Die Beurteilung Phagozytische Clearance von Cell Death in Experimental Stroke ligierbaren von Fluoreszenzsonden
27. Mai 2014
Wir präsentieren ein neues Fluoreszenz-Technik für die selektive in situ-Markierung der aktiven Fresszellen, die klar aus Zell Leichen in der Schlaganfall. Der Ansatz ist wichtig für die Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie, da nur ein kleiner Teil der in ischämischen Gehirn vorhanden Phagozyten in der Clearance des Zelltodes beteiligt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, aktive phagozytische Zellen selektiv zu markieren, die bei einem Schlaganfall Zellleichen beseitigen. Dies wird erreicht, indem zunächst Komponenten für die Tite-basierte Signalverstärkungsreaktion vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Abschnitte vorzubereiten.
Als nächstes wird die Markierungsreaktion mit dem Enzym Vaccinia, Topoisomerase und empfindlichen Fluoreszenzsonden durchgeführt. Der letzte Schritt ist die IDE-basierte Fluoreszenzsignalverstärkung. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die phagozytäre Clearance abgestorbener Zellen in Gewebeschnitten der fokalen Hirnischämie zu beurteilen.
Die Beseitigung abgestorbener Zellen durch Fresszellen spielt eine wichtige Rolle bei der Regeneration des Gehirns nach Ischämie. Die vorgestellte Methode bestimmt die Effizienz dieses Prozesses, indem sie nur die Pegogrößen markiert, die aktiv abgestorbene Zellen entfernen. Obwohl diese Methode Einblicke in das ischämische Gehirn bietet, kann sie auch zur Untersuchung ischämischer Verletzungen in anderen Organen und Geweben verwendet werden.
Wo FA die saure Clearance abgestorbener Zellen wichtig ist. Obwohl die IDE-Signalverstärkung oder der TSA-Schritt in der letzten Phase der Markierung erfolgt, kann die Vorbereitung auf diese Reaktion mehr als eine Stunde dauern. Es ist daher bequemer, die TSA-Reagenzien zuerst herzustellen.
Der erste Schritt besteht darin, die Fluoro-Vier-TYROM-Stammlösung mit 300 Mikrolitern DMSO für die Tyrom-Reagenzdateien herzustellen, die im TSA-Kennzeichnungskit enthalten sind. Bereiten Sie anschließend den TNT-Waschpuffer vor, um das blockierende Reagenz vollständig aufzulösen. Wenn Sie den TNB-Blockierungspuffer herstellen, fügen Sie ihn langsam in kleinen Schritten unter Rühren hinzu und erhitzen Sie die Lösung allmählich auf 55 Grad Celsius.
Bei ständigem Rühren erscheint die Lösung milchig und sollte vor der Verwendung von Aliquot auf Raumtemperatur gebracht und für den Langzeitgebrauch bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Für dieses Verfahren werden die Objektträger im Voraus vorbereitet, indem fünf Mikrometer dicke Abschnitte montiert werden. Aus Formalin fixiertem Gewebe geschnitten. Behandeln Sie die Abschnitte zuerst 15 Minuten lang mit Xylol, rehydrieren Sie die Abschnitte durch eine Reihe von Ethanolwäschen, gefolgt von zwei Waschgängen in Wasser.
Stellen Sie als Nächstes die Proteinase K-Arbeitslösung her, indem Sie eine Stammlösung auf 50 Mikrogramm pro Milliliter in PBS verdünnen. Der schwierigste Teil dieses Experiments besteht darin, die ideale Zeitdauer für die Kontrolle der Proteinase-K-Verdauung zu bestimmen, wobei je nach Größe und Art des Gewebes sowohl kürzere als auch längere Verdauungszeiten erforderlich sein könnten, um den Erfolg zu gewährleisten. Geben Sie das entsprechende Volumen der Protein-ACE-K-Arbeitslösung in die Schnitte und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 23 Grad Celsius.
Waschen Sie die Abschnitte nach der Inkubation zweimal für jeweils fünf Minuten in destilliertem Wasser. Bereiten Sie während des Einweichens der Schnitte die Markiermischung vor, die die aktive Sonde enthält. Zur Herstellung der aktiven Sondenlösung werden die Oligonukleotide mit Wasser, einem molaren Triss, HCL und der im Kit enthaltenen Vaccinia-Topoisomerase kombiniert, durch Pipettieren vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Sondenaktivierung zu ermöglichen.
Nehmen Sie nach dem zweiten Waschen die Teile aus dem Glas und saugen Sie das restliche Wasser ab. Wenn Sie fertig sind, tragen Sie die aktive Sondenlösung auf, die zuvor vorbereitet wurde. Schieben Sie die Abschnitte hinein und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 23 Grad Celsius.
Tauchen Sie die Objektträger nach der Inkubation in Wasser, um die Deckfolien vorsichtig zu entfernen. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in Wasser. Nach der letzten Wäsche die Gewebeschnitte mit TNB-Blocking-Puffer abdecken und die Objektträger in einer befeuchteten Kammer 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Bereiten Sie während dieser Zeit eine Verdünnung von 1 bis 100 gestrippten und Meerrettichperoxidase-Konjugaten vor. S-A-H-R-P in den TNB-Blockpuffer, holen Sie die Objektträger heraus und saugen Sie den TNB-Blockpuffer ab. Verwenden Sie vor dem Auftragen der S-A-H-R-P-Lösung so viel Reagenz, dass der gesamte Gewebeabschnitt bedeckt ist.
Sobald sie abgedeckt sind, inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation dreimal für jeweils fünf Minuten. Bereiten Sie in TNT-Waschpuffer bei Raumtemperatur unmittelbar vor der Verwendung eine Verdünnung von 1 bis 50 Fluoro Four TY IDE in einem x Amplifikationsverdünnungsmittel vor. Pipettieren Sie die Lösung auf die Objektträger, die den Gewebeschnitt vollständig bedecken.
Da die Lösung nicht wiederverwendet werden kann, entsorgen Sie alle nicht verwendeten Teile. Inkubieren Sie die Objektträger drei bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Überwachen Sie die Fluoreszenz.
Unter dem Mikroskop so lange steigern, bis zu diesem Zeitpunkt die ersten Hinweise auf Strukturen sichtbar sind. Fahren Sie schnell mit dem Waschschritt fort. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten.
In TNT Puffer bei Raumtemperatur unter Rühren waschen. Nach dem Waschen die Antifading-Lösung mit DPI und Deckglas hinzufügen. Beobachten Sie die Ergebnisse unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Diese Bilder zeigen zwei Beispiele für die saure Clearance von PHA. Die nukleäre Färbung ist in blauer Fluoreszenz dargestellt und die haftbare vac-topo-Sonde ist in grüner Fluoreszenz dargestellt: Diagramme der in diesen Bildern dargestellten Ereignisse zeigen Kerne von Phagozyten und Tic, die zusätzliche Kerne in verschiedenen Stadien der Verdauung verschlungen haben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, wissen Sie, wie Sie haftbare Fluoreszenzsonden in Gewebeschnitten verwenden können. Sie werden auch in der Lage sein, aktive Iden selektiv zu markieren, die abgestorbene Zellen im ischämischen Gehirn entfernen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Fluoreszenztechnik zur selektiven Markierung aktiver phagozytierender Zellen vor, die an der Beseitigung von Zelltrümmern nach einem Schlaganfall beteiligt sind. Die Methode ist entscheidend für das Verständnis der Reaktion des Gehirns auf Ischämie, da nur ein kleiner Anteil der Phagozyten an diesem Räumungsprozess beteiligt ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Die phagozytische Beseitigung abgestorbener Zellen ist für die Regeneration des Gehirns nach einer Ischämie von entscheidender Bedeutung.
- Nur eine Untergruppe der Phagozyten beteiligt sich aktiv an diesem Prozess.
- Das Verständnis dieses Mechanismus kann therapeutische Strategien maßgeblich beeinflussen.
- Die vorgestellte Methode kann ebenfalls auf andere Organe und Gewebe angewendet werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Technik zur selektiven Markierung aktiver Phagozyten.
- Beurteilung der Effizienz des phagozytotischen Abbaus in ischämischem Hirngewebe.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Dynamik des Abbaus von Zelltod.
Verwendete Methoden
- Herstellung der auf Tite basierenden Reagenzien für die Signalverstärkung.
- Markierungsreaktion unter Verwendung von Vaccinia, Topoisomerase und fluoreszierenden Sonden.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung markierter Zellen.
- Optimierung der Proteinase-K-Digestionszeiten für Gewebeschnitte.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Markierung aktiver Phagozyten in ischämischem Hirngewebe.
- Visualisierung der phagozytotischen Aktivität mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode auf andere Gewebe.
- Erkenntnisse über den zeitlichen Ablauf und die Effizienz des phagozytotischen Abbaus.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Technik vertieft das Verständnis phagozytärer Prozesse bei Ischämie.
- Sie stellt ein wertvolles Hilfsmittel zur Untersuchung von Zellbeseitigungsmechanismen dar.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf verschiedene durch Ischämie betroffene Organsysteme ausdehnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die selektive Quantifizierung des aktiven phagozytotischen Abbaus bei experimentellem Schlaganfall ermöglicht die mechanistische Absicherung neuroinflammatorischer Signalwege und unterstützt die Zielvalidierung für Strategien zur Wiederherstellung des ZNS. Diese Methode mit einem anheftbaren fluoreszierenden Sondenstoff bietet eine vorhersagekräftige Sicherheit bei der Beurteilung der Effizienz von Abfall beseitigenden Phagozyten und fördert die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung. Ihre Fähigkeit, aktive von inaktiven Phagozyten zu unterscheiden, verbessert die Portfolio-Entscheidungsfindung für neuroprotektive und regenerative therapeutische Programme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung phagozytischer Clearance-Mechanismen in krankheitsrelevantem Hirngewebe.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Unterscheidung aktiver Phagozyten von Passivzellen.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung neuroinflammatorischer und regenerativer Signalwege.
- Liefert quantitative Daten für eine vorhersagbare Aussagekraft in frühen CNS-Programmen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Gewebeschnitte für nachgeschaltete quantitative Bildgebungsworkflows vor.
- Standardisiert die Detektion aktiver phagozytotischer Vorgänge für reproduzierbare Assayausgaben.
- Ermöglicht die skalierbare Untersuchung von Modulatoren, die die Effizienz der phagozytotischen Clearance beeinflussen.
- Ermöglicht die zuverlässige Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Clearance von Zelltod in situ.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anbindung an krankheitsrelevante Modelle ischämischer Verletzungen zur translationellen Biomarker-Entwicklung.
- Bietet Kontinuität von der mechanistischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Strategien zur Wiederherstellung des ZNS.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung neuroprotektiver und regenerativer Wirkstoffkandidaten.
- Bietet eine prädiktive Entschärfung von Risiken spät auftretender biologischer Belastungen, die mit einem Versagen der Zellbeseitigung zusammenhängen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine quantitative Beurteilung des phagozytotischen Abbaus in Modellen der zerebralen Ischämie ermöglicht und sowohl die Zielvalidierung als auch die translationale Biomarker-Abstimmung unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur phagozytenvermittelten Clearance und Aufklärung von Signalwegen in ischämischem Gewebe.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte aktiver phagozytärer Vorgänge für die Assay-Entwicklung.
- Analytik: Bietet fluoreszenzbasierte Messungen, um die Clearance-Effizienz unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischen Modellen, die für zentrale Nervensystemverletzungen und die Erholung relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der phagozytären Clearance in unterschiedlichen Gewebe- und Krankheitskontexten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung zentralnervöser Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Quantifizierung phagozytotischer Clearance für Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz, indem biologische Risiken frühzeitig geklärt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung neuroinflammatorischer und regenerativer Programme.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenzmikroskopie und der Gewebeschnittpräparation.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Reagenzien, einschließlich ligierbarer fluoreszenter Sonden und Enzymsets.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Markierung und Bildgebung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- An verschiedene Gewebetypen anpassbar, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung der Verdauungs- und Markierungsschritte.
- Hängt von der genauen Kontrolle enzymatischer Reaktionen und bildgebender Parameter für quantitative Ergebnisse ab.
