Die Beurteilung Phagozytische Clearance von Cell Death in Experimental Stroke ligierbaren von Fluoreszenzsonden
May 27th, 2014
Wir präsentieren ein neues Fluoreszenz-Technik für die selektive in situ-Markierung der aktiven Fresszellen, die klar aus Zell Leichen in der Schlaganfall. Der Ansatz ist wichtig für die Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie, da nur ein kleiner Teil der in ischämischen Gehirn vorhanden Phagozyten in der Clearance des Zelltodes beteiligt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, aktive phagozytische Zellen selektiv zu markieren, die bei einem Schlaganfall Zellleichen beseitigen. Dies wird erreicht, indem zunächst Komponenten für die Tite-basierte Signalverstärkungsreaktion vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Abschnitte vorzubereiten.
Als nächstes wird die Markierungsreaktion mit dem Enzym Vaccinia, Topoisomerase und empfindlichen Fluoreszenzsonden durchgeführt. Der letzte Schritt ist die IDE-basierte Fluoreszenzsignalverstärkung. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die phagozytäre Clearance abgestorbener Zellen in Gewebeschnitten der fokalen Hirnischämie zu beurteilen.
Die Beseitigung abgestorbener Zellen durch Fresszellen spielt eine wichtige Rolle bei der Regeneration des Gehirns nach Ischämie. Die vorgestellte Methode bestimmt die Effizienz dieses Prozesses, indem sie nur die Pegogrößen markiert, die aktiv abgestorbene Zellen entfernen. Obwohl diese Methode Einblicke in das ischämische Gehirn bietet, kann sie auch zur Untersuchung ischämischer Verletzungen in anderen Organen und Geweben verwendet werden.
Wo FA die saure Clearance abgestorbener Zellen wichtig ist. Obwohl die IDE-Signalverstärkung oder der TSA-Schritt in der letzten Phase der Markierung erfolgt, kann die Vorbereitung auf diese Reaktion mehr als eine Stunde dauern. Es ist daher bequemer, die TSA-Reagenzien zuerst herzustellen.
Der erste Schritt besteht darin, die Fluoro-Vier-TYROM-Stammlösung mit 300 Mikrolitern DMSO für die Tyrom-Reagenzdateien herzustellen, die im TSA-Kennzeichnungskit enthalten sind. Bereiten Sie anschließend den TNT-Waschpuffer vor, um das blockierende Reagenz vollständig aufzulösen. Wenn Sie den TNB-Blockierungspuffer herstellen, fügen Sie ihn langsam in kleinen Schritten unter Rühren hinzu und erhitzen Sie die Lösung allmählich auf 55 Grad Celsius.
Bei ständigem Rühren erscheint die Lösung milchig und sollte vor der Verwendung von Aliquot auf Raumtemperatur gebracht und für den Langzeitgebrauch bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Für dieses Verfahren werden die Objektträger im Voraus vorbereitet, indem fünf Mikrometer dicke Abschnitte montiert werden. Aus Formalin fixiertem Gewebe geschnitten. Behandeln Sie die Abschnitte zuerst 15 Minuten lang mit Xylol, rehydrieren Sie die Abschnitte durch eine Reihe von Ethanolwäschen, gefolgt von zwei Waschgängen in Wasser.
Stellen Sie als Nächstes die Proteinase K-Arbeitslösung her, indem Sie eine Stammlösung auf 50 Mikrogramm pro Milliliter in PBS verdünnen. Der schwierigste Teil dieses Experiments besteht darin, die ideale Zeitdauer für die Kontrolle der Proteinase-K-Verdauung zu bestimmen, wobei je nach Größe und Art des Gewebes sowohl kürzere als auch längere Verdauungszeiten erforderlich sein könnten, um den Erfolg zu gewährleisten. Geben Sie das entsprechende Volumen der Protein-ACE-K-Arbeitslösung in die Schnitte und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 23 Grad Celsius.
Waschen Sie die Abschnitte nach der Inkubation zweimal für jeweils fünf Minuten in destilliertem Wasser. Bereiten Sie während des Einweichens der Schnitte die Markiermischung vor, die die aktive Sonde enthält. Zur Herstellung der aktiven Sondenlösung werden die Oligonukleotide mit Wasser, einem molaren Triss, HCL und der im Kit enthaltenen Vaccinia-Topoisomerase kombiniert, durch Pipettieren vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Sondenaktivierung zu ermöglichen.
Nehmen Sie nach dem zweiten Waschen die Teile aus dem Glas und saugen Sie das restliche Wasser ab. Wenn Sie fertig sind, tragen Sie die aktive Sondenlösung auf, die zuvor vorbereitet wurde. Schieben Sie die Abschnitte hinein und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 23 Grad Celsius.
Tauchen Sie die Objektträger nach der Inkubation in Wasser, um die Deckfolien vorsichtig zu entfernen. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in Wasser. Nach der letzten Wäsche die Gewebeschnitte mit TNB-Blocking-Puffer abdecken und die Objektträger in einer befeuchteten Kammer 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Bereiten Sie während dieser Zeit eine Verdünnung von 1 bis 100 gestrippten und Meerrettichperoxidase-Konjugaten vor. S-A-H-R-P in den TNB-Blockpuffer, holen Sie die Objektträger heraus und saugen Sie den TNB-Blockpuffer ab. Verwenden Sie vor dem Auftragen der S-A-H-R-P-Lösung so viel Reagenz, dass der gesamte Gewebeabschnitt bedeckt ist.
Sobald sie abgedeckt sind, inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation dreimal für jeweils fünf Minuten. Bereiten Sie in TNT-Waschpuffer bei Raumtemperatur unmittelbar vor der Verwendung eine Verdünnung von 1 bis 50 Fluoro Four TY IDE in einem x Amplifikationsverdünnungsmittel vor. Pipettieren Sie die Lösung auf die Objektträger, die den Gewebeschnitt vollständig bedecken.
Da die Lösung nicht wiederverwendet werden kann, entsorgen Sie alle nicht verwendeten Teile. Inkubieren Sie die Objektträger drei bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Überwachen Sie die Fluoreszenz.
Unter dem Mikroskop so lange steigern, bis zu diesem Zeitpunkt die ersten Hinweise auf Strukturen sichtbar sind. Fahren Sie schnell mit dem Waschschritt fort. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten.
In TNT Puffer bei Raumtemperatur unter Rühren waschen. Nach dem Waschen die Antifading-Lösung mit DPI und Deckglas hinzufügen. Beobachten Sie die Ergebnisse unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Diese Bilder zeigen zwei Beispiele für die saure Clearance von PHA. Die nukleäre Färbung ist in blauer Fluoreszenz dargestellt und die haftbare vac-topo-Sonde ist in grüner Fluoreszenz dargestellt: Diagramme der in diesen Bildern dargestellten Ereignisse zeigen Kerne von Phagozyten und Tic, die zusätzliche Kerne in verschiedenen Stadien der Verdauung verschlungen haben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, wissen Sie, wie Sie haftbare Fluoreszenzsonden in Gewebeschnitten verwenden können. Sie werden auch in der Lage sein, aktive Iden selektiv zu markieren, die abgestorbene Zellen im ischämischen Gehirn entfernen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Fluoreszenztechnik zur selektiven Kennzeichnung aktiver phagozytärer Zellen vor, die an der Beseitigung von Zellkörpern bei Schlaganfall beteiligt sind. Die Methode ist entscheidend für das Verständnis der Hirnreaktion auf Ischämie, da nur ein kleiner Teil der Phagozyten an diesem Bereinigungsprozess beteiligt ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Die phagozytäre Beseitigung toter Zellen ist für die Erholung des Gehirns nach Ischämie lebenswichtig.
- Nur eine Untergruppe der Phagozyten ist aktiv an diesem Prozess beteiligt.
- Das Verständnis dieses Mechanismus kann therapeutische Strategien beeinflussen.
- Die vorgestellte Methode kann auch auf andere Organe und Gewebe angewendet werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Technik zur selektiven Kennzeichnung aktiver Phagozyten.
- Bewertung der Effizienz der phagozytären Beseitigung in ischämischem Hirngewebe.
- Erkenntnisse über die Dynamik der Zelltodbeseitigung.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Komponenten der Tite-basierten Signalverstärkungsreaktion.
- Kennzeichnungsreaktion unter Verwendung von Vaccinia, Topoisomerase und fluoreszierenden Sonden.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der markierten Zellen.
- Optimierung der Proteinase-K-Verdauungszeit für Gewebeschnitte.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kennzeichnung aktiver Phagozyten in ischämischem Hirngewebe.
- Visualisierung der phagozytären Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie.
- Demonstration der Anwendbarkeit der Methode auf andere Gewebe.
- Erkenntnisse über den Zeitpunkt und die Effizienz der phagozytären Beseitigung.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Technik verbessert das Verständnis der phagozytären Prozesse bei Ischämie.
- Sie bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Zellbeseitigungsmechanismen.
- Zukünftige Anwendungen können sich auf verschiedene von Ischämie betroffene Organsysteme erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Selective quantification of active phagocytic clearance in experimental stroke enables mechanistic de-risking of neuroinflammatory pathways and informs target validation for CNS recovery strategies. This ligatable fluorescent probe method provides predictive confidence in assessing the efficiency of waste-management phagocytes, supporting translational continuity from discovery to preclinical research. Its ability to distinguish active from inactive phagocytes enhances portfolio decision-making for neuroprotective and regenerative therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phagocytic clearance mechanisms in disease-relevant brain tissue.
- Supports functional target validation by distinguishing active phagocytes from bystanders.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroinflammatory and regenerative pathways.
- Provides quantitative data for predictive confidence in early-stage CNS programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue sections for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes detection of active phagocytic events for reproducible assay outputs.
- Enables scalable screening of modulators affecting phagocytic clearance efficiency.
- Supports reliable evaluation of compound effects on cell death clearance in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of ischemic injury for translational biomarker development.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of CNS recovery strategies.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for neuroprotective and regenerative candidates.
- Offers predictive de-risking for late-stage biological liabilities related to cell clearance failure.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative assessment of phagocytic clearance in brain ischemia models, supporting both target validation and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on phagocyte-mediated clearance and pathway clarification in ischemic tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of active phagocytic events for assay development.
- Analytics: Provides fluorescence-based measurements to compare clearance efficiency across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models relevant for CNS injury and recovery.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying phagocytic clearance in diverse tissue and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes phagocytic clearance quantification for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroinflammatory and regenerative programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and tissue section preparation.
- Needs access to specialized reagents, including ligatable fluorescent probes and enzyme kits.
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to various tissue types but may require optimization of digestion and labeling steps.
- Dependent on precise control of enzymatic reactions and imaging parameters for quantitative outputs.
