlichen Bildverarbeitungssoftware Eman two und I-H-R-S-R zur Durchführung von 2D-Bildanalysen und spiralförmigen Rekonstruktionen gemäß dem Textprotokoll. Um die Volumina F, 8, L und T zu visualisieren und zu segmentieren, öffnen Sie die endgültigen 3D-Rekonstruktionen in den UCSF-Cera-Auswahlwerkzeugen, der Volumendatensegmentkarte, und wählen Sie auf der Registerkarte Segmentkarte das Volumen aus, und klicken Sie auf Segment, um die Volumendaten zu segmentieren.Drücken Sie dann die Tastenkombination "ctrl" und klicken Sie auf "Gruppieren", um Segmente zu gruppieren, die einer Einheitszelle entsprechen. Um die strukturellen Merkmale hervorzuheben, wählen Sie Aktionsfarbe aus, um die Segmente nach Elementarzelle und Spirale einzufärben. Um die Elektronentomographie-Daten zu sammeln, wird das negativ gefärbte Elektronenmikroskopiegitter in einen einzelnen Kipphalter überführt, bevor der Halter in den Elektronenmikroskop-Kipper überführt wird.Serien von verbündet organisierten Schweinefaktor VIII auf Lipid-Nanoröhrchen wurden mit der seriellen EM-Software gesammelt. Gemäß dem Textprotokoll wurde der Tom in IM rekonstruiert und in 3D-Mod visualisiert, um die Größe des zu verwendenden imad bin Val tobin um vier zu verringern, dann verwenden Sie den Befehl IM mod rotate vol, um den richtigen Winkel auszuwählen, um die Lipid-Nanoröhre entlang der Y-Achse zu drehen und den gesamten Tommo mit dem IM-Mod-Clip-Größenänderungsbefehl crop zu drehen. Das ausgewählte Lipid-Nano-Rohr entlang der Y-Achse verwendet 3D-Mod, um den zugeschnittenen Sub-Tommo zu öffnen. Klicken Sie abschließend auf den Tommo Graham, um die Anordnung der Faktor-VII-Moleküle entlang der Schichten in der Z-Achse und entlang der Y-Achse im Sub-Tomo-Volumen zu visualisieren.Wie hier gezeigt, wurden rekombinante humane und schweinische F-Achter erfolgreich auf negativ geladenen Einzeldoppelschicht-LTs organisiert, die der aktivierten Thrombozytenoberfläche ähnelten. Diese Abbildung zeigt, dass die helikale Ordnung der membrangebundenen menschlichen und schweinischen F-Achtel und der Lipiddoppelschicht in den LNT- und F-Acht-LNT-2D-Klasse-Durchschnitten der besten Kontrolle gut definiert ist und zeigt die Variationen in der helikalen Organisation zwischen den beiden Proteinen. Diese Panels stellen die ersten 3D-Rekonstruktionen für die F eight L und T von Mensch und Schwein dar, die mit 1000 repräsentativen Partikeln aus den endgültigen F 8 L- und T-Datensätzen von Mensch und Schwein durchgeführt wurden. Hier zeigen die Foer-Schalen-Korrelationsdiagramme für Mensch und Schwein F eight LNT eine Auflösung von 20,5 Ångström bei einer Fourierschalenkorrelation gleich 0,5 in dieser Abbildung.Die letzten Bände zeigen acht humane F-, Acht- und 10 Schweine-F-Acht-membrangebundene Moleküle, die um die helikale Achse angeordnet sind. Jedes menschliche F-Acht-Molekül wird um 41,2 Ångström translatiert und um 42,0 Grad gegenüber dem vorherigen gedreht, und jedes Schweine-F-Acht-Molekül wird um 35,9 Ångström translatiert und um 35,2 Grad vom vorherigen Molekül gedreht, was den helikalen Parametern der endgültigen 3D-Rekonstruktionen entspricht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Kryo-Elektronenmikroskopie-Daten von braunen Membranproteinen erfassen, die auf Lipid-Nanoröhren organisiert sind, und eine 3D-Struktur berechnen, die dem physiologischen Zustand nahe kommt.Dieses Video ist ein erster Schritt hin zu einer hochauflösenden membrangebundenen Struktur eines Gerinnungsproteins, die auf andere Proteine angewendet werden kann, die in einer Lipidumgebung funktionieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Diese Studie beschreibt eine neue Mikrotiterplatte Assay, FV Gerinnungsaktivität misst während Fibrin Gerinnselbildung in Humanplasma, die zuvor noch nicht gemeldet. Das Verfahren verwendet eine kinetische Mikroplattenleser das kontinuierliche Messen der Änderung der Absorption bei 405 nm während Fibrin Gerinnselbildung in humanem Plasma.

Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

Wir berichten über eine intelligente Anwendung von Kohlenstoffnanoröhren zur kinetischen Stabilisierung von Lipidpartikeln, die selbstorganisierte Nanostrukturen in ihren Kernen enthalten. Die Herstellung von Lipidpartikeln erfordert relativ geringe Konzentrationen von Kohlenstoffnanoröhren, die ihren Einsatz in biomedizinischen Anwendungen wie der Verabreichung von Medikamenten ermöglichen.

Facile Herstellung von Intern Selbstorganisierte Lipidpartikel stabilisiert durch Kohlenstoff-Nanoröhren

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Dieses Dokument beschreibt ein experimentelles Modell der Hämostase, die Thrombozytenfunktion und Koagulation gleichzeitig misst. Blutplättchen- und Fibrin- Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen und die Plättchenadhäsion Rate, Gerinnungsrate und Einsetzen der Gerinnung bestimmt. Das Modell wird verwendet, um die Thrombozyten Prokoagulanz-Eigenschaften unter Strömung in Konzentraten für Transfusions bestimmen.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der endothelialen von Willebrand Faktor Release und das anschließende Plättchen erfassen unter Fluid Schubspannung in Reaktion auf entzündliche Reize mit einer in-Vitro -Fluss-Kammer-System.

Untersuchung von Willebrand Faktor Pathophysiologie mit einem Flow-Kammer-Modell des von Willebrand-Faktor-Thrombozyten String Bildung

Solide unterstützt, eiweißfreie, doppelte Phospholipid Bilayer Membranen (DLBM) können in komplexen und dynamischen Lipid Nanotube Netze umgewandelt werden und können als 2D Bottom-up-Modellen von dem endoplasmatischen Retikulum dienen.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung der Gleitkinesin-Motilität in Verbindung mit riesigen unilamellären Lipidvesikeln.

Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

Diese Studie beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Zellkomponentenanalyse von zerebralen Blutgerinnseln durch Gerinnselauflösung, Zellfärbung und routinemäßige Blutuntersuchung.

Ein umfassender Ansatz zur Analyse der Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln

In-vitro-Thrombolyse-Assays haben oft Schwierigkeiten, In-vivo-Bedingungen zu replizieren, sei es im Modellthrombus, der verdaut wird, oder in der Umgebung, in der die Thrombolyse stattfindet. Im Folgenden untersuchen wir, wie die Kopplung des Chandler-Loops und des Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) für eine hochgenaue Ex-vivo-Überwachung der Gerinnsellyse verwendet wird.

Verfolgung der Fibrinolyse von Chandler-Schleifen-gebildeten Vollblutgerinnseln unter Scherströmung in einem In-vitro-Thrombolysemodell

Diese Arbeit beschreibt einen mikrofluidischen Assay, der Scherspannung nutzt, um die Thrombusbildung im Blut auszulösen, und charakterisiert den Thrombus anhand mehrerer Auswertungsdimensionen. Der Test kann die prothrombotische Tendenz von Blutproben messen und ist daher nützlich für die Krankheitsdiagnose, Arzneimittelentwicklung sowie grundlegende mechanistische Studien im Zusammenhang mit Thrombose.

Thrombusprofiling-Assay: Eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur umfassenden Charakterisierung biomechanischer Thrombogenese

Erfahren Sie die Kryo-Elektronenmikroskopie zur Strukturbestimmung von Faktor VIII auf Lipid-Nanotubes. Diese Methode kombiniert helikale Organisation mit 3D-Rekonstruktion für strukturbiologische Erkenntnisse.

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

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