Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das dreidimensionale Kultursystem als Mittel zur Unterscheidung des gutartigen Brustphänotyps vom malignen Brustphänotyp zu nutzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Kontroll- und Versuchszellen in dreifacher Ausfertigung auf einer Schicht aus Wachstumsfaktor-reduziertem Matrigel in einem Objektträger mit acht Vertiefungen plattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, jeden vierten Tag frische, vollständige Medienveränderungen mit 2%% GFR Matrigel zu verabreichen, so dass die asinähnlichen Völker 10 bis 15 Tage lang wachsen können.

Als nächstes werden die Phasenkontrastbilder der aser-ähnlichen Kolonien, die in 3D gezüchtet wurden, mit einer fünffachen Auflösung aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Aser-ähnlichen Kulturen für die immunzytochemische Analyse mit relevanten molekularen Markern zu verarbeiten, gefolgt von der Aufnahme konfokaler Bilder von in C zwei Immunfärbe-Aser-ähnlichen Kolonien im Mittelteil. Letztendlich werden der Phasenkontrast und die konfokalen Bilder der in 3D-Kultur gezüchteten Zellen verwendet, um zelluläre phänotypische und molekulare Veränderungen zu identifizieren und so die gutartigen Brustzellen von den bösartigen Zellen zu unterscheiden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie zweidimensionalen Kulturen, Invasions- oder Migrationsassays besteht darin, dass sie die Gewebearchitektur der gutartigen Brust und ihren Organisationsverlust während der malignen Transformation rekapitulieren kann. Somit kann diese Technik effektiv eingesetzt werden, um die gutartigen Brustzellen von den bösartigen Brustzellen zu unterscheiden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich Brustkrebs zu beantworten, wie z. B. den Defekt von Signalwegen am Zellphänotyp und die Identifizierung neuer onkogener und/oder tumorsuppressorischer Signalwege.

Zu Beginn des Experiments über Nacht den Wachstumsfaktor reduziert auftauen oder GFR Matrigel bei vier Grad Celsius. Erwärmen Sie anschließend das gesamte HME-Medium bei 37 Grad Celsius und platzieren Sie zum Abkühlen einen Objektträger mit acht Vertiefungen auf Eis. Geben Sie 40 Mikroliter GFR Matrigel in die Mitte jeder Vertiefung des vorgekühlten Objektträgers.

Verteilen Sie das Gel mit einer Pipettenspitze P 200 so gleichmäßig wie möglich, um Blasen und Überspreizungen zu vermeiden, die zu Meniskusbildung führen können. Dann verfestigen Sie das Matri-Gel, indem Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, während das Matri-Gel die Trypsin-Augen, die HME-Zellen, verfestigt, sammeln Sie sie dann in einem 15-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie die Zellen vier Minuten lang bei der 150-fachen Schwerkraft, zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie auf 12.500 Zellen pro Milliliter. Geben Sie in vollständigen Medien GFR-Matrigel in einer Endkonzentration von 2 % zur Zellsuspension und geben Sie 400 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung des vorcodierten Kammerobjektträgers.

Legen Sie den Objektträger dann in einen CO2-gepufferten Inkubator. Ersetzen Sie die Medien 15 Tage lang alle vier Tage durch neue vollständige Medien. Für Inhibitorstudien fügen Sie zum Zeitpunkt der Beschichtung niedermolekulare Inhibitoren zum vollständigen Medium hinzu, gefolgt von frischen Medienwechseln, die alle drei Tage mit den Inhibitoren ergänzt werden, um das Wachstum der Zellen und Triplikate für jedes Behandlungsset zu beginnen.

Nehmen Sie Phasenkontrastbilder von Aser-Strukturen aus jedem Well mit einer fünffachen Auflösung auf, indem Sie ein Phasenkontrastmikroskop verwenden, das an einen Schiebeschieber und einen Computer angeschlossen ist. Nehmen Sie die Bilder auf, indem Sie den Dia von einem Rahmen zum anderen bewegen, wobei der gesamte Schacht des Kammerdias breit bedeckt ist. Zählen Sie die Gesamtzahl der Aser-Strukturen, die Anzahl der einfachen runden flachen Strukturen und die Anzahl der Multi-Aser-Strukturen oder willkürlich wachsenden Strukturen, denen es an Organisation mangelt.

Und mit den emittierenden Verzweigungsprozessen berechnen Sie den Prozentsatz von einfachrunden, flachen Aser-Strukturen im Vergleich zu bösartigen Strukturen, und stellen Sie die Informationen grafisch dar. Als Säulendiagramm. Berechnen Sie die Signifikanz mit dem zweiseitigen ungekoppelten Schüler-T-Test.

Bereiten Sie die Reagenzien für die Immunfluoreszenzfärbung vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Anschließend wird das konditionierte Medium mit einer Pipette P 200 vorsichtig abgesaugt. Fixieren Sie dann die ASIN oder Strukturen mit frisch zubereitetem 2%para-Formaldehyd für 20 Minuten nach der Fixierung, permieren Sie die Zellen mit 0,5%tritton X 100 für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Kulturen dann dreimal mit 100 Millimeter Glycin für jeweils 10 bis 15 Minuten. Blockieren Sie anschließend die Zellen für eine Stunde bei Raumtemperatur im primären Blockpuffer. Dann inkubieren Sie die Kulturen in 20 Mikrogramm pro Milliliter Ziegen-Anti-Maus-Fab-Zwei-Fragment in primärem Blockpuffer, auch zweite Blockierungslösung genannt, für 30 Minuten, um die Aminoreaktions-Maus-IgG-Spezies im Matrigel zu blockieren.

Nach der Blockierung werden die Zellen mit dem Primärantikörper in einer zweiten Blockierungslösung über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Waschen Sie die Zellen dreimal mit Immunfluoreszenzpuffer oder I Puffer mit leichtem Schaukeln für 10 bis 15 Minuten für jede Wäsche. Dann inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszierenden konjugierten Sekundärantikörpern in if-F-Puffer für 45 Minuten.

Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal für jeweils 10 Minuten mit F-Puffer und leichtem Schaukeln. Montieren Sie die Objektträger mit DPI, das ein Anti-Fade-Reagenz enthält, um die Kerne sichtbar zu machen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Dann werden konfokale Bilder im Koloniemittelteil von Zellen aufgenommen, die auf dem Matrigel wachsen, und eine Reihe von optischen Schnitten über die gesamte Länge der Asner-Struktur durch Z-Stapeln von konfokalen Bildern von DPI-gefärbten HME-kontrollierten und C CN sechs Knockdown-Zellen am fünften Tag zeigen, dass es den Knockdown-Zellen an Organisation mangelt. Am Tag 15 werden die Kontrollzellen wachstumshemmend mit differenzierten ASIN- oder Strukturen und gut definierten Lumen, die von den Knockdown-Zellen abweichen, die einen invasiven verzweigten und tubulären Phänotyp aufweisen. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt den Verlust der Expression von Laminin v alpha sechs Integrin und ECA Herrin, was auf die Störung der Basalmembran, den Verlust der basalen Polarität bzw. den Zellkontakt hinweist.

In malignen Zellen weisen Kontrollzellen eine intakte Schicht um die basale Expression von alpha sechs Integrin apikaler Expression von GM one 30 und eca auf. Hier an der Zellübergangsstelle wurde der maligne Phänotyp von CCN-Sechs-Knockdown-HME-Zellen durch exogene Behandlung von gereinigten rekombinanten humanen CCN-Sechs-Protein-zwei hochmetastasierten Brustzelllinien, etwa 1 49 und M-D-A-M-B 2 31, umgekehrt. Sie wurden mit P-38-Map-Kinase-Inhibitoren, SB 2 0 3 8 50 und SB 2 0 2 1 90 behandelt, die das maligne Verhalten reduzierten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Brustzellen in 3D-Kultur züchtet und wie man das sino-ähnliche Wachstum auf Matrigel effektiv als Messwert verwendet, um die gutartigen von den bösartigen Brustzellphänotypen zu unterscheiden.