Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, die Inflammasomaktivität in in vitro humanen dendritischen Zellen mit einfachen IL one beta Readout-Assays zu beobachten. Fügen Sie zuerst R 8 48 zu den Zellen hinzu, um die intrazelluläre Pro-IL-One-Beta-Expression zu induzieren. Fügen Sie dann Nige hinzu, um die NLRP-Drei-Inflammasomenbildung zu aktivieren.

Dies wiederum löst die Spaltung von pro IL one beta in reifes IL one beta vor der Sekretion aus. Als nächstes werden die Proben entnommen und die intrazellulären pro IL one beta und die extrazellulären reifen IL one beta Ergebnisse gemessen, die durch Messung der Sekretion von IL one beta aus geprimten und aktivierten Zellen durch Immunfluoreszenz, Western Blot und Eli erzielt werden. Ein Nachweis zeigt, dass das Priming von humanem DCS zu einer intrazellulären pro IL one beta-Produktion in R 8 48 geprimten Zellen und zur Sekretion von IL one beta aus Zellen führt, die sowohl mit nigerianischem Juris geprimt als auch aktiviert wurden.

Diese Methode kann Aufschluss über die Rolle des NLRP-Drei-Inflammasoms bei der Reaktion menschlicher dendritischer Zellen auf synthetische Liganden geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, die zum Testen physiologischer Auslöser wie Bakterien, Viren und autoinflammatorische Erkrankungen entwickelt wurden. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter frisch isolierter dendritischer Zellen aus Monozyten in ihrem Ruhezustand in einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen.

Beginnen Sie mit den vier Standardbedingungen der unstimulierten Negativkontrolle, nur Priming, nur Aktivierung und Priming, gefolgt von der Aktivierung. Dann, entsprechend dem Versuchsdesign, schließen Sie Verdünnungsmittelkontrollen für R 8, 48 und Nissin für nachgeschaltete intrazelluläre Zytokin-Färbeassays ein, einschließlich Duplikate für die Isotypkontrollen, um das Inflammasom zu grundieren. R 8 48 hinzufügen, eine Endkonzentration von 10 μmolar in die entsprechenden Vertiefungen geben.

Legen Sie die Zellen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einen Inkubator. Um dann das NLRP-Drei-Inflammasom zu aktivieren, fügen Sie Nige in einer Endkonzentration von 20 Mikromolaren hinzu. Stellen Sie die Kulturen für weitere sechs Stunden in den Inkubator zurück, um die Proben zu ernten, zentrifugieren Sie die Kulturplatte drei Minuten lang bei 974 mal G, ohne die Zellpellets zu stören.

Jeder Überstand wird auf eine separate runde Bodenplatte übertragen, um die Zytokinsekretion mittels EISA zu messen. Waschen Sie nun die zellulären Pellets dreimal mit 200 Mikrolitern eines XPBS, um extrazelluläres IL one beta aus den zellulären Proben für die weitere Analyse durch eine Vielzahl von Techniken zum Western-Blot-Nachweis von pro IL one beta zu entfernen. Nach dem Transfer der Lysate in 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang auf 100 Grad Celsius für den Fluoreszenznachweis von IL one beta durch Durchflusszytometrie

Geben Sie 100 Mikroliter 5%PHS-Medium zu den zellulären Proben und einen Mikroliter fluoreszenzmarkierte Antikörper zu den Phänotypmarkern oder der Isotypkontrolle inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach drei PBS-Wäschen fixieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 4%PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter durchlässigen Puffer für 30 Minuten hinzu, gefolgt von 62 Nanogramm Anti-IL-Ein-Beta-FSE-Antikörper oder Isotyp-Kontroll-Inkubation der Proben für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern durchlässigem Puffer und resuspendieren Sie sie in einem XPBS. Wickeln Sie die Proben in Folie ein und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Wenn Sie IL on beta durch Mikroskopie nachweisen können, färben Sie Zellen mit Dappy an, fügen Sie Mountain hinzu und legen Sie vorsichtig einen Deckglas auf einen Objektträger.

Lassen Sie den Berg über Nacht aushärten, bevor Sie Mikroskopiebilder für den Fluoreszenznachweis durch Durchflusszytometrie aufnehmen. Erfassen Sie Daten Probe für Probe. Setzen Sie die vorderen und seitlichen Streugatter auf die lebenden Zellen Nächstes Tor auf die CD 11 C positiven CD 14 negativen Zellen.

Analysieren Sie schließlich die MODC-Population basierend auf der pro IL one beta-Färbung in der Mikroskopie-Datenerfassung. Stellen Sie die Belichtungszeit mit der mit R 8 48 behandelten Probe mit positiver Färbung ein. Bestimmen Sie dann den Prozentsatz von pro IL one beta, das MO dcs Leichtigkeit für den Western-Blot-Nachweis exprimiert.

Laden Sie das gesamte Probenvolumen auf das Polyacrylamid-Gel. Mit 140 Volt laufen lassen, bis die Düsenfront vom Gel abläuft. Übertragen Sie das Protein aus dem Polyacrylamid-Gel auf die A-P-V-D-F-immo auf der FL-Membran.

Blockieren Sie die Membran mit 5%BSA in TBST für eine Stunde. Inkubieren Sie mit dem Primärantikörper unter Schütteln bei vier Grad Celsius für Nacht. Nach drei fünfminütigen TBST-Waschungen inkubieren Sie eine Stunde lang mit dem Sekundärantikörper bei Raumtemperatur, danach bilden drei weitere TBST-Waschungen die Membran ab, indem Sie die sezernierten Zytokine mit ELI SA messen und die Proben bei Raumtemperatur äquilibrieren.

Schleudern Sie Proben herunter, um die überstehende Kondensation zu konsolidieren, und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Messung von intrazellulären Zytokinen IL one beta. Die Färbung für pro IL one beta ermöglicht die Mikroskopie und das Auslesen von Fakten von CD 11 C positiven CD 14 negativen Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen. Beide Techniken können sowohl relativ zu einer nicht-primierenden oder ruhenden Zellkontrolle als auch zu einer Isotypkontrolle quantifiziert werden. Der Prozentsatz der pro IL one Beta-Färbezellen wird mit dem geometrischen Median dieser Population multipliziert, um die mediane Fluoreszenzintensität zu erhalten.

Der MFI ist vergleichbar mit der Menge an pro IL one beta, die in den positiven Färbezellen vorhanden ist. Hier. Immuno-Blotting-Techniken werden verwendet, um pro IL one beta aus den Zelllysaten zu messen. Quantitative Daten werden erwartungsgemäß relativ zu einer internen zellulären Kontrolle wie Beta-Tubulin exprimiert.

Immunoblotting für pro IL one beta in NI nigerianisch behandelten Zellen zeigt eine Abnahme von pro IL one beta. Ergänzt wird dies durch einen gleichzeitigen Anstieg von IL one beta in Überständen, gemessen mit E ELI a nur R 8 48, gefolgt von NI nigerianischen Bedingungen. Die gleichzeitige Messung anderer inflammatorischer Zytokine wie T, NF, alpha, IL 10 und IL 6 stellt sicher, dass Niger spezifisch ist, wenn es darum geht, die Sekretion von IL one beta zu verursachen.

Der Grad des Primings ist zeit- und dosisabhängig. Weitere Experimente, wie z. B. die Messung der ex-extrazellulären Proteinkonzentration, der Chemilumineszenznachweis aus reifer I-1-Beta-Generation oder die Blockierung des Inflammasoms, würden helfen zu bestimmen, ob ex-extrazelluläres IO one beta die reife gespaltene Form ist und ob IO one beta-Sekretion nlrp ist. Drei Inflammasom Aktivität abhängig.