Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, longitudinale Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix in dreidimensionalen Krebsmodellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Krebszellen entnommen und das Tumorsteroid mit einer geeigneten Methode gezüchtet wird, bis sie die gewünschte Größe erreicht haben. Der zweite Schritt besteht darin, das Tumorsteroid in das Kollagen oder eine andere geeignete extrazelluläre Matrix einzubetten.

Als nächstes wird das Raster der Beispielpunkte erstellt und an jedem Punkt ein Video aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Videodaten zu analysieren und reale logische Eigenschaften an jedem räumlichen Punkt zu berechnen und zu koregistrieren. Letztendlich nutzt dieses Protokoll die Analyse von Trajektorien von Tracersonden, um räumliche Veränderungen in der extrazellulären Matrixmechanik auf zerstörungsfreie Weise longitudinal zu quantifizieren.

Die Idee ist, dass durch die Kombination von bildgebenden Messungen der extrazellulären Matrixradiologie mit in vitro 3D-Tumormodellen, die extrazelluläre Matrixinteraktionen wiederherstellen, dieser Ansatz quantitative Einblicke in zeitabhängige Veränderungen in der mechanischen Mikroumgebung geben kann, die die Invasionsprozesse des Tumorwachstums und das Ansprechen auf die Behandlung begleiten. Die in diesem Video gezeigte Methode verwendet einen aros-Overlay-Ansatz, um nicht-adhärente 3D-OIDs aus der etablierten Pankreaskrebszelllinie pan one zu generieren. Mischen Sie zunächst 10 Milliliter Wasser in Zellkulturqualität mit 0,1 Gramm Aros, um eine 1%ige Aros-Lösung zu erhalten.

Erhitzen Sie die aros-Lösung vor Ali auf über 70 Grad Celsius. Geben Sie 40 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, ernten Sie Krebszellen über Trypsin und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor, bevor Sie die Zellsuspension auf 1000 Zellen pro Milliliter verdünnen. Geben Sie 100 Mikroliter dieser Verdünnung in die Vertiefung, die das ausgehärtete Aros-Bett enthält.

Legen Sie die Probe über Nacht auf einen Schüttler in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % CO2 eingestellt ist. Nehmen Sie die Probe aus dem Shaker und fügen Sie 100 Mikroliter Zellkulturmedium hinzu, inkubieren Sie das resultierende Steroid, bis der gewünschte Durchmesser erreicht ist. Zum Beispiel hat ein Steroid nach neun Tagen einen Durchmesser von etwa 450 Mikrometern.

Bereiten Sie zunächst einen Arbeitsplatz in einer Laminar-Flow-Haube mit zwei Zwei-Milliliter-Fläschchen vor. Fläschchen eins wird das Tumorsteroid enthalten und Fläschchen zwei wird eine zellfreie Kontrolle sein. Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus Carboxylat-modifizierten Fluoreszenz-Tracersonden mit einem Durchmesser von einem Mikrometer vor, indem Sie zwei Teile Stammsonden zu 25 Teilen sterilem Wasser hinzufügen.

Nehmen Sie eine Flasche mit 3,1 Milligramm pro Milliliter Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und legen Sie sie auf Eis aliquot 125 Mikroliter Kollagen, gefolgt von 50 Mikrolitern verdünnter Tracersondenlösung in das Fläschchen einen Wirbel kurz, um die Sonden zu verteilen. Geben Sie dann 235 Mikroliter eines geeigneten Zellkulturmediums, das Phenolrot enthält, für ein Gesamtvolumen von 410 Mikrolitern hinzu und wirbeln Sie es kurz ein, bevor Sie 205 Mikroliter entfernen und in das zweite Fläschchen geben. Geben Sie anschließend etwa zwei Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids in die Durchstechflasche.

Einen, um die Lösung wieder auf den neutralen pH-Wert zu bringen, kurz vortexen, um zu mischen. Kehren Sie dann sofort zum Eisgitter zurück, damit die Mischung nicht zu härten beginnt. Entfernen Sie vorsichtig 40 Mikroliter des Mediums aus der Vertiefung, die das Tumorsteroid enthält.

Behalten Sie diese 40 Mikroliter bei, während Sie den nächsten Schritt durchführen. Überprüfen Sie die Vertiefung, um festzustellen, ob das Steroid im vorherigen Schritt entfernt wurde. Wenn nicht, geben Sie die 40 Mikroliter zurück in die Vertiefung und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.

Wenn ja, geben Sie die 40 Mikroliter, die das Steroid enthalten, in das Fläschchen. Rühren Sie das Fläschchen vorsichtig um, bevor Sie die Mischung in 60-Mikroliter-Portionen in drei separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte überführen. Untersuchen Sie jede Vertiefung mit einem Mikroskop, nachdem Sie die Mischung hinzugefügt haben, um festzustellen, welche Vertiefung das Steroid enthält. Geben Sie dann etwa zwei Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids und 40 Mikroliter Zellkulturmedium in das zweite Fläschchen und wirbeln Sie es vor Ali ein.

60 Mikroliter dieser Mischung in eine leere Vertiefung in der 96-Well-Platte geben und als zellfreie Kontrolle kennzeichnen. Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um sie mindestens eine Stunde lang auszuhärten, um ein Raster aus Probenpunkten zu erstellen. Übertragen Sie zunächst die Probenplatte aus dem Inkubator auf den Mikroskoptisch.

Lassen Sie die Probe 10 Minuten auf Raumtemperatur äquilibrieren, wenn kein beheizter Tisch zur Verfügung steht. Beobachten Sie die Probe mit Objektiven mit geringer Leistung, um sicherzustellen, dass sie intakt und bereit für die Bildgebung ist. Bestimmen Sie die Tumorposition innerhalb der Vertiefung und dokumentieren Sie diese mit einem Durchlichtbild für die anschließende räumliche Co-Registrierung.

In der Regel führen 20 Probenpunkte in jeder Vertiefung, die in konzentrischen Ringen um das S-Sphäroid verteilt sind, zu ausreichend detaillierten Ergebnissen. Bewegen Sie den Tisch in jede gewünschte Position und verwenden Sie eine Mikroskop-Schnittstellensoftware, um die XNY-Koordinaten aufzuzeichnen. Schalten Sie das Mikroskop auf ein leistungsstarkes Objektiv um und wählen Sie den passenden Filterwürfel für die x-Zitierwellenlänge der Tracersonden aus.

Wechseln Sie mithilfe der Liste der erstellten Punkte zum ersten Punkt im Raster. Passen Sie den Fokus an, um den Boden der Vertiefung zu finden, bevor Sie nach oben gehen. Um ein Sichtfeld zu finden, das mehrere scharfscharfe Tastköpfe enthält.

Beobachten Sie das Intensitätshistogramm und passen Sie die Belichtungsintensität und -zeit an, um den größtmöglichen Dynamikbereich zu erzielen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Bild nicht übersättigt wird. Erhalten Sie eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 Millisekunden pro Bild und speichern Sie sie mit einer geeigneten Namenskonvention. Berühren Sie während der Aufnahme nicht das Mikroskop oder den Tisch.

Wiederholen Sie die Aufnahme für jeden Sample-Punkt im Raster. Wiederholen Sie dann den Vorgang, um für jede Vertiefung im Experiment ein Gitter zu erstellen, und wiederholen Sie den gesamten Vorgang für jedes Mal. Punkt über die Dauer der Längsschnittüberwachung.

Um mit der Datenanalyse zu beginnen. Kopieren Sie alle Videodaten in einen Analyseordner. Importieren Sie Bilddaten in MATLAB oder eine andere Analysesoftware.

Kalibrieren Sie die Software, indem Sie mehrere Frames des Videos analysieren, um Auswahl- und Unterdrückungsparameter für die Identifizierung der Mittenpositionen der Sonde angemessen zu bestimmen. Verwenden Sie dann die Software, um automatisch jede Sondenposition für alle Videoframes zu bestimmen, und verknüpfen Sie diese Positionen dann mit Trajektorien. Verwenden Sie die Trajektoriendaten, um die mittlere quadratische Verschiebung oder MSD als Funktion der Verzögerungszeit zu berechnen, und stellen Sie sicher, dass der geeignete räumliche Kalibrierungsfaktor für die spezifische Objektivlinse oder für jedes Pixel-Benning angewendet wird.

Berechnen Sie den G-Stern unter Verwendung der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung unter Berücksichtigung der Grenzen der Anwendbarkeit der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung für eine bestimmte Stichprobe. Wiederholen Sie die Analyseschritte für jedes Sichtfeld im Experiment. Koregistrieren Sie Positionsdaten mit viskoelastischem mod I bei einer bestimmten Frequenz, die je nach Hersteller des verwendeten Mikroskops von Interesse ist.

Dieser Schritt kann durch eine benutzerdefinierte Routine erleichtert werden, die Mikroskop-Metadaten liest, oder Positionsdaten können manuell tabellarisch dargestellt werden. Videosequenzen werden an mehreren räumlichen Positionen innerhalb einer repräsentativen Vertiefung aufgenommen, die einen 3D-Tumorknoten enthält, und verknüpft, um eine räumliche mikroradiologische Karte der Probe zu erhalten, wenn sie longitudinal von Zellpopulationen an der Peripherie der Pfanne überwacht wird. Ein Steroid, das in diesem Beispiel verwendet wird, baut die umgebenden Kollagenfasern spontan ab und dringt innerhalb weniger Tage in die extrazelluläre Matrix ein.

In diesem Beispiel liefert die Co-Registrierung der Mikroologie eine quantitative Auslesung der offensichtlichen Invasion in die Matrix, die links, aber nicht rechts vom Steroid stattfindet. Die longitudinale Überwachung dieser unterschiedlichen räumlichen Bereiche zeigt einen Abfall der realen Komponente des komplexen viskoelastischen Schermoduls um etwa vier Größenordnungen, der mit der Invasion einhergeht. Am vierten Tag werden vollständig frequenzabhängige Daten gezeigt, die die theologischen Eigenschaften des Materials in Region eins und Region zwei kontrastieren.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass bei der Analyse von Sondentrajektorien darauf geachtet werden muss, häufige Fallstricke zu vermeiden, die zu unangemessenen Schlussfolgerungen führen. Wir ermutigen die Leser, sich auf die hier zitierte PTM-Literatur zu beziehen, die sich mit Überlegungen wie Stichprobendrift und Interpretation von Heterogenität befasst. Dieses Verfahren kann mit zusätzlicher longitudinaler oder terminaler Fluoreszenzbildgebung kombiniert werden, um andere Fragen zu beantworten, z. B. wie der mechanische Umbau mit wichtigen Signalereignissen oder der zytotoxischen Reaktion auf einen Eingriff korreliert.