Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, einen Bildregistrierungsansatz für die dreidimensionale Histologie und die Volumenrekonstruktion vorzustellen, um Veränderungen in der zellulären Makrostruktur der Brust zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden drei Tage nach Beginn der Laktation Brustdrüsen aus Mäusen herausgeschnitten, wobei das Wildtyp- und insulinähnliche Wachstumsfaktor-bindende Protein sieben, IGF BP sieben Null-Mäuse verwendet wurden. Anschließend werden die Drüsen bearbeitet und zum Durchtrennen in Paraffinblöcke eingebettet.

Als nächstes werden optische Blockflächenbilder der Gewebeblöcke aufgenommen und der Gewebeblock wird geschnitten. Die Bilder der Schnitte werden aufgenommen und mit Hilfe einer speziellen Software mit dem entsprechenden Blockflächenbild abgeglichen, um das histologische Volumen der Brustdrüse zu rekonstruieren. Die daraus resultierenden Daten verdeutlichen Größenunterschiede zwischen mutierten und Wildtyp-Drüsen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der dreidimensionalen konfokalen Zweifachmikroskopie besteht darin, dass sie Informationen über eine viel größere räumliche Ausdehnung liefert. Diese Methode kann auch zur Untersuchung und Validierung neuartiger Techniken und Algorithmen in der volumetrischen medizinischen Bildgebung und Therapie sowie zur Erstellung einer hochauflösenden 3D-Analyse verschiedener Organe verwendet werden. Dieses rekonstruierte Histologie-Volumen zeigt eine zuverlässige Darstellung der Prozessprobe ohne sich ausbreitenden Registrierungsfehler.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass IGF P sieben Null-Mäuse kleinere Wurfgrößen haben und nicht in der Lage sind, mehrere große Würfe zu ertragen, also beschlossen wir, die Struktur ihrer Brustdrüsen zu untersuchen. Sobald das Gewebe in Paraffin eingebettet ist, verwenden Sie ein Rotationsmikrotom, um den Block zu trimmen, bis das überschüssige Paraffin entfernt ist. Bohren Sie anschließend mit einer vertikalen Fräsmaschine ein Millimeter Löcher in mindestens zwei Ecken des Paraffinblocks senkrecht zur Kassette und montieren Sie den Gewebeblock auf dem rotierenden Mikrotom.

Um das Blockgesichtsbildgebungssystem vor dem Mikrotom aufzustellen, platzieren Sie eine Kamera mit einem Teleobjektiv in einem leichten Winkel zur Oberfläche des Gewebeblocks. Die Kamera sollte an einen Computer vor dem Mikrotom angeschlossen werden. Platzieren Sie dann eine Lichtquelle vor dem Block so, dass die Kamera die Reflexion des Lichts vom Block einfängt.

Passen Sie den Winkel der Kamera an, bis das Gewebe an der Oberfläche des Blocks leicht vom umgebenden Paraffin zu unterscheiden ist. Nehmen Sie ein optisches Blockflächenbild auf. Schneiden Sie dann mit dem Mikrotom Bänder aus vier Abschnitten, die fünf Mikrometer dick sind.

Übertragen Sie die Bänder in ein kaltes Wasserbad, trennen Sie die Abschnitte des Bandes und schöpfen Sie dann den zweiten und vierten Abschnitt aus dem kalten Wasser auf eine Folie. Übertragen Sie sie in ein warmes Wasserbad, um sie zu lösen. Die Wahl des zweiten und vierten Abschnitts bietet einen Abstand von fünf Mikrometern zwischen den Abschnitten.

Sobald sie sich gelöst haben, werden die Schnitte auf dem Mikroskop durch Schaufeln wieder montiert. Beachten Sie wie zuvor, dass das Schneiden, Montieren und Entknittern der Abschnitte zu Verzerrungen wie Rissen, Falten, Schrumpfen und Ausdehnung führen kann. Diese Artefakte erschweren die Registrierung der histologischen Abschnitte.

Färben Sie die Abschnitte mit h und d mit einem automatischen Färbeautomaten. Dann decken Sie die Objektträger mit einem automatischen Deckblatt und einem digitalen Histologie-Objektträgerscanner ab und digitalisieren Sie die Objektträger mit der gewünschten Auflösung. Für dieses Protokoll beträgt die Vergrößerung das 20-fache und die Auflösung 0,47 Mikrometer.

Dieser Abschnitt des Videos gibt einen Überblick über den Prozess der Bildregistrierung, der mit einer in unserem Labor entwickelten Software in Kombination mit MATLAB c plus plus durchgeführt wird. Verwenden von ITK Beginnen Sie mit dem Downsampling der Histologiebilder auf die Auflösung der Blockflächenbilder. Dadurch verkleinern sich die Histologiebilder um den Faktor 0,026.

Öffnen Sie als Nächstes für die Bildsegmentierung und Punktauswahl einige Blockflächenbilder in MATLAB und verwenden Sie das Datencursor-Tool, um die Pixelwerte der Registrierungslöcher zu messen. Verwenden Sie den durchschnittlichen Pixelwert als festen Schwellenwert, um die Registrierungslöcher zu segmentieren. Um die zusätzlichen Segmente zu entfernen, verwenden Sie die Rundheit und den Bereich der segmentierten Objekte, um die Löcher beizubehalten und die zusätzlichen Segmente zu entfernen.

Wählen Sie als Nächstes für jede Brustdrüse ein Blockgesichtsbild als Referenz aus. Richten Sie die Mittelpunkte der Registrierungslöcher des restlichen Blocks aus, und richten Sie die Bilder an den Mittelpunkten der Registrierungslöcher des Referenzbilds aus. Richten Sie dann mithilfe der für die Registrierungslöcher erhaltenen Transformationen die Blockflächenbilder für die ausgerichteten Blockflächenbilder manuell aus, segmentieren oder extrahieren Sie das Gewebe aus dem Hintergrund für h- und d-Schnitte.

Verwenden Sie die OSU-Schwellenwerttechnik, um Bilder aus dem Hintergrund zu segmentieren und binäre Masken der Histologiebilder zu erstellen. Identifizieren Sie anschließend anhand des Histogramms der beschrifteten Objekte das Objekt mit der größten Größe in jeder Maske und wählen Sie es aus. Extrahieren Sie die ein Pixel breiten Grenzpunkte sowohl aus der Histologie- als auch aus der Blockgesichtsmaske.

Verwenden Sie als Nächstes einen Fourier-Deskriptor-Algorithmus, um die anfängliche starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Histologie und den entsprechenden Blockflächenbildern zu finden. Diese anfängliche Transformation umfasst die Faktoren Translation, Rotation und Skalierung. Transformieren Sie jedes Histologiebild mit der anfänglichen Transformation, die Sie im vorherigen Schritt erhalten haben.

Um das starre Register zu verfeinern, entfernen Sie die Kantenabschnitte mit hoher Krümmung mit einem Rollkugelfilter aus der Histologiekontur. Wählen Sie anschließend mit der Gleichverteilung nach dem Zufallsprinzip 500 Punkte aus den verbleibenden histologischen Grenzpunkten aus. Transformieren Sie die histologischen Grenzpunkte mit der anfänglichen Transformation, die aus Fourier-Deskriptoren erhalten wurde.

Verwenden Sie die Blockflächenbegrenzungspunkte und den iterativen Algorithmus für nächstgelegene Punkte, um die starre Transformation zwischen dem Block, den Flächenbegrenzungspunkten und der Histologie zu finden. Zufällige Begrenzungspunkte. Transformieren Sie dann die Histologiebilder, die Sie im vorherigen Schritt erhalten haben, um ein visuelles Bild des Histologievolumens in der 3D-Visualisierungssoftware zu erstellen.

Me vis lab, wählen Sie Module aus, Datei Verschiedenes und fügen Sie das zusammengesetzte 3D-Modul aus 2D-Dateien hinzu. Wählen Sie dann Bild aus dem Menü und fügen Sie das Konvertierungsmodul Bildeigenschaft hinzu. Fügen Sie abschließend ein Ansichts-3D-Modul aus den 3D-Viewern für die Modulvisualisierung hinzu.

Doppelklicken Sie auf 3D aus 2D-Dateien zusammenstellen, um die Bilder zu laden, und klicken Sie auf 3D erstellen. Passen Sie die Voxelgröße an, indem Sie auf Bildeigenschaft konvertieren doppelklicken, und stellen Sie die Voxelgröße auf 0,018 0,018 0,01 ein. Betrachten Sie das Volumen mit einem Doppelklick auf 3D-Ansicht.

Betrachten Sie abschließend den Bildstapel mit fünffacher Vergrößerung, indem Sie die Schritte im Begleitdokument befolgen. Um den Mangel des I-G-F-B-P sieben Null-Maus-3D-Rekonstruktionen der Brustdrüsen besser charakterisieren zu können, wurde die hier beschriebene 3D-Rekonstruktion der Brustdrüsen durchgeführt. Diese Abbildungen zeigen die rekonstruierten histologischen Volumina der Wildtyp- und Null-Mammadrüsen.

Beachten Sie, dass die mutierte Drüse auf der rechten Seite kürzer und schmaler ist als der Wildtyp auf der linken Seite, aber etwa die gleiche Tiefe wie die Wildtyp-Drüse bei 1,06 Millimetern und die Nulldrüse bei 1,02 Millimetern Tiefe hat. Beachten Sie auch, dass die Wildtyp-Drüsen auf der linken Seite wenig Stromagewebe aufweisen, was durch die rosa Eoin-Färbung angezeigt wird, während die Nulldrüsen auf der rechten Seite überwiegend aus Stromagewebe zu bestehen scheinen. Hier zeigt die Hämat-Toin-Färbung, die die kernhaltigen Zellen identifiziert, dass die Nulldrüse ihre Dichte beibehält, während die Wildtyp-Drüse hauptsächlich Drüsenstrukturen zu enthalten scheint.

Um dies weiter zu untersuchen, wurden hier höher aufgelöste Bilder des Bereichs des Lymphknotens ausgerichtet. Zu sehen sind große Strukturen, die mit Milch gefüllt gewesen wären. Im Gegensatz dazu hat die I-G-F-B-P sieben Nullstopfbuchse nur wenige gut entwickelte Strukturen.

Darüber hinaus sind diese Strukturen mit Fibroblasten wie Zellen bevölkert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine 3D-Rekonstruktion eines Organs durch Rekonstruktion von seriellen Scan-Schnitten erstellt. Gut. Nun, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Objektträger und Scans konsistent zu benennen, da es eine große Anzahl von beidem geben wird, und die sequentielle Organisation ist der Schlüssel zum Erfolg Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie die Immunhistochemie für spezifische Zell- und Krankheitsmarker können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie durchdringt das Gefäßsystem einen Tumor?