Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, einen Ansatz zur Bildregistrierung für die dreidimensionale Histologie und die Volumenrekonstruktion zur Untersuchung von Veränderungen in der makroskopischen zellulären Struktur der Brustdrüse vorzustellen. Dazu werden Brustdrüsen von Mäusen drei Tage nach Beginn der Laktation aus Wildtyp- und insulinähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein sieben, IGF BP sieben, defizienten Mäusen entfernt. Die Drüsen werden anschließend verarbeitet und in Paraffinblöcken eingebettet, um sie schneiden zu können.

Als Nächstes werden weitere optische Blockflächenbilder der Gewebeproben aufgenommen und das Gewebeprobe wird präpariert. Bilder der Schnitte werden erfasst und mithilfe einer benutzerspezifischen Software jeder Schnitt mit dem entsprechenden Blockflächenbild ausgerichtet, um das histologische Volumen der Brustdrüse zu rekonstruieren. Die resultierenden Daten verdeutlichen Unterschiede in der Größe zwischen mutierten und Wildtyp-Drüsen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der dreidimensionalen konfokalen Zweifachmikroskopie liegt darin, dass sie Informationen über eine deutlich größere räumliche Ausdehnung bereitstellt. Diese Methode kann auch zur Untersuchung und Validierung neuartiger Techniken und Algorithmen in der volumetrischen medizinischen Bildgebung und Therapien verwendet werden, sowie zur Erstellung einer 3D-Analyse mit hoher Auflösung verschiedener Organe. Dieses rekonstruierte histologische Volumen bietet eine zuverlässige Darstellung des Probenmaterials ohne akkumulierte Registrierungsfehler.

Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir bemerkten, dass IGF P seven null Mäuse kleinere Würfe haben und nicht in der Lage sind, mehrere große Würfe aufrechtzuerhalten, weshalb wir beschlossen, die Struktur ihrer Brustdrüsen zu untersuchen. Sobald das Gewebe in Paraffin eingebettet ist, verwenden Sie einen Rotationsmikrotom, um den Block so lange zu beschneiden, bis das überschüssige Paraffin entfernt ist. Anschließend bohren Sie mit einer vertikalen Fräsmaschine je einen Millimeter großen Bohrung in mindestens zwei Ecken des Paraffinblocks senkrecht zur Kassette und montieren den Gewebeprobeblock auf dem Rotationsmikrotom.

Stellen Sie als Nächstes das Blockflächen-Bildgebungssystem vor dem Mikrotom auf, indem Sie eine Kamera mit Teleobjektiv in leichtem Winkel zur Oberfläche des Gewebeprobenblocks positionieren. Die Kamera sollte mit einem Computer vor dem Mikrotom verbunden sein. Platzieren Sie anschließend eine Lichtquelle vor dem Block, sodass die Kamera die Reflexion des Lichts von der Blockoberfläche erfasst.

Stellen Sie den Winkel der Kamera so ein, dass das Gewebe an der Oberfläche des Blocks leicht vom umgebenden Paraffin unterschieden werden kann. Erfassen Sie ein optisches Bild der Blockoberfläche. Schneiden Sie anschließend mit dem Mikrotom Streifen aus vier Schnitten mit einer Dicke von fünf Mikrometern.

Überführen Sie die Bänder in ein kaltes Wasserbad, trennen Sie die Abschnitte des Bandes und heben Sie dann den zweiten und vierten Abschnitt mit einem Löffel aus dem kalten Wasser auf einen Objektträger. Überführen Sie sie anschließend in ein warmes Wasserbad, um sie zu entfalten. Die Auswahl des zweiten und vierten Abschnitts gewährleistet einen Abstand von fünf Mikrometern zwischen den Abschnitten.

Sobald sie entfaltet sind, remontieren Sie die Schnitte auf die Objektträger, indem Sie sie vorsichtig abschöpfen. Wie zuvor zu beachten ist, können das Schneiden, Montieren und Entfalten der Schnitte zu einigen Verzerrungen führen, wie beispielsweise Rissen, Falten, Schrumpfungen und Ausdehnungen. Diese Artefakte erschweren die Registrierung der Histologieschnitte.

Färben Sie die Schnitte mit H und D mithilfe eines automatischen Färbeapparats. Danach decken Sie die Objektträger mit einem automatischen Deckglasgerät ab und digitalisieren die Objektträger mit einem digitalen histologischen Objektträgerscanner in der gewünschten Auflösung. Für dieses Protokoll beträgt die Vergrößerung 20 x und die Auflösung 0,47 Mikrometer.

Dieser Abschnitt des Videos gibt einen Überblick über den Prozess der Bildregistrierung, der mithilfe einer in unserem Labor entwickelten benutzerdefinierten Software in Kombination mit MATLAB c plus plus durchgeführt wird. Beginnen Sie mit ITK, indem Sie die Histologiebilder auf die Auflösung der Blockflächenbilder heruntertakten. Dadurch werden die Histologiebilder um einen Faktor von 0,026 verkleinert.

Danach zur Bildsegmentierung und Punktauswahl einige Blockflächenbilder in MATLAB öffnen und mit dem Datencursor-Tool die Pixelwerte der Registrierungslöcher messen. Den durchschnittlichen Pixelwert als festen Schwellenwert verwenden, um die Registrierungslöcher zu segmentieren. Um zusätzliche Segmente zu entfernen, die Kreisförmigkeit und die Fläche der segmentierten Objekte nutzen, um die Löcher beizubehalten und die zusätzlichen Segmente zu entfernen.

Als Nächstes für jede Brustdrüse ein Blockquerschnittsbild als Referenz auswählen. Die Mittelpunkte der Registrierungslöcher der übrigen Blockquerschnittsbilder mit den Mittelpunkten der Registrierungslöcher des Referenzbilds ausrichten. Anschließend unter Verwendung der für die Registrierungslöcher erhaltenen Transformationen die Blockquerschnittsbilder ausrichten und für die ausgerichteten Blockquerschnittsbilder das Gewebe manuell segmentieren oder aus dem Hintergrund für die h- und d-Abschnitte extrahieren.

Verwenden Sie die OSU-Schwellenwertmethode, um die Bilder vom Hintergrund zu segmentieren und binäre Masken der Histologiebilder zu erstellen. Identifizieren und wählen Sie anschließend anhand des Histogramms der markierten Objekte das größte Objekt in jeder Maske aus. Extrahieren Sie die Randpunkte mit einer Breite von einem Pixel aus den Masken der Histologie- und der Blockoberflächenbilder.

Verwenden Sie anschließend einen Algorithmus auf der Grundlage von Fourier-Deskriptoren, um die anfängliche starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Histologie und den entsprechenden Blockoberflächenbildern zu bestimmen. Diese anfängliche Transformation umfasst Translations-, Rotations- und Skalierungsfaktoren. Transformieren Sie jedes Histologiebild mit der aus dem vorherigen Schritt erhaltenen Anfangstransformation.

Um die starre Registrierung zu verfeinern, entfernen Sie mithilfe eines Rolling-Ball-Filters die Randabschnitte mit hoher Krümmung aus der histologischen Kontur. Wählen Sie anschließend aus den verbleibenden histologischen Begrenzungspunkten mittels gleichmäßiger Verteilung zufällig 500 Punkte aus. Transformieren Sie die histologischen Begrenzungspunkte mit der anfänglichen Transformation, die aus den Fourier-Deskriptoren erhalten wurde.

Verwenden Sie die Grenzpunkte der Blockoberfläche und den Algorithmus der iterativen nächstgelegenen Punkte, um die starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Blockoberfläche und der Histologie zu bestimmen. Zufällige Grenzpunkte. Transformieren Sie anschließend die Histologiebilder aus dem vorherigen Schritt, um ein visuelles Bild des Histologievolumens in der 3D-Visualisierungssoftware zu erstellen.

Wählen Sie im Labor die Module aus, bearbeiten Sie Sonstiges und fügen Sie das Modul „3D aus 2D-Dateien zusammensetzen“ hinzu. Wählen Sie anschließend Bild aus dem Menü und fügen Sie das Modul „Bildeigenschaften konvertieren“ hinzu. Fügen Sie schließlich ein „3D-Anzeige“-Modul aus den 3D-Ansichtsmodulen unter Visualisierung hinzu.

Doppelklicken Sie auf „3D aus 2D-Dateien zusammensetzen“, um die Bilder zu laden, und klicken Sie auf „3D erstellen“. Passen Sie die Voxelgröße an, indem Sie doppelt auf „Bildeigenschaft konvertieren“ klicken, und stellen Sie die Voxelgröße auf 0,018 0,018 0,01 ein. Zeigen Sie das Volumen an, indem Sie doppelt auf „3D-Ansicht“ klicken.

Schließlich betrachten Sie den Bildstapel mit fünfmaliger Vergrößerung, indem Sie die Schritte im beigefügten Dokument befolgen. Um den Defekt des I-G-F-B-P-sieben-Null-Mausmodells besser charakterisieren zu können, wurde eine dreidimensionale Rekonstruktion der Milchdrüsen wie hier beschrieben durchgeführt. Diese Abbildungen zeigen die rekonstruierten histologischen Volumina der Milchdrüsen von Wildtyp und Null-Mausmodell.

Beachten Sie, dass die mutierte Drüse rechts kürzer und schmaler ist als die Wildtyp-Drüse links, jedoch eine ähnliche Tiefe aufweist: Die Wildtyp-Drüse misst 1,06 Millimeter und die Null-Drüse 1,02 Millimeter Tiefe. Achten Sie außerdem darauf, dass die Wildtyp-Drüsen links nur wenig Stromagewebe aufweisen, das durch die rosa Eosin-Färbung erkennbar ist, während die Null-Drüsen rechts überwiegend aus Stromagewebe zu bestehen scheinen. Die hier verwendete Hämatoxylin-Färbung, die kernhaltige Zellen nachweist, zeigt, dass die Null-Drüse ihre Dichte beibehält, während die Wildtyp-Drüse hauptsächlich drüsenförmige Strukturen enthält.

Um dies weiter zu untersuchen, wurden hier höher aufgelöste Bilder des Lymphknotenbereichs zusammengestellt. Es sind große Strukturen sichtbar, die mit Milch gefüllt gewesen wären. Im Gegensatz dazu weist die I-G-F-B-P-sieben-Null-Drüse nur wenige gut entwickelte Strukturen auf.

Außerdem sind diese Strukturen dicht mit fibroblastenähnlichen Zellen besiedelt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine 3D-Rekonstruktion eines Organs durch die Neuerstellung von seriellen Schnittbildern erzeugt. Gut. Nun ist es bei der Durchführung dieses Verfahrens wichtig, daran zu denken, die Objektträger und Scans konsequent zu benennen, da sowohl von den Objektträgern als auch von den Scans eine große Anzahl vorhanden sein wird und eine sequenzielle Organisation der Schlüssel zum Erfolg bei diesem Verfahren ist.

Andere Methoden wie die Immunhistochemie für spezifische Zell- und Krankheitsmarker können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie durchdringt das Gefäßsystem einen Tumor?