Name: Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Lernen Sie die Bildregistrierung zur dreidimensionalen Histologie-Rekonstruktion von Mausmilchdrüsen. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Makrostrukturen und vergleicht Wildtyp- mit Igfbp7-null-Mäusen.

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Die Autoren danken dem Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) am Sunnybrook Research Institute für ihre histologischen Dienstleistungen. Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Terry Fox Foundation, der Canadian Breast Cancer Foundation – der Prairie-NWT sowie einem CIHR-Stipendium (#MOP-97996) bereitgestellt.

1. Proben <ol><li> Verbrauchsteuern die Brustdrüsen chirurgisch aus Wildtyp-CDH1 sowie IGFBP7-null-Mäusen 3 Tage nach dem Einsetzen der Laktation. </li><li> Verbreiten Sie die Drüsen auf Glasobjektträger zu helfen, wieder Muttermilchdrüsenmorphologie. </li></ol> 2. Fixierung und Gewebeverarbeitung <ol><li> Befestigen Sie die Milchdrüsen in neutral gepuffertem 4% PFA O / N bei 4 ° C. </li><li> Bewahren Sie die Drüsen in 70% Ethanol vor der Gewebeverarbeitung. </li><li> Übertragen Sie die Drüsen, kleine Gewebeverarbeitung Kassetten. </li><li> Verarbeiten Sie die Gewebe mit Hilfe eines automatisierten Gewebeprozessor <ol><li> Dehydratisierung der Gewebe in zunehmenden Ethanol und Xylol Bäder von 70% Ethanol für 45 min, 2 mal in 95% Ethanol für 45 Minuten, 3 mal in 100% Ethanol für 1 Stunde und 2 mal in Xylol für 45 min. </li><li> Dringen das Gewebe mit Paraffin 3 Mal für jeweils 1 h in einem Vakuum mit Druckvorgabe. </li></ol></li><li> Betten Sie das Gewebe in Paraffin zu Blöcken, Für das Schneiden. </li></ol> 3. Histologie und Blockface Imaging <ol><li> Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms, bis das überschüssige Paraffin wird entfernt. </li><li> Verwenden eine Vertikalfräsmaschine 1 mm Bohrungen in mindestens zwei Ecken der Paraffinblock senkrecht zu der Kassette. </li><li> Montieren Sie den Gewebeblock auf der Rotationsmikrotoms. </li><li> Richten Sie die blockface Abbildungssystem 19 vor dem Mikrotom. </li><li> Optischen Bild blockface Erfassen vor dem Schneiden. </li><li> Schneiden Bänder aus vier Abschnitten bei 5 um Dicke am Mikrotom. <ol><li> Übertragen Sie die Bänder an den kalten Wasserbad. </li><li> Trennen Sie die zweiten und vierten Abschnitt des Bandes und montieren sie auf Objektträgern. Wahl der zweiten und vierten Abschnitt eine Lücke zwischen 5 &amp;mgr; m Abschnitte. </li><li> Erweitern Sie jeden Abschnitt in einem warmen Wasserbad (48 ° C), um sie unwrinkle, dann wieder montieren auf dem Objektträger. HINWEIS: CUtting, Montage, Glättungs die Abschnitte führen, dass einige Verzerrungen auf dem Abschnitt, wie Reiß, falten, Schrumpfung und Expansion. Diese Artefakte erschweren die Registrierung der Histologieschnitten. </li><li> Färben der Schnitte mit H &amp; E mit einem automatischen stainer. </li><li> Deckglas die Folien mit einem automatischen Eindeckautomat. </li><li> Digitalisieren Sie die Folien mit einem digitalen Histologie Dia-Scanner mit einer Auflösung von Interesse. Aus diesem Protokoll ist die Vergrößerung 20x und die Auflösung ist 0,47 um. </li><li> Down probieren Sie die Histologie Bilder an die Auflösung des blockface Bilder, 18 um. </li></ol></li></ol> 4. Bildregistrierung <ol><li> Bildsegmentierung und Punktauswahl <ol><li> In blockface Bilder messen die Pixelwerte der Ausrichtungslöcher und benutzen den Durchschnittswert als eine feste Schwelle zu segmentieren die Ausrichtungslöcher in den Ecken des Paraffinblocks. </li><li> Da einige Zusatzteile kann auch durch segmentiert werdenmit dem festgelegten Schwellenwert, verwenden Sie die Rundheit und den Bereich der segmentierten Objekte, um die Löcher zu finden und entsorgen Sie die zusätzlichen Objekten. Um dies zu tun, schreibe einen kleinen Code und finden Sie das Verhältnis von (4π x Fläche) / (Perimeter) 2 für die segmentierten Objekte. Dieses Verhältnis für runde Objekte 1 ist. </li><li> Für jede Brustdrüse, wählen Sie eine blockface Bild als Referenz, und richten Sie den Rest der blockface Bilder zum Referenz, indem die Mitte der Anmeldung Löcher und Wahrzeichen-basierte Registrierungstechniken. </li><li> Für die ausgerichteten blockface Bilder manuell Segment oder extrahieren Sie die Gewebe aus dem Hintergrund. Nutzen die meisten großen Objekt durch in der Maske für den Rest des Protokolls. </li><li> Für H &amp; E Abschnitte die folgenden Schritte für die automatische Segmentierung. <ol><li> Verwenden Otsu Schwellwerttechnik 20 bis Segment Bilder aus dem Hintergrund und erstellen binäre Masken der Histologie Bilder. </li><li> Identifizieren und wählen Sie die ansehnliche Objekt in jeder Maske mit dem histogram der markierten Objekte. </li><li> Extrahieren Sie die ein Pixel breite Grenzpunkte von beiden Histologie und blockface Masken. </li><li> Verwenden Chain-Code-Algorithmus 21, um die Grenzpunkte durch eine Folge von stückweise linearen darstellen passt. </li></ol></li></ol></li><li> Initial Starre Registrierung <ol><li> Verwenden Fourier Deskriptoren Algorithmus 22, zu finden, die erste starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Histologie und ihre entsprechenden blockface Bilder. Diese erste transformieren umfasst die Translation, Rotation und Skalierungsfaktoren. </li><li> Verwandeln Sie jedes Bild mit der Histologie aus dem vorherigen Schritt die Anfangs Transformation erhalten. </li></ol></li><li> Verfeinerung der Starre Registrierung <ol><li> Entfernen Sie die hohe Krümmung Randabschnitte von der Histologie Kontur mit einem rollenden Ball Filter 23. </li><li> Wählen Sie 500 Punkte aus den verbleibenden Histologie Grenzpunkte zufällig mit gleichmäßigen Verteilung. </li><li> Transformieren Sie die dieHistologie Zufallsgrenzpunkte mit der aus der Fourier-Deskriptoren erhalten anfänglichen Transformation. </li><li> Wählen Sie die ganze Reihe von blockface Grenzpunkte und benutzen Iterative Closest Point (ICP) Algorithmus 24, um die starre Transformation zwischen den blockface Grenzpunkte, Ziel und Histologie Zufallsgrenzpunkte zu finden. </li><li> Transformation der ausgerichteten Histologie Bilder aus dem vorhergehenden Schritt erhalten, und der Stapel ausgerichtet Histologie Bilder erstellt die Histologie Volumen. </li><li> Verwenden Sie ein 3D-Visualisierungs-Software, um eine visuelle Bild der Histologie Volume zu erstellen. </li></ol></li><li> Stack anzeigen der Bilder bei 5-facher Vergrößerung <ol><li> Down probieren Sie die Original Histologie Bilder, um die Vergrößerung 5x. </li><li> Crop die Region von Interesse in einer der Histologie Bilder. </li><li> Berechnen der Position dieser Region in anderen 5x Histologie Bilder unter Verwendung der Kombination der starren Transformationen aus den zwei Schritten der Registrierung. </li><li> Schneiden Sie das regions von Interesse für die gleichen Größenbereich in allen anderen histologischen Bilder. </li><li> Schließlich verfeinern die Ausrichtung zwischen den Regionen manuell. Ein Programm zu schreiben, die zwei Bilder überlagert, und ermöglicht die Auswahl der Werte für Rotation und Translation eines der Bilder gegenüber dem anderen ein und speichert dann das transformierte Bild, wenn die Ausrichtung angenommen wird. </li><li> Sehen Sie sich die Stapel der ausgerichteten 5x Histologie Regionen mit einem 3D-Visualisierungssoftware. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen

In dieser Studie haben wir eine Bildregistrierung Workflow, um ein 3D-Histologie Volumen aus 2D-Serien Histologie Bilder, die nicht internen zufällig ausgewählten Landmarken oder implantiert Bezugsmarker im Gewebe, die das Gewebe verzerren könnten erfordert rekonstruieren entwickelt. Durch das beschriebene Verfahren werden optische Bilder blockface sich als die Referenzbilder vor dem Schneiden verwendet. Wir verwenden externe Löcher in dem Paraffinblock gebohrt, um beim Ausrichten der Bilder blockface unterstützen und f...

IGFBP7 (Insulin-like growth factor binding protein 7) ist ein Mitglied der IGF-bindende Proteinfamilie, und es wurde gezeigt, um die IGF-1-Rezeptor-4 zu binden. Herabregulierung von IGFBP7 ist bekannt, mit einer schlechten Prognose bei Brustkrebs 5 korreliert werden, während die Wiedereinführung von IGFBP7 in Xenograft-Tumormodellen hemmt stark die Tumorwachstums 6 durch Induktion von Apoptose und Zellalterung 7. Um die Auswirkungen der IGFPB7 zu untersuchen, wurde ein IGFBP7 null Maus 5 (unveröffentlichte Daten) erstellt. Während diese Mäuse keine Tumore entwickeln, Veränderungen in der Histologie des Eierstock-, Muskel-und Leber sowie Mängel in der Brustdrüse Entwicklungs Strukturierung (unveröffentlichte Daten) zeigen sie. Das defekte Phänotyp wurde angegeben als die null-Mäuse haben kleinere Wurfgrößen und sind unfähig, mehrere große Würfe (unveröffentlichte Daten) zu erhalten. 3D-Histologie Bände haben das Potenzial, um nützliche Informat bietenIonen für quantitative und vergleichende Analysen und Bewertung der pathologischen Befunde in Volumen medizinische Bilder. Dreidimensionales konfokales können zwei-Photonen-Mikroskopie hoher Auflösung Zelle morphologische Information der Drüse an lokalen Speicherbereich 14 zu schaffen, aber eine begrenzte Sichtfeld und Tiefe hat. Histologie Volumenrekonstruktion liefert mehr Informationen über einen viel größeren räumlichen Ausdehnung. Verwendung traditioneller Ansätze gewisse Verzerrung während der Herstellung histologischer Schnitte, wie z. B. Schrumpfung, Expansion, Risse und Falten erwartet. Diese Verzerrungen machen es schwierig, seriellen histologischen Bilder in ein 3D-Stapel Register, um ein 3D-Volumen zu rekonstruieren. Da die Anzahl von aufeinanderfolgenden Abschnitten mit Defekten erhöht die Ähnlichkeiten zwischen intakten Abschnitte reduziert und folglich ist der Registrierungsprozess komplizierter. Verschiedene Methoden wurden vorgeschlagen, um histologische Schnitte zu registrieren und eine kontinuierliche Histologie vo erstellenlume. Einige Techniken sind abhängig von Intensitätsvariationen 8, und andere werden von der Form der Abschnitte 9 basiert. Bei einigen Proben können die anatomischen Strukturen als Landmarken 10,11 zusammen mit Wahrzeichen-basierte Registrierungsverfahren 12,13 verwendet werden. Aber diese inneren Strukturen möglicherweise nicht nachweisbar sein in der gesamten Menge und für einige Proben keine zuverlässigen anatomischen Strukturen identifiziert werden können. Einige Gruppen haben eine paarweise Anmeldung Ansatz verwendet und registriert in Folge Histologie Bilder einem zum anderen mit Konturen oder anatomischen Strukturen 16-18. Registrieren von Serien Histologie Abschnitte miteinander, ohne die Verwendung von Referenzbildern kann die Registrierung Fehler zu propagieren und ändern Sie die tatsächliche Form der Histologie Lautstärke. Paarweise Anmeldung Ansatz beruht auf der Konsistenz der Form der Histologie Abschnitten und den inneren Strukturen im gesamten Stapel der Bilder; daher dichter Abtastung der Probe, es erfordert dienicht immer möglich ist, z. B. für klinische Proben. In dieser Pipeline verwenden wir blockface Bilder als eine Reihe von Referenzbildern für die Histologie 19 Volumenrekonstruktion. Blockface Bilder der Paraffingewebeblöcke nach der Montage am Mikrotom genommen und vor jeder Abschnitt wird abgeschnitten. Somit muss Beschädigungen einzelner Serienschnitte Schnitt nicht mit der Registrierung der Serienschnitte 8,11,15 stören. Wir erfassen die blockface Bilder in einer anderen Weise von den anderen Gruppen. Die optischen Block Gesichtsbilder werden von einem telezentrischen Objektiv zu beseitigen oder zu minimieren, den Lauf und perspektivische Verzerrung, die in der Regel tritt auf, wenn mit regulären Linsen in der Optik erhalten. Dies ist einer der Vorteile der vorgeschlagenen Vorgehensweise gegenüber den anderen Methoden veröffentlicht, die blockface Bildgebung durchführen mit regulären Linsen. Die Bilder werden in einem geringen spitzen Winkel getroffen werden, um die Reflexion von der Oberfläche des Blocks zur Kontrastverstärkung zwischen dem TISS verwendenue und Paraffinoberfläche und den Schatten des Gewebes in der Tiefe unter der Oberfläche zu beseitigen Paraffin. Photographische Filter wird auch verwendet, um das Licht, das von der Blockoberfläche und dem Gewebe, um den Kontrast 19 ausgleichen zu polarisieren. Um die Verschiebung des Blocks auf der Rotationsmikrotom korrigieren, zwei bis drei Löcher in den Ecken des Blocks, die in den blockface Bilder leicht nachweisbar sind gebohrt. Die Schwerpunkte dieser Löcher werden zusammen mit Wahrzeichen-basierten starren Anmeldung benutzt, um die Bilder blockface auszurichten.

<table><tbody><tr><td>16 % PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16 % Paraformaldehyd-Lösung</td></tr><tr><td>Kassetten für die Verarbeitung kleiner Gewebe</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP300 automatisierter Gewebeprozessor</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100 % Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25307B</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR International</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Paraplast Einbettmedium</td></tr><tr><td>Leica EG 1160 Einbettungszentrum</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Rotationsmikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fräsmaschine</td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR International</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>H& E stain</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic stainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser&nbsp;</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>MEDITE RCM 7000 Glasabdecker</td><td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SCN400 Diascanner</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>Entwicklungssoftware</td></tr><tr><td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>3D-Visualisierungssoftware</td></tr></tbody></table>

die rekonstruktion der 3-dimensional histologie volume und seine anwendung auf maus milchdrüsen studieren

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histologie Volumenrekonstruktion erleichtert die Untersuchung von 3D-Form-und Volumenänderung eines Organs auf der Ebene der Makrostrukturen aus Zellen aufgebaut. Es kann auch verwendet werden, um zu untersuchen und Validierung neuer Techniken und Algorithmen, die in volumetrischen medizinischen Bildgebung und Therapie werden. Erstellen von 3D-High-Resolution-Atlanten von verschiedenen Organen, 1,2,3 ist eine weitere Anwendung der Histologie Volumenrekonstruktion. Dies stellt eine Ressource für die Untersuchung von Gewebestrukturen und die räumliche Beziehung zwischen verschiedenen zellulären Funktionen. Wir präsentieren eine Bildregistrierung Ansatz für die Histologie Volumenrekonstruktion, die eine Reihe von optischen blockface Bilder verwendet. Das rekonstruierte Histologie Volumen stellt eine zuverlässige Form der verarbeiteten Probe ohne breiteten Post-Processing-Registrierungsfehler. Die Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) gefärbten Schnitten von zwei Maus-Brustdrüsen wurden zu den entsprechenden Bildern mit blockface Grenzpunkte von der ed extrahiert registriertges der Probe in der Histologie und blockface Bilder. Die Genauigkeit der Registrierung wurde visuell bewertet. Die Ausrichtung der Makrostrukturen der Brustdrüsen wurde visuell mit hoher Auflösung untersucht. Diese Studie umreißt die verschiedenen Schritte des Bildregistrierungs Pipeline, von Entfernung der Brustdrüse durch den 3D-Volumenrekonstruktion Histologie. Während 2D-Histologie Bilder zeigen die strukturellen Unterschiede zwischen Paaren von Abschnitten, bietet 3D-Histologie Volumen die Möglichkeit, die Unterschiede in der Form und Volumen der Brustdrüsen zu visualisieren.

Ein Fallstrick der traditionellen Mikroskopie-Techniken ist, dass das Verständnis von einem Organ auf der mikroskopischen Ebene wird auf einem Feld-of-view in einer Zeit beschränkt. Auch &quot;total Offenlegung&quot; Dias, die gesamte Folie Abschnitte bieten, scheitern, um dreidimensionale Informationen. Mit der Entwicklung des gesamten Objektträger, dynamische Scan-Technologien, unsere Fähigkeit, einen Abschnitt in seiner Gesamtheit zu sehen gestiegen ist, aber die Extrapolation Strukturen erfordert 3D-Histologie Volum...

Wir präsentieren einen Bildregistrierungsansatz für die 3-dimensionale (3D) histologische Volumenrekonstruktion, der die Untersuchung der Veränderungen eines Organs auf der Ebene von Makrostrukturen ermöglicht, die aus Zellen bestehen. Mit diesem Ansatz untersuchten wir die 3D-Veränderungen zwischen Wildtyp- und Igfbp7-null-Brustdrüsen.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, einen Ansatz zur Bildregistrierung für die dreidimensionale Histologie und die Volumenrekonstruktion zur Untersuchung von Veränderungen in der makroskopischen zellulären Struktur der Brustdrüse vorzustellen. Dazu werden Brustdrüsen von Mäusen drei Tage nach Beginn der Laktation aus Wildtyp- und insulinähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein sieben, IGF BP sieben, defizienten Mäusen entfernt. Die Drüsen werden anschließend verarbeitet und in Paraffinblöcken eingebettet, um sie schneiden zu können.Als Nächstes werden weitere optische Blockflächenbilder der Gewebeproben aufgenommen und das Gewebeprobe wird präpariert. Bilder der Schnitte werden erfasst und mithilfe einer benutzerspezifischen Software jeder Schnitt mit dem entsprechenden Blockflächenbild ausgerichtet, um das histologische Volumen der Brustdrüse zu rekonstruieren. Die resultierenden Daten verdeutlichen Unterschiede in der Größe zwischen mutierten und Wildtyp-Drüsen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der dreidimensionalen konfokalen Zweifachmikroskopie liegt darin, dass sie Informationen über eine deutlich größere räumliche Ausdehnung bereitstellt. Diese Methode kann auch zur Untersuchung und Validierung neuartiger Techniken und Algorithmen in der volumetrischen medizinischen Bildgebung und Therapien verwendet werden, sowie zur Erstellung einer 3D-Analyse mit hoher Auflösung verschiedener Organe. Dieses rekonstruierte histologische Volumen bietet eine zuverlässige Darstellung des Probenmaterials ohne akkumulierte Registrierungsfehler.Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir bemerkten, dass IGF P seven null Mäuse kleinere Würfe haben und nicht in der Lage sind, mehrere große Würfe aufrechtzuerhalten, weshalb wir beschlossen, die Struktur ihrer Brustdrüsen zu untersuchen. Sobald das Gewebe in Paraffin eingebettet ist, verwenden Sie einen Rotationsmikrotom, um den Block so lange zu beschneiden, bis das überschüssige Paraffin entfernt ist. Anschließend bohren Sie mit einer vertikalen Fräsmaschine je einen Millimeter großen Bohrung in mindestens zwei Ecken des Paraffinblocks senkrecht zur Kassette und montieren den Gewebeprobeblock auf dem Rotationsmikrotom.Stellen Sie als Nächstes das Blockflächen-Bildgebungssystem vor dem Mikrotom auf, indem Sie eine Kamera mit Teleobjektiv in leichtem Winkel zur Oberfläche des Gewebeprobenblocks positionieren. Die Kamera sollte mit einem Computer vor dem Mikrotom verbunden sein. Platzieren Sie anschließend eine Lichtquelle vor dem Block, sodass die Kamera die Reflexion des Lichts von der Blockoberfläche erfasst.Stellen Sie den Winkel der Kamera so ein, dass das Gewebe an der Oberfläche des Blocks leicht vom umgebenden Paraffin unterschieden werden kann. Erfassen Sie ein optisches Bild der Blockoberfläche. Schneiden Sie anschließend mit dem Mikrotom Streifen aus vier Schnitten mit einer Dicke von fünf Mikrometern.Überführen Sie die Bänder in ein kaltes Wasserbad, trennen Sie die Abschnitte des Bandes und heben Sie dann den zweiten und vierten Abschnitt mit einem Löffel aus dem kalten Wasser auf einen Objektträger. Überführen Sie sie anschließend in ein warmes Wasserbad, um sie zu entfalten. Die Auswahl des zweiten und vierten Abschnitts gewährleistet einen Abstand von fünf Mikrometern zwischen den Abschnitten.Sobald sie entfaltet sind, remontieren Sie die Schnitte auf die Objektträger, indem Sie sie vorsichtig abschöpfen. Wie zuvor zu beachten ist, können das Schneiden, Montieren und Entfalten der Schnitte zu einigen Verzerrungen führen, wie beispielsweise Rissen, Falten, Schrumpfungen und Ausdehnungen. Diese Artefakte erschweren die Registrierung der Histologieschnitte.Färben Sie die Schnitte mit H und D mithilfe eines automatischen Färbeapparats. Danach decken Sie die Objektträger mit einem automatischen Deckglasgerät ab und digitalisieren die Objektträger mit einem digitalen histologischen Objektträgerscanner in der gewünschten Auflösung. Für dieses Protokoll beträgt die Vergrößerung 20 x und die Auflösung 0,47 Mikrometer.Dieser Abschnitt des Videos gibt einen Überblick über den Prozess der Bildregistrierung, der mithilfe einer in unserem Labor entwickelten benutzerdefinierten Software in Kombination mit MATLAB c plus plus durchgeführt wird. Beginnen Sie mit ITK, indem Sie die Histologiebilder auf die Auflösung der Blockflächenbilder heruntertakten. Dadurch werden die Histologiebilder um einen Faktor von 0,026 verkleinert.Danach zur Bildsegmentierung und Punktauswahl einige Blockflächenbilder in MATLAB öffnen und mit dem Datencursor-Tool die Pixelwerte der Registrierungslöcher messen. Den durchschnittlichen Pixelwert als festen Schwellenwert verwenden, um die Registrierungslöcher zu segmentieren. Um zusätzliche Segmente zu entfernen, die Kreisförmigkeit und die Fläche der segmentierten Objekte nutzen, um die Löcher beizubehalten und die zusätzlichen Segmente zu entfernen.Als Nächstes für jede Brustdrüse ein Blockquerschnittsbild als Referenz auswählen. Die Mittelpunkte der Registrierungslöcher der übrigen Blockquerschnittsbilder mit den Mittelpunkten der Registrierungslöcher des Referenzbilds ausrichten. Anschließend unter Verwendung der für die Registrierungslöcher erhaltenen Transformationen die Blockquerschnittsbilder ausrichten und für die ausgerichteten Blockquerschnittsbilder das Gewebe manuell segmentieren oder aus dem Hintergrund für die h- und d-Abschnitte extrahieren.Verwenden Sie die OSU-Schwellenwertmethode, um die Bilder vom Hintergrund zu segmentieren und binäre Masken der Histologiebilder zu erstellen. Identifizieren und wählen Sie anschließend anhand des Histogramms der markierten Objekte das größte Objekt in jeder Maske aus. Extrahieren Sie die Randpunkte mit einer Breite von einem Pixel aus den Masken der Histologie- und der Blockoberflächenbilder.Verwenden Sie anschließend einen Algorithmus auf der Grundlage von Fourier-Deskriptoren, um die anfängliche starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Histologie und den entsprechenden Blockoberflächenbildern zu bestimmen. Diese anfängliche Transformation umfasst Translations-, Rotations- und Skalierungsfaktoren. Transformieren Sie jedes Histologiebild mit der aus dem vorherigen Schritt erhaltenen Anfangstransformation.Um die starre Registrierung zu verfeinern, entfernen Sie mithilfe eines Rolling-Ball-Filters die Randabschnitte mit hoher Krümmung aus der histologischen Kontur. Wählen Sie anschließend aus den verbleibenden histologischen Begrenzungspunkten mittels gleichmäßiger Verteilung zufällig 500 Punkte aus. Transformieren Sie die histologischen Begrenzungspunkte mit der anfänglichen Transformation, die aus den Fourier-Deskriptoren erhalten wurde.Verwenden Sie die Grenzpunkte der Blockoberfläche und den Algorithmus der iterativen nächstgelegenen Punkte, um die starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Blockoberfläche und der Histologie zu bestimmen. Zufällige Grenzpunkte. Transformieren Sie anschließend die Histologiebilder aus dem vorherigen Schritt, um ein visuelles Bild des Histologievolumens in der 3D-Visualisierungssoftware zu erstellen.Wählen Sie im Labor die Module aus, bearbeiten Sie Sonstiges und fügen Sie das Modul „3D aus 2D-Dateien zusammensetzen“ hinzu. Wählen Sie anschließend Bild aus dem Menü und fügen Sie das Modul „Bildeigenschaften konvertieren“ hinzu. Fügen Sie schließlich ein „3D-Anzeige“-Modul aus den 3D-Ansichtsmodulen unter Visualisierung hinzu.Doppelklicken Sie auf „3D aus 2D-Dateien zusammensetzen“, um die Bilder zu laden, und klicken Sie auf „3D erstellen“. Passen Sie die Voxelgröße an, indem Sie doppelt auf „Bildeigenschaft konvertieren“ klicken, und stellen Sie die Voxelgröße auf 0,018 0,018 0,01 ein. Zeigen Sie das Volumen an, indem Sie doppelt auf „3D-Ansicht“ klicken.Schließlich betrachten Sie den Bildstapel mit fünfmaliger Vergrößerung, indem Sie die Schritte im beigefügten Dokument befolgen. Um den Defekt des I-G-F-B-P-sieben-Null-Mausmodells besser charakterisieren zu können, wurde eine dreidimensionale Rekonstruktion der Milchdrüsen wie hier beschrieben durchgeführt. Diese Abbildungen zeigen die rekonstruierten histologischen Volumina der Milchdrüsen von Wildtyp und Null-Mausmodell.Beachten Sie, dass die mutierte Drüse rechts kürzer und schmaler ist als die Wildtyp-Drüse links, jedoch eine ähnliche Tiefe aufweist: Die Wildtyp-Drüse misst 1,06 Millimeter und die Null-Drüse 1,02 Millimeter Tiefe. Achten Sie außerdem darauf, dass die Wildtyp-Drüsen links nur wenig Stromagewebe aufweisen, das durch die rosa Eosin-Färbung erkennbar ist, während die Null-Drüsen rechts überwiegend aus Stromagewebe zu bestehen scheinen. Die hier verwendete Hämatoxylin-Färbung, die kernhaltige Zellen nachweist, zeigt, dass die Null-Drüse ihre Dichte beibehält, während die Wildtyp-Drüse hauptsächlich drüsenförmige Strukturen enthält.Um dies weiter zu untersuchen, wurden hier höher aufgelöste Bilder des Lymphknotenbereichs zusammengestellt. Es sind große Strukturen sichtbar, die mit Milch gefüllt gewesen wären. Im Gegensatz dazu weist die I-G-F-B-P-sieben-Null-Drüse nur wenige gut entwickelte Strukturen auf.Außerdem sind diese Strukturen dicht mit fibroblastenähnlichen Zellen besiedelt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine 3D-Rekonstruktion eines Organs durch die Neuerstellung von seriellen Schnittbildern erzeugt. Gut. Nun ist es bei der Durchführung dieses Verfahrens wichtig, daran zu denken, die Objektträger und Scans konsequent zu benennen, da sowohl von den Objektträgern als auch von den Scans eine große Anzahl vorhanden sein wird und eine sequenzielle Organisation der Schlüssel zum Erfolg bei diesem Verfahren ist.Andere Methoden wie die Immunhistochemie für spezifische Zell- und Krankheitsmarker können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie durchdringt das Gefäßsystem einen Tumor?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Methode beschreibt, wie zu sezieren und zu bewerten Brustdrüse Entwicklung und Funktion von Mäusen. Abgeschnittene Milchdrüsen sind für den Grad der Entwicklung mit whole mount beurteilt, während Milchspendereflex wird ausgewertet, wobei Oxytocin-basierte myoepithelialen Zelle Kontraktion Assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

Mit Hilfe von MRT-Scans (Mensch), 3D-Bildgebungssoftware und immunhistologischer Analyse dokumentieren wir Veränderungen an den Seitenventrikeln des Gehirns. Die longitudinale 3D-Kartierung von Volumenänderungen des lateralen Ventrikels und die Charakterisierung periventrikulärer zellulärer Veränderungen, die im menschlichen Gehirn aufgrund von Alterung oder Krankheit auftreten, werden dann an Mäusen modelliert.

3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus

Die Brustdrüsenentwicklung im Nagetier wurde typischerweise mit deskriptiven Beurteilungen oder durch Messung von physikalischen Grundattributen ausgewertet. Die Verzweigungsdichte ist ein Indikator für die Entwicklung von Mamma, der objektiv schwer zu quantifizieren ist. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die quantitative Beurteilung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften.

Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

Wir entwickelten eine Methode zur erfolgreichen Entfernung, Verarbeitung, Sektion und Flecken, zur histopathologischen Auswertung, Mammagewebe, das ursprünglich auf Rutschen als ganze Reittiere fixiert worden war. Diese Methode kann die Sammlung und Auswertung von Brustdrüsen-Vollbehältern in Reproduktions- und Entwicklungsprüfungsstudien fördern.

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

Wir beschreiben Techniken zur Differenzierungsinduktion von zwei Brustepithellinien, HC11 und EpH4. Während beide fetales Kalbsserum, Insulin und Prolaktin benötigen, um Milchproteine zu produzieren, können sich EpH4-Zellen in der dreidimensionalen Kultur vollständig in Mammosphären differenzieren. Diese komplementären Modelle sind nützlich für Signaltransduktionsstudien der Differenzierung und Neoplasie.

Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges Brustbildfenster mit einem austauschbaren Deckel (R.MIW). Die intravitale Mikroskopie nach Implantation des R.MIW ermöglicht eine Längs- und Mehrtagesbildgebung der gesunden und erkrankten Brustdrüse mit zellulärer Auflösung während der verschiedenen Entwicklungsstadien.

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Es wird ein Verfahren der intraduktalen Injektion von Reagenzien für eine ethanolbasierte ablative Lösung in den maktalen Brustbaum der Maus zur In-vivo-Bildgebung und Brustkrebsprävention beschrieben. Die Injektion direkt in die Brustwarzenöffnung ermöglicht das Targeting von Brustepithelzellen mit minimalen Kollateralschäden.

Intraduktale Verabreichung und Röntgenvisualisierung von Ethanol-basierter ablativer Lösung zur Prävention und lokalen Behandlung von Brustkrebs in Mausmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Technik zur intravitalen Bildgebung der Milchdrüse der laktierenden Maus mittels konfokaler Laserscanning- und Multiphotonenmikroskopie.

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

Lernen Sie die Bildregistrierung zur dreidimensionalen Histologie-Rekonstruktion von Mausmilchdrüsen. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Makrostrukturen und vergleicht Wildtyp- mit Igfbp7-null-Mäusen.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

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