Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, longitudinale Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix in dreidimensionalen Krebsmodellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Krebszellen gewonnen und der Tumorsphäroid mittels einer geeigneten Methode solange kultiviert wird, bis die gewünschte Größe erreicht ist. Der zweite Schritt besteht darin, den Tumorsphäroid in Kollagen oder einer anderen geeigneten extrazellulären Matrix einzubetten.

Anschließend wird das Raster aus Messpunkten erstellt und an jedem Punkt ein Video aufgenommen. Der letzte Schritt besteht in der Analyse der Videodaten sowie der Berechnung und Koregistrierung realer logischer Eigenschaften an jedem räumlichen Punkt. Letztendlich nutzt dieses Protokoll die Analyse von Tracer-Sonden-Trajektorien, um räumliche Veränderungen der Mechanik der extrazellulären Matrix longitudinal und nicht-destruktiv zu quantifizieren.

Die Idee besteht darin, dass dieser Ansatz durch die Kombination bildgebender Messungen der extrazellulären Matrix aus der Radiologie mit in-vitro-3D-Tumormodellen, die Interaktionen der extrazellulären Matrix wiederherstellen, quantitative Einblicke in zeitabhängige Veränderungen des mechanischen Mikromilieus ermöglichen kann, die mit Tumorwachstum, Invasion und Therapieantwort einhergehen. Die in diesem Video gezeigte Methode verwendet einen Agarose-Overlay-Ansatz, um nicht-ankerende 3D-Organoide aus der etablierten Pankreaskarzinom-Zelllinie Pan-1 zu erzeugen. Geben Sie zunächst 10 Milliliter zellkulturgeeignetes Wasser mit 0,1 Gramm Agarose zusammen, um eine 1 %ige Agarose-Lösung zu erhalten.

Erhitzen Sie die Aros-Lösung vor der Aliquotierung auf über 70 Grad Celsius. Geben Sie jeweils 40 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Gewinnen Sie die Krebszellen durch Trypsin und bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension vor, bevor Sie die Zellsuspension auf 1000 Zellen pro Milliliter verdünnen. Fügen Sie 100 Mikroliter dieser Verdünnung in das Loch mit dem ausgehärteten Aros-Bett hinzu.

Platzieren Sie die Probe über Nacht auf einem Schüttler in einem Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 %CO2 eingestellt ist. Entfernen Sie die Probe vom Schüttler und geben Sie 100 Mikroliter Zellkulturmedium hinzu. Inkubieren Sie das resultierende Steroid, bis der gewünschte Durchmesser erreicht ist. Beispielsweise wird nach neun Tagen ein Steroid etwa 450 Mikrometer im Durchmesser betragen.

Bereiten Sie zunächst einen Arbeitsplatz in einer laminaren Luftstromwerkbank mit zwei zwei-Milliliter-Vials vor. Vial eins enthält das Tumorsyndrom, Vial zwei dient als zellfreie Kontrolle. Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus carboxylierter, ein Mikrometer durchmessender, fluoreszierender Tracer-Proben vor, indem Sie zwei Teile Stammlösung zu 25 Teilen steriler Wasser hinzufügen.

Entnehmen Sie eine Flasche mit 3,1 Milligramm pro Milliliter Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und stellen Sie sie auf Eis. Aliquotieren Sie 125 Mikroliter Kollagen und anschließend 50 Mikroliter verdünnte Tracer-Probelösung in Gefäß eins. Vortexen Sie kurz, um die Proben zu verteilen. Geben Sie dann 235 Mikroliter geeignetes Zellkulturmedium mit Phenolrot hinzu, sodass sich ein Gesamtvolumen von 410 Mikrolitern ergibt, und vortexen Sie erneut kurz. Entfernen Sie danach 205 Mikroliter und geben Sie diese in Gefäß zwei. Fügen Sie als Nächstes etwa zwei Mikroliter einer einmolaren Natriumhydroxid-Lösung zu dem Gefäß hinzu.

Eine zur Neutralisierung des pH-Werts der Lösung kurz verwirbeln, um sie zu mischen. Anschließend sofort wieder in das Eisgestell zurückstellen, damit die Mischung nicht mit der Aushärtung beginnt. Vorsichtig 40 Mikroliter Medium aus der Vertiefung, die das Tumorszintigramm enthält, entnehmen.

Behalten Sie diese 40 Mikroliter während des nächsten Schritts zurück. Überprüfen Sie die Vertiefung, um festzustellen, ob das Steroid im vorherigen Schritt entfernt wurde. Falls nicht, geben Sie die 40 Mikroliter zurück in die Vertiefung und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.

Falls dies der Fall war, geben Sie die 40 Mikroliter, die das Steroid enthalten, in das Gefäß eins. Rühren Sie das Gefäß eins vorsichtig um, bevor Sie das Gemisch portionsweise je 60 Mikroliter in drei separate Vertiefungen einer 96-Loch-Platte überführen. Untersuchen Sie jede Vertiefung nach Zugabe des Gemischs mit einem Mikroskop, um festzustellen, in welcher Vertiefung sich das Steroid befindet. Geben Sie anschließend etwa zwei Mikroliter einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung und 40 Mikroliter Zellkulturmedium in Gefäß zwei und wirbeln Sie es vor der Aliquotierung um.

60 Mikroliter dieser Mischung in eine leere Vertiefung der 96-Loch-Platte pipettieren und als zellfreie Kontrolle kennzeichnen. Die Platte in einen 37 °C warmen Inkubator stellen und mindestens eine Stunde lang zur Bildung eines Rasters aus Messpunkten inkubieren. Zunächst die Probenplatte vom Inkubator auf den Mikroskopständer übertragen.

10 Minuten verstreichen lassen, damit die Probe auf Raumtemperatur akklimatisiert werden kann, falls kein beheiztes Objekttischchen verfügbar ist. Die Probe mit Objektiven geringer Vergrößerung beobachten, um sicherzustellen, dass sie intakt ist und zur Bildgebung bereitsteht. Die Position des Tumors innerhalb der Vertiefung bestimmen und diese mit einem durchgehenden Lichtbild für die anschließende räumliche Ko-Registration dokumentieren.

Typischerweise ergeben 20 Probenahmepunkte in jeder Vertiefung, die in konzentrischen Ringen um den S-Sphäroid verteilt sind, ausreichend detaillierte Ergebnisse. Bewegen Sie den Objekttisch zu jeder gewünschten Position und verwenden Sie die Mikroskop-Software, um die XNY-Koordinaten aufzuzeichnen. Schalten Sie das Mikroskop auf ein Objektiv mit hoher Vergrößerung und wählen Sie den entsprechenden Filterwürfel für die x-Anregungswellenlänge der Tracer-Proben.

Unter Verwendung der Liste der erstellten Punkte zum ersten Punkt im Raster bewegen. Den Fokus anpassen, um den Boden der Vertiefung zu finden, bevor man nach oben geht. Um ein Blickfeld zu finden, das mehrere scharf abgebildete Tracer-Proben enthält.

Beobachten Sie das Intensitätshistogramm und passen Sie die Belichtungsintensität und -zeit so an, dass der größtmögliche Dynamikumfang erreicht wird, wobei sichergestellt werden muss, dass das Bild nicht gesättigt wird. Nehmen Sie eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 Millisekunden pro Bild auf und speichern Sie sie mit einer geeigneten Benennungskonvention. Berühren Sie während der Aufnahme weder das Mikroskop noch den Tisch.

Wiederholen Sie die Aufnahme für jeden Probenpunkt im Raster. Fahren Sie dann fort, indem Sie den Vorgang wiederholen, um ein Raster für jeden Brunnen des Experiments zu erstellen, und wiederholen Sie den gesamten Vorgang für jeden Zeitpunkt während der longitudinalen Überwachung.

Um mit der Datenanalyse zu beginnen, kopieren Sie alle Videodaten in einen Analyseordner. Importieren Sie die Bilddaten in MATLAB oder eine andere Analyse-Software.

Kalibrieren Sie die Software, indem Sie mehrere Videobilder analysieren, um geeignete Parameter für die Auswahl und Ablehnung zur Identifizierung der Positionen der Sondenmittelpunkte festzulegen. Verwenden Sie anschließend die Software, um automatisch die Position jeder Sonde in allen Videobildern zu bestimmen und diese Positionen zu Trajektorien zu verknüpfen. Nutzen Sie die Trajektoriendaten, um die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) als Funktion der Verzögerungszeit zu berechnen, wobei Sie sicherstellen, dass der geeignete räumliche Kalibrierungsfaktor für das jeweilige Objektiv oder für jedes Pixel-Binning angewendet wird.

Berechnen Sie G Stern unter Verwendung der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung unter Berücksichtigung der Anwendungsgrenzen der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung für eine bestimmte Probe. Wiederholen Sie die Analyse-Schritte für jedes Bildfeld im Experiment. Korrelieren Sie Positionsdaten mit dem viskoelastischen Modul I bei einer bestimmten Frequenz von Interesse, abhängig vom Hersteller des verwendeten Mikroskops.

Dieser Schritt kann durch eine benutzerdefinierte Routine erleichtert werden, die Mikroskop-Metadaten liest, oder die Positionsdaten können manuell tabelliert werden. Videosequenzen werden an mehreren räumlichen Positionen innerhalb eines repräsentativen Wells aufgezeichnet, der einen 3D-Tumorknoten enthält, und verknüpft, um bei longitudinaler Beobachtung eine räumliche Mikroradiologiekarte der Probe bereitzustellen, die Zellpopulationen am Rand des Gewebes erfasst. Steroide, die in diesem Beispiel verwendet werden, bauen spontan umgebende Kollagenfasern ab und dringen innerhalb weniger Tage in die extrazelluläre Matrix ein.

In diesem Beispiel liefert die Ko-Registrierung der Mikrobiologie eine quantitative Aussage über die offensichtliche Invasion in die Matrix, die sich links, nicht jedoch rechts des Steroids befindet. Die longitudinale Überwachung dieser unterschiedlichen räumlichen Bereiche zeigt einen Abfall des Realteils des komplexen viskoelastischen Schermoduls um etwa vier Größenordnungen, der zeitgleich mit der Invasion einhergeht. Vollständige frequenzabhängige Daten verdeutlichen im Kontrast die rheologischen Eigenschaften des Materials in Bereich eins und Bereich zwei am vierten Tag.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass bei der Analyse von Sondenbahnen häufige Fallstricke vermieden werden müssen, die zu unangemessenen Schlussfolgerungen führen können. Wir empfehlen den Lesern, die hier zitierte PTM-Literatur heranzuziehen, die Aspekte wie Probendrift und Interpretation von Heterogenität behandelt. Dieses Verfahren kann mit zusätzlichen longitudinalen oder terminalen Fluoreszenz-Aufnahmen kombiniert werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie mechanische Umbauprozesse mit wichtigen Signalereignissen oder der zytotoxischen Reaktion auf eine Intervention korrelieren.