Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neuronale Vorläuferzellen der Schalenoberfläche genetisch zu markieren und zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit Plasma-DNA-Lösung gefüllte Glaspipette in den Bereich der Schalenoberfläche eingeführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA in den Hirnhautraum zu injizieren, der über der Schalenoberfläche liegt.

Als nächstes werden die Elektroden so ausgerichtet, dass sie entsprechend Strom an die Schäloberfläche abgeben. Der letzte Schritt besteht darin, dass die DNA durch Anlegen von Strom in die Vorläuferzellen der Schalenoberfläche elektroporiert wird. Letztendlich kann diese Methode mit anderen Techniken kombiniert werden, um den natürlichen Verlauf und die molekularen Determinanten der Schalenoberfläche, der Proliferation neuronaler Vorläufer, der Migration und/oder der Differenzierung zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Virustransduktion besteht darin, dass die Elektroporation sicherer und flexibler ist und keine Viruspartikel oder Verpackungen erfordert. Diese Methode kann Schlüsselfragen auf dem Gebiet der neuralen Stamm- und Vorläuferzellen beantworten, wie z.B. welchen Beitrag diese Vorläuferzellen der Schalenoberfläche zum Gewebe, zur Histogenese und zur Funktion neuronaler Schaltkreise leisten. Verwenden Sie zunächst einen Pipettenabzieher, um Pipetten aus Glaskapillarröhrchen zu formen. Schneiden Sie die Spitze nach dem Ziehen mit einer scharfen Schere ab.

Bereiten Sie als Nächstes eine 1%ige schnelle grüne Stammlösung mit gefiltertem nukleasefreiem Wasser vor. Nach dem Verdünnen des endotoxinfreien Plasma-DNA-Puffers wird er in den entsprechenden Anteilen mit der 1%schnellen grünen Lösung kombiniert. Geben Sie mit einer Standardpipette die gewünschte Menge der zu injizierenden Plasmidmischung als Referenz auf ein Stück Paraffinwachsfilm.

Führen Sie anschließend mit einem Mikroinjektor die zusammengebaute Glaspipette vorsichtig in das Röhrchen mit der Plasmidmischung ein. Vermeiden Sie es, die Spitze mit den Rändern des Rohrs zu berühren, um ein Brechen zu verhindern. Saugen Sie die Lösung in die Pipette an, indem Sie den Übertragungsregler langsam zurückdrehen.

Sobald ein ausreichendes Volumen geladen wurde, wählen Sie vorwärts, bis der Druck in die neutrale Position von Null zurückkehrt. Hector Pascals. Platzieren Sie dann die Spitze neben der Referenzinjektion und verwenden Sie das Fußpedal des Mikroinjektors, um ein Volumen auszustoßen.

Passen Sie den Druck an, bis die Menge dem zuvor pipettierten Referenzvolumen entspricht. Nach der Kalibrierung des Injektionsvolumens werden die Tiere für die Plasmidinjektion entnommen. Sobald die Narkosetiefe bestätigt ist, halten Sie den Welpen mit Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand.

Mit der dominanten Hand zielen Sie auf die gewünschte Region, die kortikalen Hemisphären und andere oberflächliche Strukturen wie die Colliculi superior sollten gut sichtbar sein. Sobald die richtige Stelle identifiziert wurde, führen Sie die Pipette an der Haut und dem Schädel vorbei. Achten Sie darauf, Hirnarterien zu vermeiden.

Um die Schalenoberfläche zu erreichen, stellen Sie sofort das Vorschieben der Pipette ein. Sobald der Schädel mit der Pipettenspitze in der richtigen Position durchdrungen wurde, injizieren Sie die Plasmidlösung mit dem Fußpedal des Mikroinjektors. Entfernen Sie nach der Injektion vorsichtig die Pipette. Verhindern Sie, dass die Spitze zwischen den Injektionen austrocknet und verstopft, indem Sie sie in die Testtröpfchen auf dem Paraffinfilm geben. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Welpen injiziert sind, um den Leitwert zu erhöhen und ein Verbrennen der Haut zu verhindern.

Decken Sie drei Millimeter große Platin-Pinzetten-TROs mit Elektroporationsgel ab. Passen Sie als Nächstes die Elektroeinstellungen für Injektionen in den Kortex an. Platzieren Sie die negativ geladene Sonde über dem injizierten Bereich und die positiv geladene Sonde um den kontralateralen Bereich unterhalb des Auges.

Die Ausrichtung der Elektrode sollte in einem Winkel von 45 bis 60 Grad relativ zur Mittellinie liegen. Verwenden Sie das Fußpedal, um den Strom auszulösen, und halten Sie die Pinzette TROs für drei bis fünf Impulse an Ort und Stelle. Abhängig vom Alter und Gewicht des Welpen sollten die Impulse die DNA in die darunter liegenden Zellen der Schalenoberfläche leiten.

Der Minuspol kann über den Einspritzbereich gezogen werden. Zwischen den Impulsen kann eine größere Elektrode verwendet werden, um die Elektrofläche unmittelbar nach der Elektroporation zu vergrößern, reinigen Sie das Gel vorsichtig von Welpen und legen Sie sie etwa fünf Minuten lang unter eine Wärmelampe. Welpen verlieren in den Minuten nach der Elektroporation aufgrund von Zyanose akut ihren natürlichen rötlichen kleinen Ton.

Beobachten Sie die Welpen auf die Wiederherstellung der natürlichen Farbe und die Einleitung normaler Bewegungen, bevor Sie sie in ihre Käfige zurückbringen oder in den oberen Colus injizieren. Lokalisieren Sie die Zielregion direkt hinter und lateral von Lambda und ungefähr an der Mittellinie, und befolgen Sie die gleichen Schritte, die gerade gezeigt wurden. Bei erfolgreicher Injektion füllt die Plasmidmischung auf natürliche Weise die Konturen des Colus superior auf.

Bei der Elektrooperation nach Injektionen in die obere Kolus wird die negativ geladene Sonde der Elektrode über den injizierten Bereich und die positiv geladene Sonde um das Auge, die Schnauze oder das Kinn gelegt. In diesem Fall befindet sich die Elektrodenausrichtung in einem Winkel von 25 bis 40 Grad relativ zur Mittellinie. Dieses Bild zeigt den dorsalen lateralen Kortex nach der Elektroporation von fluoreszierenden Reporterplasmiden, die membranmarkierten Klee in grün exprimieren und bfp markieren.

Zwei Kernproteine, hier in roter Pseudofarbe dargestellt. Ausgedehnte Dendriten finden sich in diesem kortikalen Interneuron etwa zwei Monate nach der Elektroporation. EGFP-positive Zellen sind BRDU-positiv, was darauf hinweist, dass sie sich während des Elektroporationsverfahrens vermehrt haben.

Wenn Sie diese Technik ausprobieren, ist es wichtig, sich auf die richtige Ausrichtung der Schalenoberfläche zu konzentrieren, um eine Störung des darunter liegenden Kortex und/oder des Gefäßsystems zu vermeiden.