Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, die Inflammasom-Aktivität in humanen dendritischen Zellen in vitro mithilfe einfacher IL-1β-Nachweistests zu beobachten. Zunächst R848 zu den Zellen hinzufügen, um die intrazelluläre Expression von pro-IL-1β zu induzieren. Anschließend Nigere hinzufügen, um die Bildung des NLRP3-Inflammasoms zu aktivieren.

Dies wiederum löst die Spaltung von pro-IL-1β in das reife IL-1β vor der Sekretion aus. Als Nächstes sammeln Sie die Proben ein und messen das intrazelluläre pro-IL-1β sowie das extrazelluläre reife IL-1β. Die Ergebnisse werden durch die Messung der IL-1β-Sekretion aus primierten und aktivierten Zellen mittels Immunfluoreszenz, Western Blot und ELISA ermittelt. Nachweise zeigen, dass die Priming-Behandlung menschlicher dendritischer Zellen (DCs) zur intrazellulären Produktion von pro-IL-1β in mit R848 primierten Zellen führt sowie zur Sekretion von IL-1β aus Zellen, die sowohl mit R848 primiert als auch mit Nigericin aktiviert wurden.

Diese Methode kann Einblicke in die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der Antwort menschlicher dendritischer Zellen auf synthetische Liganden liefern. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewendet werden, die zur Untersuchung physiologischer Auslöser wie Bakterien, Viren und autoinflammatorischer Erkrankungen konzipiert sind. Aliquotieren Sie 200 µL frisch isolierter, aus Monozyten gewonnener dendritischer Zellen im Ruhezustand in eine 96-Loch-Rundbodenplatte.

Beginnen Sie mit den vier Standardbedingungen unstimulierter Negativkontrolle, alleinige Priming-Behandlung, alleinige Aktivierung sowie Priming gefolgt von Aktivierung. Anschließend sollten je nach experimentellem Design Verdünnungsmittelkontrollen für R 8 48 und Nissin enthalten sein; für nachgeschaltete intrazelluläre Zytokinnachweis-Assays schließen Sie Duplikate der Isotypkontrollen ein, um das Inflammasom zu primen. GEBEN SIE R 8 48 ZU, indem Sie eine endgültige Konzentration von 10 µM den entsprechenden Vertiefungen hinzufügen.

Bringen Sie die Zellen für 18 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Anschließend zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms Nige in einer Endkonzentration von 20 Mikromolar hinzufügen. Die Kulturen weitere sechs Stunden in den Inkubator zurückstellen, um die Proben zu gewinnen; danach die Kulturplatte bei 974 × g für drei Minuten zentrifugieren, ohne die Zellpellets zu stören.

Überführen Sie jedes Überstandmedium in eine separate Rundbodenplatte, um die Zytokinsekretion mittels EISA zu messen. Waschen Sie die zellulären Pellets nun dreimal mit 200 µL 1× PBS, um jegliches extrazelluläres IL-1β aus den Zellproben zu entfernen, die anschließend mit verschiedenen Methoden weiter analysiert werden, beispielsweise zur Western-Blot-Detektion von pro-IL-1β. Lyse die Zellen direkt in 10 µL Denaturierungs-Lysispuffer. Nach dem Überführen der Lysate in 1,5-mL-Eppendorfgefäße erhitzen Sie die Proben 10 Minuten bei 100 °C zur fluoreszenzbasierten Detektion von IL-1β per Durchflusszytometrie.

Geben Sie 100 Mikroliter 5 % PHS-Medien zu den zellulären Proben und ein Mikroliter fluoreszenzmarkierter Antikörper zu den Phänotypmarkern oder Isotypkontrollen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach drei PBS-Spülgängen fixieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 4 % PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Permeabilisierungspuffer für 30 Minuten hinzu, gefolgt von 62 Nanogramm anti-IL-1β-FSE-Antikörper oder Isotypkontrolle; inkubieren Sie die Proben zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer und resuspendieren Sie sie in einem XPBS. Wickeln Sie die Proben in Aluminiumfolie ein und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Falls IL-1β durch Mikroskopie nachgewiesen werden soll, färben Sie die Zellen mit DAPI, geben Sie Mounting-Medium hinzu und legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf einen Objektträger.

Lassen Sie die Probe über Nacht aushärten, bevor Sie Mikroskopieaufnahmen zur fluoreszenzgestützten Detektion per Durchflusszytometrie aufnehmen. Erfassen Sie die Daten jeweils für eine Probe nacheinander. Stellen Sie die Tore für das vorwärts- und seitwärts gestreute Licht auf die lebenden Zellen ein. Gehen Sie danach zu den CD11c-positiven, CD14-negativen Zellen über.

Analysieren Sie abschließend die MODC-Population basierend auf der Pro-IL-1β-Färbung in den Mikroskopie-Datenaufnahmen. Stellen Sie die Belichtungszeit mit der positiv gefärbten, mit R 8 48 behandelten Probe ein. Bestimmen Sie anschließend den Prozentsatz der pro-IL-1β-exprimierenden MODZellen für den Western-Blot-Nachweis.

Laden Sie das gesamte Proben-Volumen auf das Polyacrylamidgel auf. Laufen Sie bei 140 Volt, bis die Farbvorderkante das Gel verlässt. Übertragen Sie das Protein vom Polyacrylamidgel auf die A-P-V-D-F-Immo-FL-Membran.

Blocken Sie die Membran mit 5 % BSA in TBST für eine Stunde. Inkubieren Sie mit dem primären Antikörper unter Schütteln bei vier Grad Celsius über Nacht. Nach drei TBST-Spülungen von jeweils fünf Minuten Dauer inkubieren Sie mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde; nach drei weiteren TBST-Spülungen nehmen Sie die Bildaufnahme der Membran vor, wenn sezernierte Zytokine mittels ELISA gemessen werden, und äquilibrieren Sie die Proben bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie die Proben, um die Kondensation des Überstandes zu vereinigen, und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Messung von IL-1β für die intrazelluläre Zytokinstaining von pro-IL-1β, die Mikroskopie und FACS-Analysen an CD11c-positiven, CD14-negativen, monocytenstämmigen dendritischen Zellen ermöglicht. Beide Techniken können relativ zu einer nicht-primed oder ruhenden Zellkontrolle sowie zu einer Isotypkontrolle quantifiziert werden. Der Prozentsatz der pro-IL-1β-positiven Zellen wird mit dem geometrischen Median dieser Population multipliziert, um die mediane fluoreszierende Intensität zu ermitteln.

Der MFI ist vergleichbar mit der Menge an pro-IL-1β, die in den positiv gefärbten Zellen vorhanden ist. Hier werden Immunoblotting-Techniken verwendet, um pro-IL-1β aus den Zelllysaten zu messen. Quantitative Daten werden relativ zu einer internen zellulären Kontrolle wie β-Tubulin angegeben, wie erwartet.

Die Immunoblot-Analyse für pro-IL-1β in mit Nigericin behandelten Zellen zeigt eine Abnahme von pro-IL-1β. Dies wird begleitet von einer gleichzeitigen Zunahme von IL-1β in den Überständen, gemessen mittels ELISA nur nach R848-Behandlung, gefolgt von Nigericin-Bedingungen. Die gleichzeitige Messung weiterer entzündlicher Zytokine wie TNF-α, IL-10 und IL-6 bestätigt, dass Nigericin spezifisch die Freisetzung von IL-1β auslöst.

Der Grad der Priming ist zeit- und dosisabhängig. Weitere Experimente, wie die Messung der exzellulären Proteinkonzentration, die Chemilumineszenzdetektion der reifen IO-1-beta-Generierung oder die Blockade des Inflammasoms, würden helfen zu bestimmen, ob das exzelluläre IO-1-beta die reife, gespaltene Form ist und ob die Sekretion von IO-1-beta nlrp3-Inflammasomaktivitätsabhängig erfolgt.