Name: Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Verkapselung zellfreier Transkriptions- und Translationsmaschinerie in Vesikel für synthetische Biologie. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der Proteinproduktion in vitro und bildet die Grundlage für zelluläre Mimiken.

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Die Autoren danken den Armenise-Harvard-Stiftung, die Marie-Curie-Trentino COFUND (ACS), die Autonome Provinz Trient (Ecomm) und CIBIO für die Finanzierung.

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage <ol><li> Entschlacken Plasmid aus einem Standard-Labor-Stamm von E. coli, wie E. coli DH5a oder Nova Blau mit einem kommerziellen Kit. Alternativ kann eine lineare PCR-Produkt in ähnlicher Weise mit einem kommerziellen Kit gereinigt werden. Eluieren der DNA mit H 2 O nur. </li><li> Phenol-Chloroform extrahieren die DNA-Lösung 26. </li><li> Bestimmen der DNA-Konzentration und Reinheit durch UV-Absorption oder andere geeignete Verfahren, zB. Es ist wichtig, hochreinen DNA für eine effiziente Transkription-Translation verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbereiten der Thin Film Lipid <ol><li> Das trockene Lipidpulver und lösen sich in Lösungsmittel. Für 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) werden Stammlösungen in Chloroform bei einer Konzentration von 40 mg / ml hergestellt. Hinweis: Organische Lösemittel muss immer mit Glaspipetten und Flaschen verarbeitet werden. Mit anderen Worten, sind die Kunststoffteile nicht verwendet werden. Shop stock Lösungen in luftdichten, Lösungsmittel beständig Braunglasflaschen bei -20 ° C, vorzugsweise unter Argon. </li><li> Aliquot 12 mmol POPC (220 ul von 40 mg / ml Stammlösung) in eine 5 ml-Rundkolben. </li><li> Verdampft das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (Abbildung 1), um die dünne Lipid-Film zu erzeugen. <ol><li> Befestigen Sie den Rundkolben der Destillation Rohr mit einem kreisförmigen Clip und starten Sie die Rotation des Kolbens. </li><li> Initiieren Sie die Zirkulation des Wassers durch den Verflüssiger. Mit einem Wärmebad ist nicht notwendig, da Chloroform hat einen niedrigen Siedepunkt von 61,2 ° C bei Normaldruck. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das System zur Atmosphäre hin offen, indem dass der Hahn geöffnet ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe und schließen Sie langsam den Hahn, um das Vakuum auf das System anzuwenden. </li><li> Ein dünner Lipidfilm an der Wand des Rundkolben während Rotationsverdampfung Bilden eines opaken Films abgelagertdas ist mit bloßem Auge sichtbar. Lassen Sie die Rotationsverdampfen für 0,5-2 Stunden fortsetzen. Um den Prozess zu stoppen, langsam loslassen den Unterdruck, stoppen Sie die Rotation, und entfernen Sie den Rundkolben. </li></ol></li></ol> 3. Lipid Resuspension und Vesicle Homogenisierung <ol><li> 1 ml 18,2 MOhm H 2 O auf die dünne Lipid-Film direkt in den Rundkolben. Kräftig Wirbel die Lösung bei maximaler Geschwindigkeit etwa 3.200 Umdrehungen pro Minute, bis die Lipid-Film löst sich von Glas, die mit bloßem Auge beobachtbar ist. </li><li> Übertragen Sie die Lipid-Dispersion in ein 2 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Set-up ein Ring stehen, um einen Homogenisator mit einer 5 mm Spitze zu halten. Legen Sie eine Mikrozentrifuge Stand unterhalb der Homogenisator einen sicheren Halt des Lipiddispersion. Spülen Sie die Dispergierelement der Homogenisator durch Eintauchen der Spitze in 18,2 MOhm H 2 O und läuft für ein paar Sekunden. </li><li> Legen Sie die Dispergierelement direkt in den Lipiddispersion Gewährleistung than der Spitze nicht berühren den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens. Homogenisieren für 1 min auf Stufe 4 oder 14.000 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 4. Vesicle Extrusion und Gefriertrocknung <ol><li> Montieren Sie die Teile des Mini-Extruder (Abbildung 2), die aus einem äußeren Gehäuse besteht und eine Überwurfmutter, die zwei Teflon-Membran unterstützt, zwei O-Ringen und einem Teflon Lager beherbergt. <ol><li> Zeigen die beiden O-Ringe in die Nuten der inneren Membran unterstützt. Prewet zwei Filtern und einem 400 nm Membran. Die Filter werden auf die Teflon innerhalb der O-Ringe werden mit der Membran zwischen ihnen platziert. </li><li> Zeigen die Membran unterstützt in den Extruder äußeren Gehäuse und der Membran durch zwei Filter zwischen den O-Ringen umgeben. Legen Sie die Teflon Lager im Inneren des Gehäuses und befestigen Sie die Überwurfmutter und von Hand anziehen. </li></ol></li><li> Spülen Sie zwei Spritzen und füllen mit einem 18,2 MOhm Wasser. Legen Sie die Spritze Nadeln in das kleine holes im Teflon an jedem Ende des Extruders Montage. Die Nadeln sollten in leicht schieben, nicht mit Gewalt die Nadeln. Sichern Sie den Extruder mit den Spritzen in den Extruder Gehäuse und befestigen. </li><li> Führen Sie das Wasser durch den Extruder, indem Sie langsam das Wasser aus einer Spritze und in die andere. Dies stellt einen Durchgang. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Durchgänge gewährleisten, dass es keine Lecks vorhanden sind. Entfernen Sie die Spritze mit Wasser und entsorgen des Wassers. </li><li> Füllen einer Spritze mit der Probe, dem Extruder befestigt und langsam an den Vesikel-Lösung durch die Membran, wie oben beschrieben in Schritt 4.3. Wiederholen 10x für insgesamt 11 Kanäle. Da die Extrusion Prozess wird die Probe weniger trübe und leichter durch die Membran zu drücken. Eine plötzliche Abnahme des Widerstandes jedoch gewöhnlich einen Zerreißen der Membran. </li><li> Übertragen Sie die extrudierte Vesikel-Lösung und machen 40 ul Aliquots der Vesikel in Mikrozentrifugenröhrchen.Blitz einfrieren Jedes Aliquot entweder Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff. </li><li> Lyophilisieren jedes Aliquot mit einem Zentrifugalverdampfer Nacht bei 30 ° C. Bewahren Sie die lyophilisierten leeren Vesikel bei -20 ° C. </li></ol> 5. Kapselung Transkriptions-Translations-Maschinerie <ol><li> Mischen der Komponenten des Transkriptions-Translations-Reaktion fügt 20 Einheiten RNase-Inhibitor. Inkubation auf Eis. </li><li> In der DNA-Vorlage. Für eine Kontrollreaktion, 250 ng von einem Plasmid oder einem ähnlichen mVenus fluoreszierendes Protein hinter einem T7-Transkriptions-Promotor und ein starker E. coli Ribosomenbindungsstelle empfohlen. </li><li> Bringen Sie das Endvolumen auf 25 ul mit RNase-freiem Wasser. </li><li> Hydrate ein Aliquot lyophilisierter Vesikeln (aus Stufe 4.6) mit 10 ul der Umsetzung in Schritt 5.3 montiert. Vortexen der Mischung, bis die Bläschen sind suspendiert. Das sollte weniger als 30 Sekunden. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 30 min, um die Vesikel zu schwellen. </li><li> Verdünnen Sie die Vesikel Mischung 20-fach bis zu einem Endvolumen von 30 ul durch Zugabe von 1,5 ul Vesikel in 27,0 ul 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 und 1,5 ul von 20,2 mg / ml Proteinase K. DNase und RNase kann auch an dieser Stelle hinzugefügt werden, als Alternative zur Proteinase K extravesikulären Material abbauen zu können. </li><li> Inkubieren für mindestens 2,5 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> 6. Mikroskopie <ol><li> Untersuchen Sie die Vesikel und den Fortschritt des fluoreszierenden Proteins Produktion zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Vesikel werden einen größeren Durchmesser als die 400 nm Porengröße der Membran für Vesikel Extrusion. <ol><li> Bereiten Sie einen Probenraum, indem ein 20 x 5 mm Silizium-Spacer auf eine Standard-Objektträger. Je 10 ul Vesikel in den Probenraum. Legen Sie einen silikonisierten Deckglas über die Kammer. </li><li> Beachten Sie die Vesikel mit einem 63X Öl-Dispersion or ähnliches Ziel von Hellfeld-und Fluoreszenz-Mikroskopie mit dem entsprechenden Filter-Set für die Ausgebeuteten fluoreszierenden Proteins. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Obwohl zellfreien synthetischen Biologie ist immer noch in den Kinderschuhen steckt, haben Fortschritte ein Fundament, von dem zunehmend komplexen Zell-ähnlichen Systemen gemacht werden verlegt. Die Wiederherstellung der Transkriptions-Translations-Maschinen aus vollständig definierten Komponenten 9 innerhalb von Vesikeln 28 war von besonderer Bedeutung bei der Erleichterung später Anstrengungen beim Bau umweltfreundlicher reagiert künstliche cells17, 18. Ebenso künstlichen Zelle Studien verwendet worden, um Sonde Evolutionsprozessen 4,29,30, den Mechanismus zu RNA-und Proteinsynthese 22,31, die Einflüsse von metabolischen load32, 33 und die Anordnung von viralen Partikeln 34. Wichtig ist, dass genug Wissen existiert nun, dass grundlegende zelluläre Funktion innerhalb von Vesikeln können im Labor nach diesen früheren Berichten und den Protokollen beschrieben rekonstituiert werden. Abgesehen davon, dass einfach die beschriebene Kapselung procedure hat mehrere Vorteile. Zum Beispiel können viele leere, gefriergetrockneten Aliquots Vesikel im Voraus gebucht werden und bei -20 ° C für die spätere Verwendung. Das Protokoll nicht Gegenstand biologischer Moleküle, organische Lösungsmittel, starken Temperaturschwankungen oder lange Zeiträume der Dialyse. Wir erwarten, dass die Sanftheit des Verfahrens wird den Einbau von zusätzlichen Komponenten zu erleichtern, wie gebraucht. Wir haben auch keine negativen Auswirkungen auf die Änderung der Lipidzusammensetzung der Membran auf Einkapselung oder Transkriptions-Translations-Effizienz beobachtet. Daher könnte Lipide zugänglicher den Einbau von Membranproteinen, spezifische Morphologie oder Visualisierung denkbar ausgenutzt werden. Der größte Nachteil bei dem beschriebenen Verfahren ist, dass die resultierenden Vesikel nicht homogen in der Größe oder Lamellaritätsindex. Für viele Anwendungen sind diese Schwierigkeiten nicht mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen. Jedoch können bei Bedarf weitere Schritte schmalen th aufzunehmene Größenverteilung und verringern die Schichten der Membranen, wie weitere Runden der Extrusion nach der Einkapselung, Gefrier-Auftau-, Dialyse oder 35. Zweifellos bessere Methoden, die diese und andere Probleme zu umgehen entwickelt werden. Bis dahin finden wir das hier beschriebene Protokoll zu gut für den Bau von zellulären Mimik geeignet sein.

Zellfreie, in vitro Transkriptions-Translations-Reaktionen und die Erzeugung von Vesikeln aus synthetischen Lipiden sind nichts Neues. Doch die Kombination der beiden in eine zelluläre imitieren ist deutlich mehr challenging1-6. E. coli Zellextrakte mit oder ohne T7-RNA-Polymerase kann als Quelle der Transkriptions-Translations-Maschinerie 7,8 verwendet werden. Zellextrakte Nutzen aus dem Vorhandensein von zusätzlichen zellulären Komponenten, die Proteinexpression und Falten erleichtern. Alternativ kann auch eine Mischung aus einzeln gereinigt RNA-und Protein-Moleküle, dh die PURE System 9, können verwendet werden, um zu vermitteln intravesikulären Proteinsynthese 4,10-14 werden. Die PUR-System ermöglicht den Bau von vollständig definierten zellulären Mimik und nicht von der Nuklease-Aktivität in Zellextrakten vorhanden leiden. Praktisch bedeutet dies, dass viel weniger DNA-Template benötigt wird, wodurch Prozesse mit niedrigem Verkapselungswirksamkeit 11 </sup&gt;. Obwohl weniger häufig verwendet werden, können zelluläre Mimetika mit Zellextrakten aus eukaryotischen cells15 abgeleitet gebaut werden. Bisher wurden genetisch kodierte gekapselten Kaskaden und zellulären Mimetika, die die Umwelt spüren worden 16-18 gemeldet. Der einfachste Weg, Transkriptions-Translations-Reaktionen zu überwachen ist, die Fluoreszenz-oder Lumineszenz von genetisch codierten Elemente zu messen. Typischerweise werden Glühwürmchenluciferase 19 oder GFP verwendet, obwohl in vitro Reaktionen häufig durch radioaktive Markierung gemessen werden. Fluoreszenzdetektion ermöglicht zusätzlich zur Überwachung der Populationen von Vesikeln 20,21 durch Durchflusszytometrie basierende Verfahren und bietet damit einen Einblick in die stochastische Natur der biologischen Fortsätze. Diese Monitoring-Methoden wurden genutzt, um eine kleine Gruppe von Design-Regeln und eine Bibliothek von Teilen, von denen aus zu bauen, darunter eine Sammlung von fluoreszierenden Proteinen, die kompatibel mit i definierenn vitro Transkriptions-Translations-22, den Einfluss der genetischen Organisation Ausdruck 22, die Aktivität Sigmafaktoren 16 und die Effizienz der Transkriptionsterminatoren 23. Dennoch bleibt viel zu tun, die die Fähigkeit des Gebäudes in vitro vorhersehbar, genetisch codierte Geräte erhöhen werden muss. Es gibt viele Methoden, um Vesikel zu machen. Die gängigsten Methoden sind abhängig von der Erzeugung einer dünnen Lipidfilm auf einer Glasoberfläche durch Resuspension in wässrigen Solution24 gefolgt. Wenn die wässrige Lösung Transkriptions-Translations-Maschinen, zum Beispiel, dann ein Teil der Vesikel enthalten würde, die notwendigen Komponenten zur Herstellung von Proteinen. Allerdings ist die Verkapselungseffizienz solcher Verfahren gering, so dass nur ein kleiner Prozentsatz von Vesikeln aktiv sind. Viele der alternativen Methoden durch viel höhere Kapselung eff gekennzeichnetizienz nutzen die Umwandlung der Wasser-in-Öl-Emulsion Tröpfchen Vesikel. Während es wahrscheinlich ist, dass solche Methoden werden in Zukunft alltäglich, leiden derzeit diese Methoden von der Notwendigkeit von Spezialgeräten und geben Vesikel mit veränderten Zusammensetzungen Membran 25. Ein deutlicher Vorteil der Wasser-in-Öl-Vesikel-Verfahren ist das Potential Membran Lamellaritätsindex steuern. Das hier beschriebene Verfahren ist auf der dünnen Fettfilm Protokoll vom Yomo Labor 11 mit leichten Modifikationen einschließlich einer zusätzlichen Homogenisierung Schritt beschrieben wird. Diese Methode ist einfach, billig und robust Vesikel gibt auch für die Verkapselung von Transkriptions-Translations-Maschinen geeignet.

<table><tbody><tr><td>Quick Spin Mini-Vorbereitungskit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>NanoDrop 1000</td><td>NDB767ND</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>770557</td><td>MW 760 g/mol Übergangstemperatur -2 &deg; C CAS# 26853-31-6</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836</td><td>wasserfrei, >99,5%</td></tr><tr><td>Phenol-choloroform-isoamylalkohol 25:24:1, für die Molekularbiologie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803-100mL</td><td>Gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grade Fluka</td><td>496189-1L</td><td>Enthält Ethanol mit 0,5-1,0 % v/v als Stabilisator</td></tr> Braune <tr><td>Braunglasflaschen</td><td>VWR</td><td>89043-518</td><td>55X 48 mm</td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td><td>Z563846EU-1EA</td><td>Mit Wagenheber und Wasserbad, 29/32 Gelenk 240 V</td></tr><tr><td>Analoger Wirbelmischer</td><td>VWR</td><td>945300</td><td>Drehzahl 1.000-3.200 U/min</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td><td>3420000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Extruderfilter</td><td>Whatman</td><td>610014</td><td>Ablaufscheibe 10 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Extruder Polycarbonat Membran 400 nm</td><td>Whatman</td><td>61007</td><td>Nuklepore Polycarbonat&nbsp;</td></tr><tr><td>Schnellvakuum</td><td>Labconco</td><td>7970011</td><td>Centritrap DNA-Konzentrator</td></tr><tr><td>PURExpress Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>NRM #E6800S</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Inhibitor (40.000 U/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (20,2 mg/ml)</td><td>Fermentas</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss Observer Z1mit eine AxioCam MRm Kamera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RealTime</td><td>CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonpresse zum Versiegeln&nbsp; &nbsp;-Molecular Probe Life Technologies</td><td></td><td>P18174</td><td>Beständig von&nbsp; -25-30 &deg; C</td></tr><tr><td>Kreisabdeckfolien aus silikonisiertem Glas</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>&nbsp; &nbsp; Durchmesser= 22 mm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die verkapselung von zellfreie transkription und Übersetzung machinery in vesikel über die errichtung von cellular mimics

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Da das Interesse Verschiebungen von einzelnen Molekülen in den Systemen der Moleküle haben eine zunehmende Zahl von Laboratorien versucht, von unten nach oben, die zelluläre Mimik besser zu vertreten, die Komplexität der zellulären Leben aufzubauen. Bis heute gibt es eine Reihe von Wegen, die ergriffen werden, um zelluläre compartmentalized Mimik bauen könnte, einschließlich der Nutzung von Wasser-in-Öl-Emulsionen, mikrofluidischen Bauteilen und Bläschen. Jede der Optionen hat spezifische Vor-und Nachteile. Zum Beispiel, geben Wasser-in-Öl-Emulsionen hohe Verkapselungseffizienz aber nicht gut imitieren die Permeabilitätsbarriere lebenden Zellen. Der primäre Vorteil der hier beschriebenen Verfahren ist, dass sie sich einfach und billig zu implementieren ist. Transkriptions-Translations-Maschinerie im Inneren des Phospholipid-Vesikel durch einen Prozess, gemeinsame Instrumente, wie z. B. einer Zentrifuge Verdampfer und einem Extruder nutzt verkapselt. Die Reaktionen werden durch Fluoreszenz-Spektroskopie verfolgt. Das Protokolls kann für die rekombinante Proteinexpression, den Bau von zellulären Mimik, die Erforschung der Mindestanforderungen für die zellulären Lebens, oder der Montage von genetischen Schaltung angepasst werden.

Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die Fluoreszenz nur im Inneren der Vesikel beobachtet, weil extravesikulären Material enzymatisch abgebaut (Abbildung 3). Für die Expression von mVenus beginnt intravesikulären Fluoreszenz nach 1,5 Stunden bei 37 ° C beobachtet werden und erreicht maximale Fluoreszenzintensität innerhalb von 6 Stunden. Die optimale Temperatur und Inkubationszeit kann in Abhängigkeit von den spezifischen verwendeten Konstrukte. Beispielsweise reifen verschiedenen fluoreszierenden Proteinen sehr unterschiedlich in einer temperaturabhängigen Weise. Mit anderen Worten, ist die Beobachtung der Proteinproduktion nicht allein abhängig Proteinsynthese und Falten, sondern auch von Chromophor-Bildung. Insgesamt kann die Proteinsynthese durch Einbau Membranprotein Poren auf einen Zustrom von abgereichertem Komponenten, die für die Transkription und Translation 27 erlauben erhöht werden. Es wird empfohlen, zur Durchführung einer analogen Transkriptions-Übersetzungention Reaktion in Abwesenheit von Vesikeln, um sicherzustellen, dass die ausgenutzt Genkonstrukt funktionsfähig ist. Diese Steuerung Reaktion wird leichter durch Fluoreszenz-Spektroskopie, anstatt Mikroskopie überwacht. Abbildung 4 zeigt eine in vitro Transkriptions-Translations-Reaktion eines Konstrukts Codierung mVenus. Unverkapseltem Reaktionen geben insgesamt viel höher als vergleichbare Fluoreszenzintensitäten intravesikulären Reaktionen. Dies ist aufgrund der Verkapselung Effizienz und aufgrund der insgesamt intravesikulären Volumen viel kleiner als die extravesikulären Volumen (dh ein Verdünnungseffekt). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Abbildung 1. Der Rotationsverdampfer und Vakuumpumpe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Abbildung 2. Das Gehäuse und Teile des Extruders werden gesondert ausgewiesen. Von links nach rechts, unterstützt Spritze, Überwurfmutter, Teflonlager, innere Membran mit schwarzen O-Ringe einander zugewandten Extruder Außengehäuse und zweite Spritze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Abbildung 3 Fluorescence Bilder mVenus Protein-Produktion in Liposomen A und C:.. Hellfeld Bilder multilamellarer Vesikel nach 1,5 h und 2,5 h und B &amp;# 160; D: Die Herstellung von mVenus durch Fluoreszenz (grün) nach 1,5 und 2,5 Stunden, jeweils visualisiert. Maßstab ist 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> 4. In vitro Kontrollreaktion von verkapselten in vitro Transkription und Translation mVenus. Fluoreszenzintensität wurde alle 5 min über 4 Stunden gemessen. Die Daten wurden mit einem Real-Time-PCR-Gerät erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen.

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zelluläre Nachbildungen von Grund auf zu erzeugen, indem Transkriptions- und Translationsmaschinerie in Vesikel eingeschlossen wird. Dies wird erreicht, indem zunächst ein dünner Lipidfilm hergestellt wird. Anschließend werden nach der Bildung der Vesikel die Komponenten für die Transkription und Translation in vitro zusammengesetzt.Der letzte Schritt besteht darin, die Transkriptions- und Translationsmaschinerie in die Vesikel einzuschließen. Letztendlich kann die Aktivität des zellulären Mimikums mittels Mikroskopie überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Einschlussmethoden, wie Wasser-Öl-Emulsionen, mikroretikuläre Vorrichtungen oder ein Verfahren zur Umwandlung von Wasser-Öl-Systemen in Vesikel, liegt darin, dass diese Methode einfach, kostengünstig ist und robuste Vesikel erzeugt, deren Permeabilitätseigenschaften besonders gut für den Aufbau zellulärer Mimika geeignet sind, die auf genetisch kodierter Proteinfunktion basieren.Diese Methode kann nicht dazu beitragen, zentrale Bereiche der zellfreien und der bottom-up-Synthesebiologie zu erforschen, wie beispielsweise die Definition der minimalen Grundlagen des Lebens und die Entwicklung nicht-lebender, lebensähnlicher Technologien. Um einen dünnen Lipidfilm herzustellen, lösen Sie zunächst POPC in Chloroform mit einer Konzentration von 40 Milligramm pro Milliliter und entnehmen Sie anschließend 12 Mikromol POPC in einen 5-Milliliter-Rundkolben. Befestigen Sie danach den Kolben mithilfe einer runden Klammer sicher am Destillationsrohr eines Rotationsverdampfers.Dann mit Einstellung sechs eine starke, gleichmäßige Rotation des Kolbens starten. Als Nächstes die Zirkulation des Wassers durch die Kühlfalle starten. Das Wasser muss nicht erhitzt werden, da Chloroform einen niedrigen Siedepunkt von 61,2 Grad Celsius hat.Stellen Sie bei einem Atmosphärendruck sicher, dass das System mit der Umgebungsluft in Verbindung steht, indem Sie prüfen, ob der Hahn geöffnet ist, um gleichzeitig das Vakuum an das System anzulegen. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und schließen Sie den Hahn langsam. Lassen Sie die Rotationsevaporation weitere 0,5 bis zwei Stunden lang fortlaufen, nachdem Chloroform mit bloßem Auge nicht mehr sichtbar ist.Um den Vorgang zu stoppen, lassen Sie den Vakuumdruck langsam ab und stoppen Sie die Rotation. Entfernen Sie das Kolbengefäß, und es ist ein undurchsichtiger, dünner Lipidfilm an den Wänden des Kolbens sichtbar, der zur Resuspension des Lipids verwendet wird. Beginnen Sie damit, ein Milliliter 18,2-Megaohm-deionisiertes Wasser zum dünnen Lipidfilm im Rundkolben hinzuzufügen, und wirbeln Sie die Lösung kräftig bei etwa 3.200 U/min, bis sich der Lipidfilm vom Glas löst.Dies sollte ungefähr eine Minute dauern. Überführen Sie danach die Lipid-Dispersion in ein zwei Milliliter fassendes Mikrozentrifugenröhrchen. Richten Sie einen Stativhalter für einen Homogenisator mit fünf Millimeter Spitze ein und stellen Sie eine Mikrozentrifuge bereit.Stellen Sie sich unter den Homogenisator, um die Lipid-Dispersion sicherzuhalten. Dann platzieren Sie das Dispergierwerkzeug direkt in die Lipid-Dispersion, wobei sichergestellt werden muss, dass die Spitze den Boden des Röhrchens nicht berührt. Homogenisieren Sie die Lipid-Dispersion eine Minute lang.Stellen Sie auf der Leistungsstufe vier die Teile des Mini-Extruders zusammen, der aus einem äußeren Gehäuse und einer Sicherungsmutter besteht, in der zwei Teflon-Innenmembranhalterungen, zwei O-Ringe und ein Teflon-Lager untergebracht sind. Setzen Sie die beiden O-Ringe in die Nuten der Innenmembranhalterungen ein. Befeuchten Sie nun zwei Filter und eine 400 Nanometer Cutoff-Membran vor und legen Sie die befeuchteten Filter an die Teflon-Seite innerhalb der O-Ringe. Die 400 Nanometer Cutoff-Membran befindet sich zwischen den beiden Filtern.Platzieren Sie die Membranträger in das äußere Gehäuse des Extruders, wobei die Membran von zwei Filtern zwischen den O-Ringen umgeben ist. Setzen Sie das Teflonlager in das Gehäuse ein und befestigen Sie es mit einer Sicherungsmutter per Hand. Spülen Sie anschließend zwei Spritzen aus und füllen Sie eine mit 18,2-Megohm-Wasser.Stecken Sie die Spritzennadeln in die kleinen Löcher im Teflon an beiden Enden der Extrudereinheit. Die Nadeln sollten sich leicht einführen lassen. Zwingen Sie die Nadeln nicht hinein.Befestigen Sie die Baugruppe anschließend im Extrudergehäuse. Lassen Sie nun das Wasser durch den Extruder fließen, indem Sie das Wasser langsam aus einer Spritze in die andere drücken. Dies stellt einen Durchlauf dar.Führen Sie drei Durchgänge durch, um auf Lecks zu prüfen, und nehmen Sie anschließend die Spritzen ab. Befüllen Sie eine neue Spritze mit der Vesikellösung. Befestigen Sie sie am Extruder und lassen Sie die Lösung langsam durch die Membran passieren.Wiederholen Sie dies insgesamt 11 Mal. Mit fortschreitender Probenbehandlung wird die Probe allmählich weniger trüb und lässt sich leichter durch die Membran schieben. Ein plötzlicher Abfall des Widerstands deutet jedoch gewöhnlich auf ein Reißen der Membran hin. Stellen Sie nach Beendigung 40-Mikroliter-Aliquote der extrudierten Vesikellösung her.Jede Aliquotprobe in Trockeneis oder fl&uuml;ssigem Stickstoff blitzgefrieren. Nach dem Gefrieren jede Probe &uuml;ber Nacht im Zentrifugalverdampfer bei 30 Grad Celsius lyophilisieren. Die lyophilisierten leeren Vesikel k&ouml;nnen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Beginnen Sie die Einschlie&szlig;ung, indem Sie die Komponenten der Transkriptions- und Translationsreaktion mischen und 20 Einheiten eines RNA-Inhibitors hinzuf&uuml;gen.Die Reaktionsansätze auf Eis inkubieren, anschließend die DNA-Vorlage als Kontrolle hinzufügen; verwenden Sie 250 Nanogramm eines Plasmids, das m venus oder ein ähnliches fluoreszierendes Protein unter Kontrolle eines T7-Transkriptionspromotors und einer starken e coli-Ribosomen-Bindungsstelle kodiert. Das Endvolumen der Reaktionen auf 25 Mikroliter anpassen. Mit RNA-freiem Wasser nun 40 Mikroliter lyophilisierte Vesikel in 10 Mikrolitern der Reaktionsmischung resuspendieren.Vortexen Sie die Mischung kurz, bis die Vesikel resuspendiert sind. Dies sollte weniger als 30 Sekunden dauern. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten auf Eis, um das Anschwellen der Vesikel zu ermöglichen.Als Nächstes verdünnen Sie die Vesikelmischung 20-fach auf ein Endvolumen von 30 Mikrolitern, indem Sie 1,5 Mikroliter Vesikel mit 27,0 Mikrolitern Tris-Chlorid-Lösung und 1,5 Mikrolitern Proteinase-K-Stocklösung kombinieren. Inkubieren Sie nun die verdünnte Vesikelmischung für mindestens zweieinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius.Bereiten Sie eine Probenkammer vor, indem Sie einen 20 mal fünf Millimeter großen Silikonabstandshalter auf ein Standardmikroskop legen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Vesikel in die Probenkammer und legen Sie einen silanisierten Glasdeckel über die Kammer. Anschließend beobachten Sie die Vesikel mit einem 63x-Öl-Immersionsobjektiv oder einem ähnlichen Objektiv mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie.Mit dem geeigneten Filter-Set für die verwendete fluoreszierende Protein-Fluoreszenzmikroskopie zeigt sich, dass die Fluoreszenz nur innerhalb der Vesikel beobachtet wird. Extravesikuläres Material wird enzymatisch abgebaut, um die Expression von en venösem intravesikulärem Material zu ermöglichen. Die Fluoreszenz wird erstmals nach 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius sichtbar.M Venus erreicht innerhalb von sechs Stunden eine maximale Fluoreszenz. Hier ist sie nach 2,5 Stunden zu sehen. Diese Proteinproduktion hängt von der Proteinsynthese und -faltung sowie von der Chromophorbildung ab.Eine analoge In-vitro-Transkriptions- und -Translationsreaktion eines Konstrukts zur Beschichtung mit mVenus ohne Vesikel dient als Kontrolle. Solche Reaktionen weisen aufgrund der Einschlusswirkungsgrad und eines Verdilutionseffekts höhere Fluoreszenzintensitäten auf. Daher werden sie mittels Spektroskopie und nicht mittels Mikroskopie überwacht.Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Fragen bezüglich der Regulierung und der Auswirkungen metabolischer Belastung auf die Aktivität künstlicher Zellen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie zelluläre Nachbildungen konstruiert werden, indem Transkriptions- und Translationsmaschinerie direkt in synthetische Vesikel eingeschlossen wird.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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