Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Interaktion von zwei Proteinen zu überwachen, die in intakten Tabakblättern exprimiert werden. Dies wird erreicht, indem geeignete Konstrukte entworfen werden, die beiden interessierenden Gene zu fluoreszierenden Proteinen fusionieren und diese Konstrukte in Agrobakterien umgewandelt werden. In einem zweiten Schritt werden Agrobakterienkulturen gemischt und in Tabakblätter injiziert, was zur Expression der Proteine und einem rekonstituierten Fluoreszenzsignal führt.

Kommen die Proteine in nähere Nähe, werden als nächstes entweder ganze Blätter oder isolierte Protoplasten unter dem Mikroskop analysiert. Es werden Ergebnisse erzielt, die Protein-Protein-Wechselwirkungen basierend auf dem emittierten Fluoreszenzsignal zeigen, das durch Fluoreszenzmikroskopie detektiert wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie Cor-Immunpräzipitation oder Hefe-zu-Hybrid-Technologie besteht darin, dass die Protein-Protein-Interaktion direkt in der lebenden Pflanzenzelle überwacht werden kann.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Pflanzenbiologie zu beantworten, wie z.B. die Bildung von Proteinkomplexen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie die Agrobakterien, die für die Umwandlung der Tabakblätter verwendet werden sollen. 10 Milliliter LB-Medium, das die entsprechenden Antibiotika enthält, werden mit 50 Mikrolitern der AG L-1-Glycerin-Stammkultur, die das gewünschte Plasmid enthält, in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen inokuliert.

Inkubieren Sie mindestens 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius und schütteln Sie bei 190 U/min, bis die Kultur am nächsten Tag einen OD 600 zwischen 1,0 und 2,0 erreicht. Zentrifugieren Sie die Bakterien bei 3000 mal G für 15 Minuten. Nach dem Verwerfen des Überstandsresus wird das Pellet in frisch hergestelltem Infiltrationsmedium suspendiert und die Suspension auf einen OD 600 von 1,0 eingestellt.

Inkubieren Sie die Agrobakterienzellen in einem Überkopfschüttler für zwei Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur zur Infiltration der Tabakblätter. Wählen Sie mehrere ältere Blätter von einer drei Wochen alten Tabakpflanze. Gleiche Volumina mischen.

Jeweils drei Milliliter der Agrobakterien, die die interessierenden Konstrukte tragen. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze ohne Nadel mit der Zellsuspensionsmischung, um die Zellsuspension in die Tabakblätter zu infiltrieren. Drücken Sie die Spritze an mehreren Stellen vorsichtig auf die Unterseite der Blätter, gießen Sie die Pflanzen und lassen Sie sie zwei Tage lang abgedeckt und lichtgeschützt stehen.

Um Protoplasten aus einem infiltrierten Blatt zu isolieren, legen Sie das Blatt zunächst in eine Petrischale und fügen Sie etwas frisch zubereitete Enzymlösung hinzu. Schneide das Blatt mit einer neuen Rasierklinge in etwa 0,5 Quadratzentimeter große Stücke. Als nächstes überträgst du die Blattstücke mit der Enzymlösung in ein Vakuum.

Versickerungskolben. Vakuuminfiltrieren Sie ca. 20 Sekunden lang, bis Luftblasen aus den Blättern austreten. Lassen Sie das Vakuum sehr vorsichtig los.

Den Kolben nach 90 Minuten 90 Minuten bei 40 U/min im Dunkeln bei Raumtemperatur schütteln. Lösen Sie Protoplasten, indem Sie eine Minute lang bei 90 U/min schütteln. Die Lösung wird durch die Gaze in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden filtriert.

Überlagern Sie die Protoplastenlösung mit zwei Millilitern FPCN-Puffer und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 70-fachem G mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung bei Raumtemperatur. Intakte Protoplasten reichern sich an der Grenzfläche zwischen der Enzymlösung und FPCN an. Mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung und einem Milliliter werden die intakten Protoplasten in ein frisches Zentrifugenröhrchen übertragen. Für den Erfolg dieses Verfahrens sollten Sie immer weiße Blendenspitzen verwenden, um ein Reißen intakter Protoplasten zu verhindern.

Das Röhrchen wird zwei Minuten lang bei 100-facher G mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung mit W Fünf-Puffer-Zentrifuge befüllt. Um die Protoplasten zu pelletieren, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. In etwa 200 Mikrolitern W fünf Puffer, abhängig von der Menge der Protoplasten.

Um eine Protoplastenprobe für die Laserscanning-Mikroskopie vorzubereiten, werden zunächst zwei kleine Streifen Dichtmittel im Abstand von etwa zwei Zentimetern auf einen Objektträger gelegt. Geben Sie 20 Mikroliter der Protoplastenlösung zwischen die Streifen und legen Sie vorsichtig ein Deckglas darauf. Die Dichtstoffstreifen verhindern, dass die Protoplasten durch das Deckglas gequetscht werden.

Um eine Gesamtblattprobe für die Laserscanning-Mikroskopie vorzubereiten, schneiden Sie ein ein Zentimeter großes Stück aus dem Blatt ab und legen Sie es mit der Unterseite des Blattes nach oben auf einen Objektträger. Füge etwa 30 Mikroliter Wasser hinzu. Legen Sie ein Deckglas darauf und befestigen Sie es auf beiden Seiten mit Klebeband fest.

Die Bildgebung erfolgt mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop von MICCA vom Typ TCS SP five zur Vergrößerung. Verwenden Sie ein Objektiv mit einer Vergrößerungsgröße von 63 x mit Glycerin als Bildgebungsmedium und verwenden Sie die fortschrittliche Fluoreszenzsoftware der Leica Application Suite zur Auswertung. Stellen Sie den Argonnenlaser auf 30 % und die Laserleistung bei 488 Nanometern auf eine Intensität von 18 % einUm das Signal bei 515 Nanometern zu überwachen, stellen Sie die Emissionsbandbreite des ersten PMT-Detektors von 495 bis 550 Nanometern ein.

Zur Überwachung der Chlorophyll-Autofluoreszenz. Stellen Sie eine zweite Emissionsbandbreite des PMT-Detektors von 650 bis 705 Nanometern ein. Um das M-Kirschsignal zu überwachen, verwenden Sie den Laser HENI 5 61.

Stellen Sie die Intensität des Lasers auf 18 % und die Emissionsbandbreite eines dritten PMT-Detektors auf 587 bis 610 Nanometer ein. Stellen Sie sicher, dass Bilder von allen PMT-Detektorkanälen mit den gleichen Verstärkungseinstellungen aufgenommen werden. Die Verstärkung sollte zwischen 800 und 900 liegen, um Hintergrundsignale auszuschließen.

Erfassen Sie Bilder in diesem Format, Breite und Höhe von 1024 x 1024 Pixeln mit einer Scangeschwindigkeit von 100 Hertz. Verwenden Sie für Z-Stapel einen maximalen Abstand von 0,5 Mikrometern zwischen den einzelnen Stapeln. In dieser Arbeit wurde die BFC-Methode verwendet, um die Interaktion des zytosolischen molekularen Chaperons HSP 90 mit den Membranandockproteinen TPR seven und to 64 zu überwachen.

Wie in diesem Schema gezeigt, ist Venus an den zytosolischen Teil von TPR 7 gekoppelt, der sich am endoplasmatischen Retikulum befindet, oder an 64, der sich in der äußeren Hülle der Chloroplasten befindet. Hs.P 90 ist N-terminale fusioniert mit SCFP, was die Interaktion der TPR-Domänen von talk 64 und TPR seven ermöglicht. Mit dem HSP 90 C, Terminus, wird SCFP allein im Zytosol als Negativkontrolle exprimiert, um die Lokalisation des TPR seven HS P 90 Proteinkomplexes zu verifizieren. TPR seven und HS P 90 wurden mit einem ER-Marker co-transformiert.

Die Fluoreszenz wurde an intakten Blättern als Kontrolle überwacht. SCFP allein wurde zusammen mit TPR 7 und dem ER-Marker exprimiert. In allen gezeigten Bildern stellt der Maßstabsbalken 10 Mikrometer dar.

Die Tafeln auf der linken Seite zeigen die rekonstituierte Fluoreszenz in Grün, die bei 515 Nanometern überwacht wurde. Die EB-Markierung wird rot angezeigt. In den mittleren Panels ist die Überlagerung beider Signale zu sehen.

Es wurde ein rekonstituiertes Signal für TPR 7 zusammen mit HS P 90 überwacht, das sich überlappte, wobei der ER-Marker gelb erschien. Im Gegensatz dazu wurde kein Signal für TPR sieben und die Negativkontrolle als CFP überwacht. Im nächsten Beispiel wurde das Chloroplastenprotein tox 64 mit HS P 90 als Kontrolle coexprimiert.

Tox 64 wurde zusammen mit SCFP allein exprimiert. Wie zuvor wurde die rekonstituierte Fluoreszenz in Grün bei 515 Nanometern überwacht. Die mittleren Felder zeigen die Chlorophyll-Autofluoreszenz, die bei 480 Nanometern überwacht wurde.

In den rechten Feldern wird eine rote Überlagerung beider Signale angezeigt. Rekonstituierte Fluoreszenz wurde in Zellen beobachtet, die Coex exprimierend Tox 64 und HSP 90 exprimieren, jedoch nicht in Zellen. Coex, das Tox 64 und SCFP allein exprimiert.

Da die genaue Lokalisation von tox 64 und HSP 90 in mikroskopischen Aufnahmen der gesamten Blätter schwer zu bestimmen ist. Protoplasten wurden aus infiltrierten Tabakblättern für die Fluoreszenzmikroskopie isoliert. Wie zuvor wurde die rekonstituierte Fluoreszenz bei 515 Nanometern überwacht, die Chlorophyll-Autofluoreszenz bei 480 Nanometern und es wurden Overlay-Bilder erstellt, wie in diesem Overlay-Bild gezeigt, bis 64 und HSP 90 können als ringförmige Strukturen detektiert werden, die den Chloroplasten Off umgeben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Konstrukte entwerfen, Tabakblätter transformieren und wie Sie das Fluoreszenzsignal am besten visualisieren, das die Interaktion Ihrer beiden interessierenden Proteine zeigt.