Name: Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Particle-Tracking Mikrorheologie zur nicht-destruktiven Analyse der extrazellulären Matrix-Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Diese Methode ermöglicht quantitative Einblicke in mechanische Veränderungen während des Tumorwachstums.

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Wir danken für die Open-Source-Nutzung von MATLAB Partikel-Tracking-Code von Maria Kilfoil vorgesehen ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), zusammen mit dem früheren IDL-Code und eine umfangreiche Dokumentation von John C. Crocker und Eric bereitgestellt R. Weeks. Diese Arbeit durch Mittel aus dem National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 und R00CA155045 (: JPC PI) ermöglicht.

1. Kultivierung Tumorsphäroide <ol><li> Mischungs 10 ml Zellkultur-Wasser mit 0,1 g Agarose, um ein 1% Agarose-Lösung erhalten. </li><li> Wärme Agarose-Lösung auf über 70 ° C (etwa 14 sec in einer Standard Mikrowelle oder durch Verwendung einer Heizplatte) vor dem Aliquotieren von 40 &amp;mgr; l Agarose-Lösung in eine Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde bei der Ernte-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken. </li><li> Verwenden eines Hämazytometers, um die Konzentration der Zellen in der Suspension zu bestimmen. </li><li> Verdünnen Zellsuspension auf 1.000 Zellen / ml und 100 ul dieser Verdünnung auf die Vertiefung, die die ausgehärtete Agarose Bett. </li><li> Legen Sie die Probe auf einem Schüttler über Nacht in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. </li><li> Entfernen Probe von Shaker geben und 100 ul Zellkulturmedien. </li><li> Sphäroiden inkubieren, bis der gewünschte Durchmesser erreicht ist. Zum Beispiel nach 9 Tagen eine spHeroid ungefähr 450 um im Durchmesser sein. Während dieser Zeit kann frisches Wachstumsmedium zu den Vertiefungen gegeben werden, aber Aspiration zu vermeiden, da dies bei der Entfernung des Sphäroids führt. </li></ol> 2. Vorbereitung 3D Tumorsphäroide Eingebettet in ECM <ol><li> Bereiten Sie einen Arbeitsplatz mit benötigten Materialien innerhalb einer Steril. </li><li> Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus Carboxylat-modifizierte 1 um Durchmesser fluoreszierender Tracer-Sonden durch Zugabe von 2 Teillager Sonden (2% Feststoffe) bis 25 Teile sterilem Wasser. </li><li> Entfernen Sie eine Flasche von 3,1 mg / ml Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und legen Sie es auf Eis. </li><li> 125 ul Aliquot von Kollagen in ein leeres 2-ml-Ampulle. </li><li> In 50 ul verdünnte Tracer Sonde Lösung für das Fläschchen mit dem Kollagen und kurz vortexen, um Sonden zu verteilen. </li><li> In 235 ul der entsprechenden Zellkulturmedien, die Phenol-Rot (die gelb wird) mit einem Gesamtvolumen von 410 ml und Wirbel kurz bevor 205 ml (die Hälfte des Gesamtvolumens) und es in ein neues 2-ml-Ampulle. Vial 1 die Tumor Sphäroid enthalten und Fläschchen 2 wird eine Steuer Gemisch sein. </li><li> In ~ 2 ul 1 M NaOH auf Vial 1, um die Lösung wieder auf neutralen pH-Wert (Kulturmedien Phenolrot enthält, sollte auf rot zurück) zu bringen. Beachten Sie, dass dies bewirkt, dass die Mischung der Aushärtung, wenn sie nicht auf Eis gehalten, um zu beginnen. Vortex kurz zu mischen, dann auf Eis Rack sofort zurück. HINWEIS: Das Sphäroid ist kaum sichtbar, die mit bloßem Auge nach 9 Tagen der Kultur und ihrer Entfernung aus dem Agarose-Bett ist eine heikle Aufgabe. Verwendung eines Dissektionsmikroskop kann hilfreich für einige Nutzer. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Sphäroid während der Übertragung ist von größter Bedeutung. </li><li> Mit einem breit-Mund-Pipettenspitze, entfernen 40 ul Medium aus dem Brunnen, die das Tumor Sphäroid. Bewahren Sie diese 40 ul bei der Durchführung der nächste Schritt. </li><li> Überprüfen Sie das gut zu sehen, wenn das Sphäroidwurde im vorherigen Schritt entfernt. Wenn ja, fügen Sie die 40 ul, die das Sphäroid zu Vial ein. Falls nicht, legen Sie die 40 ul zurück in den Brunnen, und wiederholen Sie den vorherigen Schritt. </li><li> Rühren Sie leicht Vial 1 (nicht Gefahr, Vortex, kann es die Sphäroid beschädigen) vor der Übertragung der Mischung in 60 ul-Portionen in drei separaten Wells einer 96-Well-Platte. Überprüfen Sie jede Vertiefung mit einem Mikroskop nach Zugabe Mischung zu bestimmen, welche auch enthält das Sphäroid. </li><li> In ~ 2 ul 1 M NaOH und 40 ul Zellkulturmedien zu Vial 2 und Wirbel vor Aliquotierung 60 ul dieser Mischung in einen leeren Brunnen in der 96-Well-Platte und Kennzeichnung als Kontrolle. </li><li> Die Platte wird in einem 37 ° C-Inkubator für mindestens 1 Stunde aushärten. </li></ol> 3. Construct Grid von Probe-Punkte und Nehmen Sie ein Video an jedem Punkt <ol><li> Übertragen Sie die Probenplatte aus dem Inkubator auf dem Mikroskoptisch. Erlauben 10 min, bis die Probe Equilibrate mit der Raumtemperatur, wenn ein beheiztes Bühne ist nicht verfügbar. </li><li> Beachten Sie die Probe mit schwacher Stromversorgung Objektive um sicherzustellen, dass sie intakt und bereit für die Bildgebung ist. Ermitteln Sie die Position innerhalb der Tumor gut. </li><li> Entscheiden Sie, wie viele Punkte, um Probe zu nehmen. Typischerweise werden 20 Proben in jeder Vertiefung, in konzentrischen Ringen um das Sphäroid verteilt ausreichend detaillierte Ergebnisse zu produzieren. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um jede gewünschte Position und verwenden Mikroskop Schnittstellen-Software, um die x-und y-Koordinaten (oder Aufnahme-Koordinaten manuell, wenn Schnittstellen-Software nicht erreichbar ist) aufzeichnen. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop zu einem Hochleistungs-Objektiv (typischerweise 100X), und wählen Sie die entsprechende Filterwürfel für die Anregungswellenlänge der Tracer-Sonden. Verwenden Sie die Liste der Punkte in Schritt 3.4 erstellt, um auf den ersten Punkt im Netz zu bewegen. </li><li> Stellen Sie den Fokus auf den Boden des gut finden, dann nach oben, um ein Sichtfeld (FOV) mit mehreren In-Fokus-trac findenäh Sonden. </li><li> Beachten Sie die Intensität Histogramm die Belichtung eingestellt und Intensität und Zeit, um den größten Dynamikbereich möglich zu geben, während sichergestellt wird, dass das Bild nicht gesättigt zu werden. </li><li> Besorgen Sie sich eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 ms pro Bild (ca. 800 Frames oder 16-24 Sekunden lang wird empfohlen, um eine ausreichende Statistik für robuste MSD Berechnung mit der Notwendigkeit zur Minimierung der Messzeit an jedem Raumgitterpunkt ausgeglichen Verfügung stellen) und sparen Sie mit einer entsprechenden Konvention. Während der Aufnahme nicht berühren das Mikroskop oder Tisch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,6-3,9 für jeden Probenpunkt im Netz. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,10 für jeden auch im Experiment. </li></ol> 4. Analysieren Video Data zu rheologischen Eigenschaften bei jedem Abtastpunkt Berechnen <ol><li> Kopieren aller Videodaten auf einer Analyse Ordner (möglicherweise auf einem anderen Computer). </li><li> Import von Bilddaten in MATLAB oder andere Analyse-Software. NOTE: Umfangreiche Dokumentation über die Reihe von MATLAB hier angenommen Partikelverfolgung Routinen ist verfügbar <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Die Verwendung eines kundenspezifischen aufrufenden Funktion für die Automatisierung Verarbeitung mehrerer Dateien an verschiedenen Positionen empfohlen. </li><li> Kalibrieren der Software durch die Analyse mehrere Frames des Videos und Ablehnung Parameter (Größe, Bandpass-, usw.) für das Identifizieren der Sonde Mittelpositionen entsprechend zu bestimmen. Umfangreiche Hintergrund für diese entscheidenden Schritte wird von Crocker und Grier beschrieben. </li><li> Verwenden Sie die Software, um jedes Sondenposition für alle Video-Frames automatisch zu ermitteln und verknüpfen diese Positionen in Bahnen. </li><li> Verwenden Sie die Bahndaten, die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) als Funktion der Verzögerungszeit zu berechnen, wobei Sie auf die entsprechende Raumkalibrierungsfaktor (um pro Pixel) für die spezifische Objektiv, jeder Pixel-Binning, etc. gelten (in der Regel durchgeführtin Meta-Daten). </li><li> Berechnen G * (mit der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung berücksichtigt die Grenzen der Anwendbarkeit von GSER für eine bestimmte Probe 24,28,43. Alternativ können Benutzer möchten ECM Eigenschaften direkt von MSD durch einen einfachen Vergleich Potenzgesetz Skalierung, Hochebene zu interpretieren Werte, Indices Heterogenität oder andere Parameter. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.6 für jede SFZ im Experiment. </li><li> Zusammen registrieren Positionsdaten aus Schritt 3.4 mit viskoelastischen Moduli bei einer bestimmten Frequenz von Interesse. Je nach Hersteller des Mikroskops verwendet wird, kann dieser Schritt durch eine benutzerdefinierte Routine, die Mikroskop Metadaten oder Positionsdaten können manuell tabellieren liest erleichtert werden. </li><li> Verwenden Sie 3D-Interpolation Funktionen, um eine räumliche Karte Rheologie der ECM zu generieren. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll führen wir eine robuste und breit anwendbare Strategie für längs Tracking lokale Änderungen in ECM Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Wir stellen uns vor, dass diese Methodik könnte durch Krebs Biologen und Biophysiker interessiert mechanosensitive Verhalten in Matrixumbau bei Tumorwachstum und Invasion Prozesse verwickelt angenommen werden. Präzise Quantifizierung der Matrix Abbaukinetik kann besonders für diejenigen, die Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen, Lysyloxidase oder andere...

Es ist klar, von einer wachsenden Zahl von Hinweisen in der Literatur, dass Krebszellen, wie bei nicht-malignen Säuger Epithelzellen, reagieren sehr sensibel auf die mechanischen und biophysikalischen Eigenschaften der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) und andere Mikrokomponenten 9.1. Elegante mechanistische Studien Einblicke in die Rolle der extrazellulären Steifigkeit als eine komplexe Signal mechanosensitive Partner, der malignen Wachstumsverhalten und Morphogenese 2,3,10,11 reguliert ist. Diese Arbeit wurde insbesondere durch die Entwicklung von 3D in vitro-Tumormodellen, die biologisch relevante wiederherzustellen Gewebearchitektur und können in Trägermaterialien mit maßgeschneiderten Mechanik angebaut und durch optische Mikroskopie 12-19 abgebildet werden erleichtert. Jedoch ist die andere Seite dieser mechanoregulatory Dialog zwischen Tumor und Mikroumgebung, durch die Krebszellen wiederum Veränderung der Fließeigenschaften ihrer Umgebung bleibt etwasschwieriger zu studieren. Zum Beispiel während der Invasion Prozesse, die Zellen am Rande eines Tumors kann epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und erhöhen die Expression von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die lokalen Abbau von ECM 20-22, die wiederum Einfluss auf mechanosensitive Wachstumsverhalten führen andere proximalen Tumorzellen. Durch eine Vielzahl von biochemischen Prozessen, die Krebszellen die lokale Steifigkeit ihrer Umgebung wählen ständig auf und ab, um verschiedene Prozesse zu unterschiedlichen Zeiten anpassen. Die hier beschriebene Methode ist durch die Notwendigkeit für analytische Werkzeuge, die lokale Veränderungen in der Steifigkeit und Nachgiebigkeit der ECM während des Wachstums, die mit 3D-Tumormodellen integriert ist und in Längsrichtung mit biochemischen und phänotypische Veränderungen korreliert ohne Beendigung der Kultur werden kann berichten motiviert. Auf der Suche nach einem geeigneten Verfahren in diesem Kontext zu implementieren, tritt Partikelverfolgungs Mikrorheologie (PTM) als starke Kandidaten.Diese Methode, die ursprünglich von Pionier Mason und Weitz 23,24 nutzt die Bewegung der Tracer-Sonden in einem komplexen Fluid eingebettet sind, um die frequenzabhängige komplexe viskoelastische Schermodul G * (ω) in Mikron Längenskalen zu melden. Dieser allgemeine Ansatz wurde mit mehreren Varianten für unterschiedliche Anwendungen in weichen kondensierten Materie, Kolloide, Biophysik und Polymerphysik 25-31 geeignet entwickelt. PTM hat gewisse Vorteile gegenüber anderen Methoden, da die Messwerte von lokalen Viskoelastizität durch zerstörungsfreie Videoabbildungs ​​biochemisch inaktive Tracer-Sonden, die zum Zeitpunkt der Kulturansatz aufgenommen werden und bleiben an Ort und Stelle über einen längeren Zeitraum des Wachstums bereitgestellt. Dies steht im Gegensatz zu Gold Standardmessungen mit einer oszillierenden Schergroß Rheometer, was notwendigerweise erfordert Beendigung der Kultur und meldet den Groß makroskopischen Rheologie der Probe statt Punktmessungen innerhalb der komplexen 3D Tumor microenvironment. In der Tat eine Reihe von Studien haben den Nutzen der Interpretation von Messungen der Sonde Tracer Bewegungen in oder rund um Krebs oder Nicht-Krebs-Zellen, um Verformungen der Zellmigration 32, mechanische Beanspruchung von einem expandierenden Sphäroid 33, intrazelluläre Rheologie 34,35 induziert zu bemessen dargestellt und mechanische Spannungen und Dehnungen in Geweben entwickelt 36, und die Beziehung zwischen Porengröße und Invasion Geschwindigkeit 37 zuzuordnen. Andere Techniken für Mikrorheologie wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) implementiert werden kann, sondern in erster Linie zur Untersuchung von Punkten auf der Oberfläche der Probe und kann auch Kultur Sterilität, die Längs Messungen erschweren 38 darstellen. Hier ein umfassendes Protokoll umfasst Methoden für das Wachstum der 3D Tumorsphäroide geeignet für den Transfer in ECM mit eingebetteten Fluoreszenzsonden für Video-Partikel-Tracking-und Analyse-Methoden für die zuverlässige Abbildung räumlicher beschreiben wirVeränderungen im Laufe der Zeit Mikrorheologie in der Kultur. In der vorliegenden Implementierung werden 3D-Tumormodellen in Multiwell-Format mit Blick auf Einbau von Mikrorheologie Messungen mit anderen traditionellen Tests (zB Zytotoxizität), die dieses Format ist förderlich für gewachsen. In dieser repräsentativen Darstellung dieser Methodik wir Kultur in vitro 3D-Sphäroiden mit PANC-1-Zellen, eine etablierte Pankreaskrebszelllinie bekannt, Sphäroiden 39, sondern alle hier beschriebenen Messungen bilden, sind breit anwendbar zu studieren, von soliden Tumoren mit einer Vielzahl von Zelllinien geeignet für 3D-Kultur. Da diese Methode von Natur-basierte Bildgebung ist es ideal für Co-Registrierung von hochauflösenden Mikrorheologie Daten mit großen Durchlicht-Sichtfelder, die Veränderungen in der Zellwachstum, Migration und Phänotyp berichten geeignet. Die Umsetzung der PTM integrierten Durchlichtmikroskopie auf diese Weise davon ausgegangen, reproduzierbare Positionierung der Mikroskoptisch whICH ist auf motorisierte kommerzielle Weitfeld-Epifluoreszenz biologische Mikroskope der Regel zur Verfügung. Die folgende entwickeltes Protokoll kann mit jedem vernünftig ausgestattet automatisierten Fluoreszenzmikroskop biologischen umgesetzt werden. Dies ist ein von Natur aus datenintensive Methode, die Übernahme von Gigabyte an digitalen Videomikroskopie für die Offline-Verarbeitung erfordert. In dem folgenden Protokoll, Protokoll 1 bezieht sich auf die anfängliche Herstellung von Tumor-Spheroide, die hier mit Überlagerung auf Agarose beschrieben, konnte aber mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie hängenden Tropfen 40 oder Rotationskultur 41 Techniken ersetzt werden. Protokoll 2 beschreibt den Prozess der Einbettung Sphäroiden in einer Kollagengerüst, obwohl alternativ könnte in vitro 3D Tumoren durch Einkapselung oder Einbettung von resuspendierten Zellen in ECM 12,15, anstatt einzelne vorgeformte nichthaft Sphäroide gezüchtet werden. Nachfolgende Protokolle beschreiben Verfahren zur obtaining zeitaufgelöste Messungen Mikrorheologie durch Erfassen und Verarbeiten von Videomikroskopiedaten. Die Datenverarbeitung wird mit MATLAB, die Nutzung von Open-Source-Routinen für PTM auf Algorithmen ursprünglich von Crocker und Grier 42, die auch ausgiebig für verschiedene Software-Plattformen entwickelt, gebaut beschrieben (siehe http://www.physics.emory.edu/ beschrieben ~ Wochen / IDL /).

<table><tbody><tr><td>Rinder-Typ-1-Kollagen</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornien</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>oder andere geeignete</td>Zelltyp-Fluoreszenz-Mikrosphären</tr><tr><td></td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Speicherfolien</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>oder geeignete Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObsever Mikroskop</td><td>Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td></td><td>inklusive Hochgeschwindigkeitskamera und Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>MATLAB-Software</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

längs messung der extrazellulären matrix steifigkeit in 3d tumormodelle mit particle-tracking mikrorheologie

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Die mechanische Mikro wurde gezeigt, als entscheidender Regulator der Tumorwachstumsverhalten und die Signalisierung, die selbst umgebaut wird und als Teil eines Satzes von komplexen, zwei-Wege mechanosensitive Wechselwirkungen modifiziert handeln. Während die Entwicklung von biologisch relevanten 3D-Tumormodellen haben mechanistische Studien über die Auswirkungen der Matrix Rheologie auf das Tumorwachstum erleichtert die inverse Problem der Zuordnung Veränderungen in der mechanischen Umgebung von Tumoren induziert bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir die Umsetzung der Partikel-Tracking Mikrorheologie (PTM) in Verbindung mit 3D-Modellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs als Teil eines robusten und brauchbarer Ansatz zur Längs Überwachung physikalischer Veränderungen in der Tumor-Mikroumgebung, in situ. Die hier beschriebene Methodik integriert ein System zur Herstellung von 3D-Modellen in vitro in einem Modell der extrazellulären Matrix (ECM) Gerüst aus Typ I-Kollagen eingebettet mit fluoreszenzmarkierten Sonden für gleichmäßig verteilte position-und zeitabhängigen Messungen Mikrorheologie gesamten Probe. In vitro Tumoren werden plattiert und parallel Bedingungen mit Multiwellfolien untersucht. Gestützt auf etablierte Verfahren, sind Videos von Tracer-Sonde Bewegungen über das Generalized Stokes Einstein Beziehung (GSER), um die komplexen frequenzabhängigen viskoelastischen Schermodul G * (ω) berichten umgewandelt. Da dieser Ansatz Imaging-basierte, wird die mechanische Charakterisierung auch auf große Durchlichtraum Feldern zugeordnet, gleichzeitig berichten qualitative Veränderungen in 3D Tumorgröße und Phänotyp. Repräsentative Ergebnisse zeigen, kontras mechanische Reaktion in Teilbereichen mit lokalisierten Invasion-induzierte Matrixabbau sowie System-Kalibrierung, Validierung werden Daten vorgestellt. Unerwünschte Ergebnisse aus gemeinsamen experimentelle Fehler und Problemlösungen dieser Fragen werden ebenfalls vorgestellt. Die 96-Well-Format 3D-Beschichtung Kultur in diesem Protokoll implementiert ist, ist conducive zu Korrelation von Mikrorheologie Messungen mit therapeutischen Screening-Tests oder der molekularen Bildgebung, neue Einblicke in die Auswirkungen der Behandlungen oder biochemische Reize auf die mechanische Mikroumgebung zu gewinnen.

Um die Gültigkeit von G * (ω)-Messungen an lokalisierten Positionen in einem komplexen Modell Tumor-Mikroumgebung zu verifizieren, wurden zwei erste Validierungsexperimente durchgeführt. Zuerst haben wir versucht, unsere Messungen gegen den &quot;Goldstandard&quot; der Groß oszillierende Scher rheometry validieren. Wir stellten identische Proben von Kollagenmatrix (ohne Zellen) in einer Konzentration von 1,0 mg / ml Kollagen. Diese Proben wurden mit einer Schütt Rheometers (TA Instruments AR-G2, unter Verwendun...

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, longitudinale Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix in dreidimensionalen Krebsmodellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Krebszellen gewonnen und der Tumorsphäroid mittels einer geeigneten Methode solange kultiviert wird, bis die gewünschte Größe erreicht ist. Der zweite Schritt besteht darin, den Tumorsphäroid in Kollagen oder einer anderen geeigneten extrazellulären Matrix einzubetten.Anschließend wird das Raster aus Messpunkten erstellt und an jedem Punkt ein Video aufgenommen. Der letzte Schritt besteht in der Analyse der Videodaten sowie der Berechnung und Koregistrierung realer logischer Eigenschaften an jedem räumlichen Punkt. Letztendlich nutzt dieses Protokoll die Analyse von Tracer-Sonden-Trajektorien, um räumliche Veränderungen der Mechanik der extrazellulären Matrix longitudinal und nicht-destruktiv zu quantifizieren.Die Idee besteht darin, dass dieser Ansatz durch die Kombination bildgebender Messungen der extrazellulären Matrix aus der Radiologie mit in-vitro-3D-Tumormodellen, die Interaktionen der extrazellulären Matrix wiederherstellen, quantitative Einblicke in zeitabhängige Veränderungen des mechanischen Mikromilieus ermöglichen kann, die mit Tumorwachstum, Invasion und Therapieantwort einhergehen. Die in diesem Video gezeigte Methode verwendet einen Agarose-Overlay-Ansatz, um nicht-ankerende 3D-Organoide aus der etablierten Pankreaskarzinom-Zelllinie Pan-1 zu erzeugen. Geben Sie zunächst 10 Milliliter zellkulturgeeignetes Wasser mit 0,1 Gramm Agarose zusammen, um eine 1 %ige Agarose-Lösung zu erhalten.Erhitzen Sie die Aros-Lösung vor der Aliquotierung auf über 70 Grad Celsius. Geben Sie jeweils 40 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Gewinnen Sie die Krebszellen durch Trypsin und bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension vor, bevor Sie die Zellsuspension auf 1000 Zellen pro Milliliter verdünnen. Fügen Sie 100 Mikroliter dieser Verdünnung in das Loch mit dem ausgehärteten Aros-Bett hinzu.Platzieren Sie die Probe über Nacht auf einem Schüttler in einem Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 %CO2 eingestellt ist. Entfernen Sie die Probe vom Schüttler und geben Sie 100 Mikroliter Zellkulturmedium hinzu. Inkubieren Sie das resultierende Steroid, bis der gewünschte Durchmesser erreicht ist. Beispielsweise wird nach neun Tagen ein Steroid etwa 450 Mikrometer im Durchmesser betragen.Bereiten Sie zunächst einen Arbeitsplatz in einer laminaren Luftstromwerkbank mit zwei zwei-Milliliter-Vials vor. Vial eins enthält das Tumorsyndrom, Vial zwei dient als zellfreie Kontrolle. Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus carboxylierter, ein Mikrometer durchmessender, fluoreszierender Tracer-Proben vor, indem Sie zwei Teile Stammlösung zu 25 Teilen steriler Wasser hinzufügen.Entnehmen Sie eine Flasche mit 3,1 Milligramm pro Milliliter Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und stellen Sie sie auf Eis. Aliquotieren Sie 125 Mikroliter Kollagen und anschließend 50 Mikroliter verdünnte Tracer-Probelösung in Gefäß eins. Vortexen Sie kurz, um die Proben zu verteilen. Geben Sie dann 235 Mikroliter geeignetes Zellkulturmedium mit Phenolrot hinzu, sodass sich ein Gesamtvolumen von 410 Mikrolitern ergibt, und vortexen Sie erneut kurz. Entfernen Sie danach 205 Mikroliter und geben Sie diese in Gefäß zwei. Fügen Sie als Nächstes etwa zwei Mikroliter einer einmolaren Natriumhydroxid-Lösung zu dem Gefäß hinzu.Eine zur Neutralisierung des pH-Werts der Lösung kurz verwirbeln, um sie zu mischen. Anschließend sofort wieder in das Eisgestell zurückstellen, damit die Mischung nicht mit der Aushärtung beginnt. Vorsichtig 40 Mikroliter Medium aus der Vertiefung, die das Tumorszintigramm enthält, entnehmen.Behalten Sie diese 40 Mikroliter während des nächsten Schritts zurück. Überprüfen Sie die Vertiefung, um festzustellen, ob das Steroid im vorherigen Schritt entfernt wurde. Falls nicht, geben Sie die 40 Mikroliter zurück in die Vertiefung und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.Falls dies der Fall war, geben Sie die 40 Mikroliter, die das Steroid enthalten, in das Gefäß eins. Rühren Sie das Gefäß eins vorsichtig um, bevor Sie das Gemisch portionsweise je 60 Mikroliter in drei separate Vertiefungen einer 96-Loch-Platte überführen. Untersuchen Sie jede Vertiefung nach Zugabe des Gemischs mit einem Mikroskop, um festzustellen, in welcher Vertiefung sich das Steroid befindet. Geben Sie anschließend etwa zwei Mikroliter einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung und 40 Mikroliter Zellkulturmedium in Gefäß zwei und wirbeln Sie es vor der Aliquotierung um. 60&nbsp;Mikroliter dieser Mischung in eine leere Vertiefung der 96-Loch-Platte pipettieren und als zellfreie Kontrolle kennzeichnen. Die Platte in einen 37&nbsp;°C warmen Inkubator stellen und mindestens eine Stunde lang zur Bildung eines Rasters aus Messpunkten inkubieren. Zunächst die Probenplatte vom Inkubator auf den Mikroskopständer übertragen.10 Minuten verstreichen lassen, damit die Probe auf Raumtemperatur akklimatisiert werden kann, falls kein beheiztes Objekttischchen verfügbar ist. Die Probe mit Objektiven geringer Vergrößerung beobachten, um sicherzustellen, dass sie intakt ist und zur Bildgebung bereitsteht. Die Position des Tumors innerhalb der Vertiefung bestimmen und diese mit einem durchgehenden Lichtbild für die anschließende räumliche Ko-Registration dokumentieren.Typischerweise ergeben 20 Probenahmepunkte in jeder Vertiefung, die in konzentrischen Ringen um den S-Sphäroid verteilt sind, ausreichend detaillierte Ergebnisse. Bewegen Sie den Objekttisch zu jeder gewünschten Position und verwenden Sie die Mikroskop-Software, um die XNY-Koordinaten aufzuzeichnen. Schalten Sie das Mikroskop auf ein Objektiv mit hoher Vergrößerung und wählen Sie den entsprechenden Filterwürfel für die x-Anregungswellenlänge der Tracer-Proben.Unter Verwendung der Liste der erstellten Punkte zum ersten Punkt im Raster bewegen. Den Fokus anpassen, um den Boden der Vertiefung zu finden, bevor man nach oben geht. Um ein Blickfeld zu finden, das mehrere scharf abgebildete Tracer-Proben enthält.Beobachten Sie das Intensitätshistogramm und passen Sie die Belichtungsintensität und -zeit so an, dass der größtmögliche Dynamikumfang erreicht wird, wobei sichergestellt werden muss, dass das Bild nicht gesättigt wird. Nehmen Sie eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 Millisekunden pro Bild auf und speichern Sie sie mit einer geeigneten Benennungskonvention. Berühren Sie während der Aufnahme weder das Mikroskop noch den Tisch.Wiederholen Sie die Aufnahme für jeden Probenpunkt im Raster. Fahren Sie dann fort, indem Sie den Vorgang wiederholen, um ein Raster für jeden Brunnen des Experiments zu erstellen, und wiederholen Sie den gesamten Vorgang für jeden Zeitpunkt während der longitudinalen Überwachung.Um mit der Datenanalyse zu beginnen, kopieren Sie alle Videodaten in einen Analyseordner. Importieren Sie die Bilddaten in MATLAB oder eine andere Analyse-Software.Kalibrieren Sie die Software, indem Sie mehrere Videobilder analysieren, um geeignete Parameter für die Auswahl und Ablehnung zur Identifizierung der Positionen der Sondenmittelpunkte festzulegen. Verwenden Sie anschließend die Software, um automatisch die Position jeder Sonde in allen Videobildern zu bestimmen und diese Positionen zu Trajektorien zu verknüpfen. Nutzen Sie die Trajektoriendaten, um die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) als Funktion der Verzögerungszeit zu berechnen, wobei Sie sicherstellen, dass der geeignete räumliche Kalibrierungsfaktor für das jeweilige Objektiv oder für jedes Pixel-Binning angewendet wird.Berechnen Sie G Stern unter Verwendung der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung unter Berücksichtigung der Anwendungsgrenzen der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung für eine bestimmte Probe. Wiederholen Sie die Analyse-Schritte für jedes Bildfeld im Experiment. Korrelieren Sie Positionsdaten mit dem viskoelastischen Modul I bei einer bestimmten Frequenz von Interesse, abhängig vom Hersteller des verwendeten Mikroskops.Dieser Schritt kann durch eine benutzerdefinierte Routine erleichtert werden, die Mikroskop-Metadaten liest, oder die Positionsdaten können manuell tabelliert werden. Videosequenzen werden an mehreren räumlichen Positionen innerhalb eines repräsentativen Wells aufgezeichnet, der einen 3D-Tumorknoten enthält, und verknüpft, um bei longitudinaler Beobachtung eine räumliche Mikroradiologiekarte der Probe bereitzustellen, die Zellpopulationen am Rand des Gewebes erfasst. Steroide, die in diesem Beispiel verwendet werden, bauen spontan umgebende Kollagenfasern ab und dringen innerhalb weniger Tage in die extrazelluläre Matrix ein.In diesem Beispiel liefert die Ko-Registrierung der Mikrobiologie eine quantitative Aussage über die offensichtliche Invasion in die Matrix, die sich links, nicht jedoch rechts des Steroids befindet. Die longitudinale Überwachung dieser unterschiedlichen räumlichen Bereiche zeigt einen Abfall des Realteils des komplexen viskoelastischen Schermoduls um etwa vier Größenordnungen, der zeitgleich mit der Invasion einhergeht. Vollständige frequenzabhängige Daten verdeutlichen im Kontrast die rheologischen Eigenschaften des Materials in Bereich eins und Bereich zwei am vierten Tag.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass bei der Analyse von Sondenbahnen häufige Fallstricke vermieden werden müssen, die zu unangemessenen Schlussfolgerungen führen können. Wir empfehlen den Lesern, die hier zitierte PTM-Literatur heranzuziehen, die Aspekte wie Probendrift und Interpretation von Heterogenität behandelt. Dieses Verfahren kann mit zusätzlichen longitudinalen oder terminalen Fluoreszenz-Aufnahmen kombiniert werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie mechanische Umbauprozesse mit wichtigen Signalereignissen oder der zytotoxischen Reaktion auf eine Intervention korrelieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Die partikelnachfolgende Mikrorheologie untersucht die Viskoelastizität von Materialien. Hier wird die Technik verwendet, um die Viskoelastizität, die Kriechnachgiebigkeit und die effektive Vernetzungsrolle verschiedener Matrixkomponenten eines bakteriellen Biofilms zu bestimmen. Die Matrix besteht aus polymeren Substanzen, die von den Bakterien sezerniert werden, und ihre Bestandteile bestimmen die Struktur des Biofilms und die mechanischen Eigenschaften.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Hier erklären wir ein Protokoll für die Modellierung der biophysikalischen Mikroumgebung, wo die Vernetzung und eine erhöhte Steifigkeit der Basalmembran (BM), induziert durch Advanced Glycation Endprodukten (AGEs) pathologische Relevanz hat.

Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Erfahren Sie die Particle-Tracking Mikrorheologie zur nicht-destruktiven Analyse der extrazellulären Matrix-Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Diese Methode ermöglicht quantitative Einblicke in mechanische Veränderungen während des Tumorwachstums.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

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