Name: Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Analyse von Fluoreszenzmikroskopie-Bildern mit der PhenoRipper-Plattform. Diese Methode ermöglicht effiziente phänotypische Profilierung bei Hochdurchsatz-Screenings.

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Wir danken Adam Coster und alle anderen Mitglieder der Altschuler und Wu Labors für hilfreiche Rückmeldungen und Diskussionen. Diese Forschung wurde durch das National Institute of Health gewährt R01 GM085442 und CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) und die Welch Foundation I-1619 (SJA) und I-1644 (LFW).

1. Vorbereiten Proben und Imaging <ol><li> Zellkultur <ol><li> Split Kulturen routinemäßig und zu halten, bei 20-70% Konfluenz. Einen Tag vor dem Experiment, wachsen HeLa-Zellen in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle Medium, siehe Tabelle der Materialien) und mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1x Penicillin / Streptomycin. </li><li> Am Tag des Experiments geteilten Zellen, die in Kultur (ca. 50% konfluent). </li><li> Waschen der Zellen mit PBS (Phosphate Buffered Saline) freizulegen, um etwa 2 ml Trypsin / EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) für einige Sekunden. Saugen Sie überschüssige Trypsin / EDTA und halten Zellen in einem dünnen Film von Trypsin / EDTA in der Kapuze bei RT für ca. 3 Min. gebadet. </li><li> Mechanisch Kolben zweimal schütteln und lösen Zellen mit Serum Medien. Zählen von Zellen und verdünnt auf 5.000 Zellen/50 ul Medium und sofort Platte 50 ul / Vertiefung auf einer Bodenplatte 384-Well-Glas mit Hilfe eines automatisierten Liquid-Handling-Roboter (nur 30 guts der Platte verwendet werden, hier). </li><li> Inkubieren Platte bei Raumtemperatur 30 min auf Randeffekte in den Vertiefungen 5 zu minimieren. Nach RT Inkubation Ort Platten in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Jedes Medikament wird doppelt getestet werden. Hinzufügen von 25 ul Arzneimittel mit den entsprechenden Vertiefungen auf der Platte bereits enthaltenden Medien. </li><li> Fix Platte mit 4% Paraformaldehydlösung in PBS bei 24 h nach der medikamentösen Behandlung. </li></ol></li><li> Die Färbung Die spezifischen primären Antikörpern, fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und andere fluoreszierende Flecken, die hier verwendet wurden, sind in Tabelle von Materialien aufgeführt. <ol><li> Durchdringbar fixierten Zellen mit 0,2% Triton X-100-Lösung in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) für 3 min, und wasche mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung + Tween 20) 3x. Plus 5% BSA (Rinderserumalbumin) in TBST-Lösung zum Blockieren. </li><li> Inkubieren Platte bei RT für 2 Stunden und dann mit TBST 3x waschen. </li><li> Machen primären Antikörper DILUTIonen in 5% BSA in TBST (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 10 ul /. Inkubieren Platte bei RT für 2 Stunden, und dann waschen 3x mit TBST. </li><li> Machen sekundären Antikörper dilutionin 5% BSA in TBST (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 10 ul /. </li><li> Inkubieren Platte im Dunkeln bei RT für 2 Stunden und dann zweimal mit TBST waschen. </li><li> Verdünnungen für Hoechst und Phalloidin (siehe Tabelle der Materialien) in PBS und fügen Sie 10 ul /. </li><li> Die Platte in der Dunkelheit für 30 min bei RT. </li><li> Nach 2 TBST Waschanlagen, Deckplatten in Folie und bei 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Erwerben Sie Bilder mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20fach-Objektiv mit 1x1 Binning-Kamera. Erwerben sechzehn Bilder für jeden gut, für insgesamt 480 Bilder (x3 Kanäle). </li></ol> 2. Analyse Images Downloaden und installieren Sie PhenoRipper von phenoripper.org und starten PhenoRipper um die Analyse der ima beginnenges. PhenoRipper unterstützt derzeit TIFF, PNG und JPEG und alle anderen von MATLAB unterstützten Formate (Mikroskop-Software unterstützen in der Regel den Export in TIFF). 2.1 Laden von Daten <ol><li> Kein Standard-Namens / Organisation Konvention für Mikroskopie-Bilder, die das Laden von Bildern und Zuordnen von Metadaten machen existiert (dh experimentellen Annotation wie Art der Behandlung, gut Nummer und so weiter) der schwierigste Teil des Workflows. Wählen eines der vorgestellten Verfahren (unten beschrieben). <ol><li> PhenoLoader: Wählen Sie diese Option, um semi-automatisch zu laden, Daten, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder wie gewünscht (zB B16 HeLa_Drug5-DAPI.png könnte darauf hindeuten, dass das Bild von gut B16, werden die Zellen behandelt mit der Droge, deren ID 5, und das Bild fängt die Kern DAPI-Färbung - mit dieser Namenskonvention konnten alle Bilder von A1 oder auch mit Medikamenten behandelt, 5 leicht zusammengefasst werden). Der Assistent wirdführen den Benutzer Schritt für Schritt, um Metadaten mit Bildgruppen zuordnen und definieren die Marker wie folgt: <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Dateistruktur&quot;, um zum Fenster PhenoLoader zugreifen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Definieren Root Directory&quot;, um das Verzeichnis, das die Bilddatensatz zu wählen. Dann für die Analyse (optional, kann leer gelassen werden) die Dateien auswählen, die nicht verwendet werden (nicht verwendete Dateien). </li><li> Klicken Sie auf &quot;Definieren Marker&quot;, um die im Experiment verwendeten Biomarker geben und sie mit den Bildern. Insbesondere, klicken Sie auf eine Bilddatei und wählen Sie dann einen Teil des Dateinamens, die die Biomarker eindeutig identifiziert. Schließlich geben Sie einen Namen für die einzelnen Biomarker. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Definieren von Metadaten&quot;, um Informationen mit jedem Bild zuordnen. Insbesondere, klicken Sie auf eine Bilddatei, und wählen Sie dann einen Teil des Dateinamens identifiziert Bildinformationen (zB &quot;B16&quot; für das Wohl Name). Ein Fenster fragt nach einem Gruppennamen (zB &quot;Wirll &quot;) erscheint, geben Sie einen Namen ein. Mitglieder der Gruppe aus dem Dateinamen extrahiert wird auf dem Gruppentisch (gezeigt werden, z. B. die vollständige Liste der gut Namen). Um nicht im Dateinamen vorhanden zusätzliche Informationen hinzuzufügen, klicken Sie auf&quot; (optional) Weiter &quot;. Klicken Sie auf&quot; Hinzufügen von Metadaten-Gruppe &quot;, geben Sie das zusätzliche Gruppennamen (z. B.&quot; Drug &quot;) und für jeden Wert der vordefinierten Gruppe (zB&quot; Gut &quot;), geben Sie seinen Wert (zB&quot; Taxol &quot;) . Es gibt keine Begrenzung für die Anzahl der zusätzlichen Gruppen, die hinzugefügt werden können. </li><li> Anschließend klicken Sie auf &quot;Erstellen MetaDataFile&quot;, um die Metadaten-Datei zu erzeugen, und weiterhin die. Wenn eine Metadatendatei vorher erzeugt wurde, können die oben beschriebenen Schritte durch direkte Laden der Datei mit der Option &quot;Metadaten Datei&quot; (in 3 unten beschrieben) vermieden werden. </li></ol></li><li> Regular Expression Basierend Vorlagen: Reguläre Ausdrücke sind ein Standardansatz für die passenden Musternin Text. Wählen Sie diese Option, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder und die Namenskonvention mit einem der bereits vorhandenen Vorlagen. Benutzerdefinierte Vorlagen basierend auf regulären Ausdrücken können auch manuell definiert und wiederverwendet werden. Diese erweiterte Option ist nur für Benutzer mit regulären Ausdrücken vertraut empfohlen. </li><li> Metadaten Datei: Wählen Sie diese Option für die ultimative Anpassbarkeit. Definieren und laden eine durch Komma getrennte Werte (CSV)-Datei mit Dateinamen und Metadaten mit jedem Bild zugeordnet. Ein Beispiel für das Dateiformat ist auf der Download-Teil der Website (phenoripper.org) zur Verfügung. Laden Sie einfach die Datei über die Schnittstelle, um die darin enthaltenen Informationen anzuzeigen. </li></ol></li><li> Wählen Sie das Feld Metadaten, die Wiederholungen definiert, in dem Versuch, um redundante Probenahme zu vermeiden. Für Datensätze, die Wiederholungen (zB alle Bilder in einem gut ähnlich sein sollten) enthalten, zusammen Gruppierung (zB durch gut) kann improve Leistung. In den meisten Fällen ist es sinnvoll, die Standardoption &quot;Random (weiß nicht)&quot;, die eine Teilmenge wählt zufällig zu wählen. </li></ol> 2.2 Einstellen von Analyseparametern Klicken Sie auf &quot;Set Parameter&quot;, die erforderlich ist, um die Datenmenge zu verarbeiten Parameter definieren. Die Parameter zu definieren, sind auf der linken Seite durch. Das rechte Bild zeigt eine zusammengeführte Stichprobe des Datensatzes. Klicken Sie auf die Pfeile links / rechts, um zwischen den verschiedenen Bildern zu wechseln. <ol><li> Threshold Intensität: Wählen Sie einen geeigneten Schwellenwert auf rund identifizieren die Zellbereiche (statt der Hintergrund, zellulären Regionen) der Bilder. Ein Schwellenwert wird durch PhenoRipper vorberechnet, kann aber angepasst werden, um Hervorhebung von Zellregionen zu verbessern mit Hilfe der Bildlaufleiste auf der Oberseite des Bild werden. Wenn eine gewählte Schwelle nicht auf allen Bildern zu arbeiten, die Schwelle so zellulären Regionen anstatt abzufallen zellulären Regionen zu schließen. </li><li> Block-Size: Wählen Sie eine geeignete Blockgröße (in Pixeln) der Netz das Bild. Blöcke der bestimmten Größe auf dem Bild überlagert werden. Passen Sie die Blockgröße auf einen Durchschnitt von 20 bis 30 Blöcke / Zelle zu erhalten. Um das Gitter auf das Bild, klicken Sie auf das Kästchen vor dem Feld &quot;Block Size&quot; überlagern. </li><li> Optionale Parameter: Wenn die Auto-skalierte Bilder nicht Marker mit der gewünschten relativen Intensitäten (zB eine Farbe gesättigt ist) anzeigen oder wenn Markierungen müssen von der Analyse fallen gelassen werden, verwenden Sie das &quot;Anpassen Kanal Intensity&quot;-Option. Um zelluläre Regionen identifizieren auf einer Teilmenge von Markern benutzen Sie die &quot;Kanäle für Threshold verwendet&quot;-Option. Standard-Optionen der anderen Parameter sind in der Regel ausreichend, aber wenn nötig, mit Hilfe der &quot;Advanced Analysis Options&quot; anpassen. </li><li> Führen Sie die Analyse durch Drücken von &quot;PhenoRip&quot; auf der Hauptplatte. PhenoRipper automatisch wiederkehrende Blocktypen in den Bildern zu identifizieren. Phänotypische Profile werden für erzeugt werdenjedes Bild auf der Basis der Anteile der verschiedenen Blocktypen darin. </li></ol> 3. Explo Ergebnisse <ol><li> Entdecken Sie die Beziehungen zwischen den phänotypischen Profile der Bilder mit der PhenoBrowser (Abbildung 1). Die PhenoBrowser Schnittstelle besteht aus vier Tafeln: die linke obere Platte ist eine grafische Darstellung (Streudiagramm) der relativen Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Bilder / Bedingungen, die beiden Platten auf der rechten Display-Beispiel-Bilder von ausgewählten Bedingungen und der abschließenden Podiums (Balkendiagramm ) vergleicht deren phänotypische Profilen. </li><li> &quot;Verwerfen Leere Frames&quot; über das Menü &quot;Datenverarbeitung&quot;. </li><li> Entfernen Bildern schlechter Qualität: Erstens, um zu studieren einzelne Bilder auszuschalten Gruppierung aus dem Menü &quot;Datenverarbeitung&quot;. Weiter, klicken Sie durch die Ausreißerpunkte in der Punktwolke und entsorgen Bilder von niedriger Qualität (zB unscharf, Artefakt-Färbung). </li><li> Entdecken Sie die Daten: Entscheiden Sie, welche Metadaten-Feld definierteine Grundeinheit des Vergleichs (zB Medikamente vergleichen, Bilder mit dem gleichen Wert des Feldes Metadaten &quot;Arzneimittel&quot; müssen zusammen gruppiert werden). Alles Bilder mit dem gleichen Wert dieses Metadatenfeld in einem einzigen Datenpunkt mit &quot;Group By&quot;. So wird beispielsweise Gruppierung von Drogen die Bilder innerhalb jedes Medikament durchschnittlich einen Punkt pro Medikament zu erhalten. In der Nähe (oder fernen) Punkte in der Punktwolke reflektieren Bedingungen, die ähnlich (oder unähnlich) zellulären Phänotypen hervorrufen. Farbe oder Etikett Punkte (Datenanzeige-Menü) auf der Grundlage verfügbarer Metadaten Interpretierbarkeit unterstützen. Die 3D-Darstellung ist durch Klicken auf das &quot;drehbar&quot; Kontrollkästchen, und klicken Sie auf die linke Taste und Ziehen mit der Maus über sie drehbar. </li><li> Wählen Sie zwei verschiedene Punkte, um sie direkt zu vergleichen. Die Bildtafeln werden Beispielbilder für jeden Punkt anzuzeigen, und das Balkendiagramm Panel werden die Blocktypen, deren Auftreten Frequenzen sind die meisten Unterschiede zwischen den beiden Punkten zu zeigen. </li><li> Starten Sie die clustergram von der &quot;Clustergram Menü&quot;, um eine globale Sicht der Beziehung zwischen Satzarten und experimentellen Bedingungen. Durch das Gruppieren beide Blocktypen und Bedingungen, hebt diese Darstellung der zellulären Phänotypen, die am besten zu unterscheiden Gruppen von Bedingungen (Abbildung 5). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Workflow ermöglicht eine schnelle und einfache Charakterisierung und Vergleich der Mikroskopie-Bilder. Wir haben zuerst gezeigt, wie dieser Workflow kann Experiment Optimierung, beispielsweise helfen, indem sie schnell die Qualitätskontrolle auf Mikroskopie-Aufnahmen. Weiter haben wir gezeigt, das Potential für die Analyse von Hochdurchsatz-Screening-Daten: Wir konnten Gruppe Medikamente auf ihren Wirkmechanismus. Die Gruppierung von Medikamenten vergleichbar war gefunden mit komplexeren Methoden <...

In den vergangenen zehn Jahren haben rasche Fortschritte in der Bildgebung Technologie viele Labors angesichts der Möglichkeit, Hochdurchsatz-Mikroskopie durchzuführen. Die Herausforderung ist nun von einer der Abbildungs ​​einem der Analyse verschoben. Wie können wir zu charakterisieren, zu vergleichen, und erkunden Sie die Flut von komplexen und doch subtil Phänotypen durch eine typische Hochdurchsatz-Imaging-Bildschirm erzeugt? Eine Reihe von Bildanalyse-und Informatik-Plattformen haben die Nutzer anspruchsvolle Toolboxen 1-3 für das Extrahieren von Informationen aus großen biologischen Sammlungen von Bildern gegeben. Doch viele bleiben erhebliche Hindernisse bei der Analyse von Daten aus Hochdurchsatz-Image-basierte Bildschirme. Schwierigkeiten mit der Auswahl geeigneter Charakterisierungen der Bilder und die Feinabstimmung der algorithmischen Parameter (zum System der Zinsen) beteiligt oft in langen Rüstzeiten, insbesondere für Anwender ohne Bildanalyse-Know-how führen. Insbesondere Zellsegmentierung, der Prozess der Identifizierung von Einzelzellen imBild n, ist ein Engpass in dieser Hinsicht. Segmentierung kann sehr empfindlich auf experimentellen Parameter wie Zelltyp, Zelldichte und Biomarker sein und erfordert häufig wiederholte Einstellung für eine große Datenmenge. Aus diesen Gründen ist die Bildanalyse häufig eine unabhängige Terminal Schritt durch Spezialisten und nicht integrierter Bestandteil des Versuchsablauf durchgeführt. Dies schließt die schnelle Feedback-Zyklus zwischen Analyse und Experiment, ein entscheidender Teil der Assay-Entwicklung. Hier beschreiben wir einen alternativen Workflow, der für Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Mikroskopie optimiert ist und vermeidet viele der oben genannten Schwierigkeiten. Dazu nutzen wir PhenoRipper 4, einem Open-Source-Software-Plattform für die schnelle Erforschung und Analyse von Mikroskopie-Bilder. Bezeichnenderweise PhenoRipper vermeidet viele der Herausforderungen, mit Zell Segmentierung nach nicht versuchen, einzelne Zellen zu identifizieren beteiligt. Stattdessen teilt PhenoRipper Bilder in PixelBlöcke von subzellulären Größe und charakterisiert Bilder in Bezug auf die Blöcke, die sie enthalten. Insbesondere PhenoRipper Profile Blöcke in Form von Marker-Kolokalisation-basierten Funktionen und identifiziert vier repräsentativsten Blocktypen in den Trainings Bilder automatisch ein. PhenoRipper ordnet dann jedem Block am ähnlichsten repräsentatives Blocktyp und schließlich charakterisiert Bilder basierend auf den Typen der Blöcke, die sie enthalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Single-Cell-basierte Ansätze erfordert dieser Ansatz minimale Feinabstimmung und Know-how. Als solche müssen die Anwender lediglich zwei Parameter: die Blockgröße und eine Schwellenintensität (bis zellulären Teile eines Bildes zu verwerfen), die beide mit grafische Rückmeldung gesetzt. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Arbeitsablauf hat sich gezeigt, 4 leicht, viel größere Datenmengen, bei denen die Geschwindigkeit und minimale Feinabstimmung bietet große Zeitgewinne und Zuverlässigkeit zu skalieren. In der Praxis finden wir, dass diese AppPlötze reduziert die Zeit sowohl für das Setup und läuft durch mehrere Größenordnungen 4 erforderlich. Die primäre Ausgabe des PhenoRipper ist eine visuelle Darstellung von Bildähnlichkeit, die dem Benutzer ermöglicht, Gruppen von Versuchsbedingungen, die Zellen zu ähnlichen Phänotypen führen anzuzeigen identifizieren. Die Gruppierungen PhenoRipper findet typischerweise vergleichbare &quot;biologische Interpretierbarkeit&quot; zu den von zeitaufwendiger, zellbasierte Verfahren 4 erzeugt. In der Praxis bedeutet dies, dass häufig innerhalb einer halben Stunde von der Durchführung einer typischen 96-Well-Fluoreszenzmikroskopie Experiment, ein Experimentator ohne vorherige Bildanalyse-Erfahrung kann eine zuverlässige Anzeige über die Leistung seines Experiments zu bekommen. Der Experimentator kann dann beginnen die Erkundung der Beziehungen zwischen den verschiedenen Versuchsbedingungen und in Bezug auf diese Beziehungen Bild Phänotypen. Wir zeigen diesen Workflow hier durch die Analyse der Auswirkungenvon Drogen in verschiedenen mechanistischen Klassen auf HeLa-Zellen für die DNA-und Zytoskelett-Marker gefärbt. Bilder von Zellen mit der gleichen Klasse von Medikamenten behandelt wurden, zusammengefasst und schlechte Bildqualität (Artefakte Färbung, unscharf Zellen und so weiter) erschien als Ausreißer, so dass sie leicht zu identifizieren und möglicherweise verwerfen. Während dieser Arbeitsablauf ist für eine große Anzahl von bildbasierten Assays, sind offensichtlich viele Situationen, in denen ein anderer Ansatz könnte informativer. Zum Beispiel ist der Ausgang von PhenoRipper hauptsächlich ein relativer Vergleich der Fluoreszenzmuster in den experimentellen Bedingungen. Wenn ein Absolut Charakterisierung eines bestimmten Einzelzellan anstelle erforderlich ist (zum Beispiel die Anzahl der Flecken in einer Zelle) würde eine Einzelzell-basierte Analyse erforderlich. Dennoch, auch in dieser Art von Situation ist PhenoRipper wahrscheinlich Veränderungen in diesen Einzelzellen-Phänotypen erkennen und daher ein nützliches Instrument zur Analyse opti seinmierung.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>High Glucose, L-Glutamine</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA-Färbung, Verdünnung 1:2.000 von 5 mg/ml Stamm</td></tr><tr><td>Marker Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Konjugiertes Phallotoxin, Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper &alpha;-Tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primäres Ab, Maus monoklonal, Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Sekundäres Antivody Anti-Maus TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Konjugiertes sekundäres Ab, 0,5 mg in 1 ml PBS + 1 ml Glycerin</td></tr><tr>Verwendete<td>Aldosteron-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Verwendete Apicidin-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 20 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Colchicin-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,16 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Cortisolkonzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Dexamethason-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Docetaxel-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; </td></tr><tr>M<td>M344</td><td></td><td></td><td>verwendete Konzentration: 20 &mu; M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>Verwendete Konzentration: 5 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Nocodazol-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,3 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Prednisolon-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; </td></tr><tr>Verwendete M<td>RU486-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Scriptaid-Konzentration</td><td></td><td></td><td>verwendet: 70 &mu; M</td></tr><tr><td>Verwendete Taxol-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,3 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Trichostatin A-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr>Verwendete<td>Vinorelbin-Konzentration</td><td></td><td></td><td>: 0,3 &mu; M</td></tr></tbody></table>

schnelle analyse und exploration von fluoreszenzmikroskopie images

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Trotz der raschen Fortschritte in der Hochdurchsatz-Mikroskopie, quantitative Bild-basierte Assays stellen immer noch erhebliche Herausforderungen. Während eine Vielzahl von Fachbildanalyse-Tools zur Verfügung, die meisten traditionellen Bild-Analyse-basierte Workflows haben steile Lernkurven (für die Feinabstimmung der Analyse-Parameter) und führen zu langen Laufzeiten zwischen Abbildung und Analyse. Insbesondere Zellsegmentierung, der Prozess der Identifizierung einzelner Zellen in einem Bild ist ein Flaschenhals in dieser Hinsicht. Hier präsentieren wir Ihnen eine alternative, zellfreie Segmentierung Workflow basierend auf PhenoRipper, einem Open-Source-Software-Plattform für die schnelle Analyse und Exploration von Mikroskopie-Aufnahmen ausgelegt. Die hier vorgestellte Pipeline für Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Aufnahmen von Zellkulturen optimiert und erfordert nur minimale Benutzereingriffe. Innerhalb einer halben Stunde können PhenoRipper Daten aus einer typischen 96-Loch-Experiment analysieren und Bildprofile. Benutzer könnendann visuell ihre Daten zu erforschen, führen die Qualitätskontrolle auf ihren Versuch sicherzustellen, Reaktion auf Störungen und überprüfen Reproduzierbarkeit der Wiederholungen. Dies ermöglicht eine schnelle Feedback-Zyklus zwischen Analyse und Experiment, das während der Assay-Optimierung entscheidend. Dieses Protokoll ist nützlich, nicht nur in einem ersten Pass-Analyse für die Qualitätskontrolle, sondern kann auch als End-to-End-Lösung verwendet werden, insbesondere für das Screening. Die hier beschriebene Arbeitsablauf skaliert, um große Datenmengen, wie sie durch Hochdurchsatz-Screens erzeugt und wurde zur Gruppe experimentellen Bedingungen Phänotyp genau über einen weiten Bereich von biologischen Systemen gezeigt worden. Die PhenoBrowser Schnittstelle bietet eine intuitive Rahmen, um die phänotypische Raum zu erkunden und beziehen Bildeigenschaften, biologische Anmerkungen. Zusammengenommen wird die hier beschriebenen Protokoll, die Hindernisse für die Annahme quantitative Analyse von Bild-Screens senken.

Hier testeten wir die Fähigkeit dieses Workflow Gruppe Medikamente auf ihren Wirkmechanismus. HeLa-Zellen wurden in 30 Wells einer 384-Well-Platte ausgesät und DNA / Aktin / α-Tubulin gefärbt. Die spezifischen primären Antikörper, fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und andere Fluoreszenzfarbstoffe, die verwendet wurden, sind in Tabelle aufgeführten Materialien. Wells wurden mit 15 Drogen zu drei mechanistische Klassen (Histon-Deacetylase-hemmende, Mikrotubuli-Targeting und DNA-schädigende) für 24 h und abgebildet ...

Hier beschreiben wir einen Arbeitsablauf für die schnelle Analyse und Erforschung von Sammlungen Fluoreszenzmikroskopiebilder mit PhenoRipper, eine kürzlich entwickelte Bild-Analyse-Plattform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Bildanalyseplattform zu verwenden, um fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen schnell zu analysieren und auszuwerten. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst in eine Platte ausgesät, anschließend in jede Vertiefung Störungen hinzugefügt und die Platte inkubiert wird. Danach werden die Bilder mithilfe eines automatisierten Fluoreszenzmikroskops aufgenommen und anschließend halbautomatisch mit dem Pheno Loader-Tool auf die Bildanalyseplattform Pheno Ripper geladen.Nach der Festlegung der Analyseparameter identifiziert Pheno Ripper automatisch wiederkehrende Blocktypen in den Bildern und erzeugt phänotypische Profile für jedes Bild, die mit dem Pheno Browser untersucht werden können. Letztendlich zeigt das endgültige Clustergramm die Beziehungen zwischen verschiedenen Bedingungen und Bildmerkmalen auf und ermöglicht den Vergleich komplexer, aber subtiler Phänotypen, die durch den Hochdurchsatz-Bildschirmversuch erzeugt wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die die automatisierte Identifizierung einzelner Zellen erfordern, liegt darin, dass sie wesentlich schneller und einfacher anzuwenden ist.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten, beispielsweise wie unterschiedliche Wirkstoffe zelluläre Prozesse beeinflussen. Das Verfahren beginnt mit der Zellkultur und der Fixierung der Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben; anschließend werden die fixierten Zellen mit spezifischen primären Antikörpern, fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern sowie weiteren fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt, die im Textprotokoll aufgeführt sind. Nach der Zellfärbung werden Bilder mittels eines Epi-Fluoreszenzmikroskops aufgenommen.In diesem Beispiel verwendeten wir eine 20-fache Vergrößerung mit einer 1-mal-1-Kamera.Benning. Wir erfassten 16 Bilder pro Mulde, insgesamt 480 Bilder. Um die Bilder zu analysieren, laden Sie zunächst pheno ripper von pheno ripper herunter und installieren Sie es.org und starten Sie Pheno Ripper. Um mit der Analyse der Bilder zu beginnen und Bilder sowie zugehörige Metadaten halbautomatisch zu laden, klicken Sie auf Dateistruktur, um den Pheno Loader in Pheno Ripper zu öffnen. Wählen Sie das Verzeichnis aus, das den Bilddatensatz enthält, und geben Sie gegebenenfalls die Dateierweiterung der Bilder an.Filtern Sie Dateien, die nicht für die Analyse verwendet werden. Klicken Sie auf „Markierungen definieren“, um die im Experiment verwendeten Biomarker anzugeben und sie mit den Bildern zu verknüpfen. Klicken Sie speziell auf eine Bilddatei und wählen Sie dann einen Teil des Dateipfads aus, der die Biomarker eindeutig identifiziert.Vergeben Sie abschließend einen Namen für jeden Biomarker. Der nächste Schritt ist, auf „Metadaten definieren“ zu klicken. Um Informationen mit jedem Bild zu verknüpfen, klicken Sie auf eine Bilddatei und wählen dann einen Teil des Dateipfads aus, der Bildinformationen identifiziert.Es erscheint ein Fenster, in dem nach einem Gruppennamen gefragt wird. Geben Sie einen Namen ein. Die aus dem Dateinamen extrahierten Mitglieder der Gruppe werden in der Gruppentabelle angezeigt.Diese Informationen können während der Visualisierung der Analyseergebnisse verwendet werden. Um zusätzliche Informationen hinzuzufügen, die nicht im Dateinamen enthalten sind, klicken Sie auf die Schaltfläche „Zusätzliche Informationen hinzufügen“, wählen Sie dann „Metadatengruppe hinzufügen“ aus und geben Sie den Namen der zusätzlichen Gruppe ein. Nach jeder Vorgabe für die Gruppe kann ein entsprechender Wert eingegeben werden; es gibt keine Beschränkung hinsichtlich der Anzahl der hinzufügbaren zusätzlichen Gruppen.Klicken Sie abschließend auf „create metadata file“, um eine für Pheno Ripper lesbare Annotation der Daten zu generieren, und wählen Sie das Metadatenfeld aus, das die Wiederholungen im Experiment definiert, um redundante Stichproben zu vermeiden. Bei Datensätzen, die Wiederholungen enthalten, kann die Zusammenfassung dieser Gruppen die Leistung verbessern. Klicken Sie anschließend auf „set parameters“, um die zur Verarbeitung des Datensatzes erforderlichen Parameter festzulegen.Die zu definierenden Parameter befinden sich im linken Bereich. Im rechten Bereich wird Emergieren angezeigt. Beispiel des Datensatzes.Klicken Sie auf den linken oder rechten Pfeil, um zwischen verschiedenen Bildern zu wechseln, und wählen Sie einen geeigneten Schwellenwert, um die zellulären Bereiche der Bilder grob zu identifizieren. Ein Schwellenwert wird von Pheno Ripper vorab berechnet, kann jedoch mithilfe der Bildlaufleiste oberhalb des Bildes angepasst werden, um die Hervorhebung zellulärer Regionen zu verbessern.Falls ein gewählter Schwellenwert nicht für alle Bilder geeignet ist, senken Sie den Schwellenwert so weit, dass nicht-zelluläre Bereiche eingeschlossen und nicht zelluläre Bereiche nicht ausgeschlossen werden. Wählen Sie anschließend eine geeignete Blockgröße, gemessen in Pixeln, um das Bild in ein Raster aus Blöcken zu unterteilen. Passen Sie die Blockgröße an, um einen Durchschnitt von 20 bis 30 Blöcken pro Zelle zu erhalten, um das Raster über das Bild zu legen.Klicken Sie auf das Kontrollkästchen vor dem Feld für die Blockgröße. Wenn die automatisch skalierten Bilder die Marker nicht mit den gewünschten relativen Intensitäten anzeigen oder wenn Marker aus der Analyse ausgeschlossen werden müssen, verwenden Sie die Option zur Anpassung der Kanalintensität, um zelluläre Bereiche anhand einer Teilmenge der Marker zu identifizieren. Wählen Sie die für die Schwellenwertoption verwendeten Kanäle standardmäßig aus.Die Wahl anderer Parameter ist normalerweise ausreichend, kann jedoch bei Bedarf angepasst werden. Mithilfe der erweiterten Analyseoptionen führen Sie die Analyse durch, indem Sie im Hauptanwendungsfeld auf pheno rip klicken. Pheno ripper identifiziert automatisch wiederkehrende Blocktypen in den Bildern.Phänotypische Profile werden für jedes Bild basierend auf den Anteilen der verschiedenen Blocktypen darin generiert. Untersuchen Sie die Beziehungen zwischen den phänotypischen Profilen der Bilder mithilfe des Phäno-Browsers. Die Benutzeroberfläche des Phäno-Browsers besteht aus vier Bereichen.Das obere linke Feld zeigt eine grafische Darstellung der relativen Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Bildern und experimentellen Bedingungen. Die beiden rechten Felder zeigen Beispielbilder der ausgewählten Bedingungen. Das letzte Feld vergleicht die phänotypischen Profile der ausgewählten Bedingungen.Schalten Sie zuerst im Datenverarbeitungsmenü die Gruppierung aus, um einzelne Bilder zu untersuchen. Klicken Sie anschließend die Ausreißerpunkte im Streudiagramm durch und verwerfen Sie Bilder von geringer Qualität. Entscheiden Sie, welches Metadatenfeld eine grundlegende Vergleichseinheit definiert.Beispielsweise können zur Vergleichung von Wirkstoffen Bilder mit demselben Wert im Metadatenfeld Wirkstoff gruppiert werden. Jeder Punkt repräsentiert nun einen einzelnen Wirkstoff. Mithilfe des Datenanzeigemenüs können die Punkte zur besseren Interpretierbarkeit nach verfügbaren Metadaten eingefärbt oder beschriftet werden. Der Abstand zwischen den Punkten spiegelt die relative phänotypische Ähnlichkeit der entsprechenden experimentellen Bedingungen wider.Nähere Punkte deuten auf eine größere Ähnlichkeit hin. Die dreidimensionale Darstellung ist drehbar, indem das Kontrollkästchen „rotatable“ (drehbar) ausgewählt wird. Bewegen Sie die Maus bei gedrückter linker Maustaste über das Diagramm.Wählen Sie zwei verschiedene Punkte aus, um sie direkt zu vergleichen. Die Bildpanele zeigen Beispielbilder für jeden Punkt, und das Balkendiagramm zeigt die Blocktypen an, die die beiden Punkte am besten unterscheiden. Starten Sie das Clustergramm über das Clustergramm-Menü, um eine umfassendere Übersicht über die Beziehung zwischen Blocktypen und experimentellen Bedingungen zu erhalten, indem sowohl Blocktypen als auch Bedingungen gruppiert werden.Diese Darstellung hebt die zellulären Phänotypen hervor, die Gruppen von Bedingungen am besten unterscheiden. Pheno Ripper wurde verwendet, um Hela-Zellen zu analysieren, die fluoreszenzmarkiert waren für DNA Actin und alpha-Tubulin und nach Behandlung mit histondeacetylierenden, mikrotubuli-targetierenden und DNA-schädigenden Wirkstoffen abgebildet wurden. Die Vordergrund-Schwellenwertbestimmung dieser Bilder wurde auf 5 % festgelegt und die Blockgröße auf 20 Pixel. Die Analyse dieses Datensatzes dauerte auf einem Standard-Desktop-Computer etwa 10 Minuten.Die Pheno-Browser-Oberfläche wurde zur Untersuchung der Ergebnisse verwendet. Die relativen phänotypischen Ähnlichkeiten zwischen den Bildern werden mittels mehrdimensionaler Skalierung visualisiert. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Bild, das nach dem Wirkmechanismus des jeweiligen Wirkstoffs eingefärbt ist.Dieses Diagramm zeigt, dass phänotypische Profile verwendet werden können, um Wirkstoffe nach ihrem Wirkmechanismus zu gruppieren. Bildgebungsartefakte wie Porenfärbung und leere Bilder waren leicht zu erkennen, da sie als klare Ausreißer hervorstachen. Ein Clustergramm der Daten stellt diese Gruppierung in Beziehung zu den hier dargestellten phänotypischen Profilen.Jede Zeile repräsentiert eine einzelne Droge und jede Spalte einen Blocktyp. Die Graustufenwerte spiegeln die phänotypischen Profile wider. Ein hellerer Wert zeigt einen höheren Anteil dieses Blocktyps an. Die hierarchische Clusterung trennt weitgehend die verschiedenen Drogen nach Wirkstoffklasse.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in 10 Minuten durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die IRA-Profilierung durchgeführt werden. Dies trägt dazu bei, zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, wie unterschiedliche Gene ähnliche Signalwege beeinflussen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir entwickelten eine Software-Plattform, Imaris Neuroscience, ImarisXT und MATLAB, um die Änderungen in der Morphologie einer undefinierten Form von dreidimensionalen konfokale Fluoreszenz einzelner Zellen aufgenommen zu messen verwendet. Dieser neuartige Ansatz kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellform nach Aktivierung des Rezeptors zu quantifizieren und stellt somit eine mögliche zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll zur Fluoreszenzmikroskopie Filme von wachsenden Hefezellen und eine GUI-basierte Software-Paket, um Single-Cell-Zeitreihen extrahieren zu erhalten. Die Analyse umfasst automatisierte Linie und Teilung Zeitzuweisung mit Sichtprüfung und manuelle curation der verfolgten Daten integriert.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt.

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Eine genaue Quantifizierung vesikulärer Transportereignisse liefert oft wichtige Einblicke in die Rolle bestimmter Proteine und die Auswirkungen von Mutationen. In diesem Artikel werden Methoden zur Verwendung von superekliptikem pHluorin, einer pH-sensitiven GFP-Variante, als Werkzeug zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vorgestellt.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische Segmentierung von eindringmittel beschrifteten Gewebe auf Folien mit einem Weitfeld-High-Content-Analyse-System (WHCAS). Dieses Protokoll hat breite Anwendungen in allen Bereichen umfasst die Quantifizierung der fluoreszierenden Marker in biologischen Geweben, einschließlich der biologischen Wissenschaften, Medizintechnik und Gesundheitswissenschaften.

Automatisierte Dia scannen und Segmentierung in Gewebekulturen beschriftet Gewebe mit einem Weitfeld High-Content Analysesystem

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

Hier wird ein Protokoll zur optischen Extraktion und Katalogisierung angeborener zellulärer Fluoreszenzsignaturen (d.h. zelluläre Autofluoreszenz) aus jeder einzelnen lebenden Zelle vorgestellt, die in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist. Diese Methode eignet sich, um die angeborene Fluoreszenzsignatur verschiedener biologischer Systeme mit einzelliger Auflösung zu untersuchen, einschließlich Zellen von Bakterien, Pilzen, Hefen, Pflanzen und Tieren.

Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch konfokale Mikroskopie

Es wird ein zugänglicher, quelloffener mikrofluidischer Workflow für die parallelisierte Analyse der Plasmidretention in Bakterien vorgestellt. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Plasmidvorhandenseins in einzelligen Mikrokolonien in Gel-Mikrotröpfchen bietet diese Methode eine präzise, zugängliche und skalierbare Alternative zur herkömmlichen Plattenzählung.

Plasmidstabilitätsanalyse mit Open-Source-Tröpfchen-Mikrofluidik

Erfahren Sie die schnelle Analyse von Fluoreszenzmikroskopie-Bildern mit der PhenoRipper-Plattform. Diese Methode ermöglicht effiziente phänotypische Profilierung bei Hochdurchsatz-Screenings.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

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