BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine große Anzahl rekombinanter Nachkommen aus einer Hefe-Kreuzung zu erzeugen, wobei gleichzeitig die Information erhalten bleibt, welche Nachkommen aus demselben ursprünglichen Tetrad stammen. Dies wird erreicht, indem zunächst der für die Kreuzung verwendete heterozygote diploide Stamm mit einer Plasmidbibliothek transformiert wird, die einen tetradenspezifischen Barcode und einen für die Sporulation spezifischen fluoreszierenden Reporter enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die barcodierten Zellen in Sporulationsmedium zu überführen.

Dies ermöglicht die Bildung von Tetras und induziert die Expression des GFP-Fluoreszenzreporters in Tetras, jedoch nicht in Zellen, die keine Sporulation durchlaufen. Anschließend trennt ein FACS-Sorter die fluoreszenzmarkierten Tetras von anderen Zellen und gibt sie direkt auf eine Agarplatte, wo die äußere Umhüllung der Tetras enzymatisch verdaut wird. Der letzte Schritt besteht darin, Glasperlen zu verwenden, um die Sporen der aufgelösten Tetras zu trennen und gleichmäßig auf der Oberfläche der Agarplatte zu verteilen, sodass aus jeder Spore eine einzelne Kolonie entstehen kann.

Letztendlich werden die mit dieser Methode gewonnenen Stämme mittels eines hochdurchsatzfähigen, multiplexfähigen DNA-Sequenzierprotokolls genotypisiert, das den tetraspezifischen Barcode jedes Stammes ausliest. Anschließend dienen die Barcodes zur Identifizierung der vier Stämme, die aus einem einzelnen meiotischen Ereignis hervorgegangen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der manuellen Tetraden-Dissektion unter Verwendung eines Mikromanipulators, liegt darin, dass ein Forscher mehrere tausend rekombinante Nachkommen innerhalb weniger Stunden isolieren kann.

Die in dieser Studie verwendeten diploiden Hefezellen wurden zuvor wie in der begleitenden Publikation beschrieben mit einer Bibliothek barcodierter Plasmide transformiert und bei minus 80 Grad Celsius zur Wiederbelebung der Zellen aus den gefrorenen Stöcken gelagert. Kultivieren Sie sie über Nacht in fünf Millilitern YPD plus 200 Mikrogramm pro Milliliter G418 bei 30 Grad Celsius unter Schütteln am folgenden Tag. Waschen Sie die Zellen aus den Übernachtkulturen dreimal in PBS und resuspendieren Sie sie anschließend auf ein Endvolumen von zwei Millilitern in Sporulationsmedium plus 200 Mikrogramm pro Milliliter.

Rühren Sie die Sporulationskulturen vier bis 18 Stunden bei Raumtemperatur. Überwachen Sie den Fortschritt der Sporulation täglich, bis keine neuen Tetraden mehr gebildet werden. Typischerweise dauert dies zwei bis vier Tage, sobald die Kulturen gut ausgebildete Tetraden und relativ wenige Dyaden enthalten.

Entfernen Sie die Kulturen von der Schütteln und lassen Sie sie mindestens sieben Tage bei Raumtemperatur stehen, bevor Sie die Tetraden sortieren. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, eine gute Trennung der Sporen zu erzielen. Wir haben empirisch festgestellt, dass das Stehenlassen der sporulierenden Kulturen bei Raumtemperatur ohne Schütteln für mindestens eine Woche vor der Tetradensortierung die Sporentrennung erheblich verbessert.

Die Tetraden aus der Sporulationskultur können mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder Fax detektiert und isoliert werden, da die barcodierten Plasmide in den diploiden Zellen außerdem ein sporulationsspezifisches GFP-Fusionsprotein tragen. Das hier beschriebene Protokoll wurde für einen Fax Aria Two entwickelt. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie die sporulierte Kultur in den Fax-Sorter ein und richten Sie zwei Gates für forward scatter und side scatter ein, um Trümmer, aggregierte Zellen und mehrere Zellen pro Tröpfchen auszuschließen.

Es sollte eine Population fluoreszierender Zellen vorhanden sein, die bei Verwendung des PS-two-GFP-Reporter-Konstrukts Dyaden und Tetraden umfasst; verwenden Sie hierfür die Einstellung GFP versus FSC, um diese fluoreszierenden Ereignisse einzuschließen. Abhängig vom Stammhintergrund kann es notwendig sein, ein zusätzliches Gating einzufügen, um Aggregate auszuschließen, die Tetraden und andere Zellen enthalten. Untersuchen Sie ein FSC-Histogramm der fluoreszierenden Ereignisse.

In diesem Beispiel bestehen die Ereignisse im linken Peak hauptsächlich aus Tetrasporen, während die Ereignisse im rechten Peak überwiegend Tetrasporen mit einem angehefteten Keimling darstellen. Wenden Sie ein abschließendes Gate an, das Ereignisse mit niedrigerer FSC umfasst, die größtenteils Tetrasporen entsprechen, wie durch die roten Balken angezeigt. Überprüfen Sie die Effizienz des Gating-Regimes, indem Sie etwa 1.500 Tetrasporen auf einen Mikroskopträge richten und den Anteil von Tetrasporen gegenüber Nicht-Tetrasporen bestimmen. Mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops bei 400-facher Vergrößerung kann der Prozentsatz an Tetrasporen genau geschätzt werden, indem lediglich etwa 200 sortierte Ereignisse gezählt werden. Die Sortierung von etwa 1.500 Ereignissen reduziert jedoch die Zeit, die für die Suche nach Zellen auf dem Mikroskopträge benötigt wird.

Diese Hellfeldaufnahmen zeigen eine 600-fache Vergrößerung. Zeigen Sie Beispiele für Tetraden auf der linken Seite und Nicht-Tetraden auf der rechten Seite nach der Sortierung anhand der FACS. Überprüfen Sie regelmäßig, ob der Sortierer die Anzahl der Ereignisse korrekt erfasst, indem Sie 25 Tetraden auf einen Mikroskopobjektträger sortieren und die in der Tröpfchen enthaltenen Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung untersuchen.

Es sollten sich 25 Tetraden im Tropfen befinden. Wiederholen Sie den Vorgang drei- oder viermal, um die Varianz des Fax-Geräts in diesem Durchlauf zu bewerten. Bereiten Sie die Agarplatten für dieses Verfahren vor, indem Sie die gewünschte Anzahl an YPD-Platten plus G vier 18 mindestens 1,5 Stunden in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator in der Nähe des Fax-Sortiergeräts erwärmen.

Ein wesentliches Merkmal des Sortierprotokolls ist die Möglichkeit, gezielt fax-sortierte Tetraden an eine bestimmte Stelle auf einer Agarplatte zu übertragen, die einen Pool der X-Lösung enthält. Platzieren Sie hierzu zunächst eine Referenz-96-Loch-Platte auf der automatisierten Zellablageeinheit des Sortiergeräts. Bereiten Sie anschließend ein Sortierlayout vor, das 25 Tetraden in ein Loch einer 96er-Platte sortiert.

Die Sortierung im 25-Tetra-Format pro Platte ergibt gut getrennte Kolonien. Wählen Sie eine Vertiefung nahe der Mitte der Platte aus. Zum Beispiel Vertiefung D5.

Bringen Sie einen Stapel von 10 Agarplatten aus dem 37-Grad-Celsius-Inkubator zum Sortiergerät. Nehmen Sie eine Agarplatte und pipettieren Sie 25 Mikroliter ZY-Lösung nahe dem Zentrum der Platte auf den Agar. Anschließend stellen Sie die Platte auf die Referenz-96-Well-Platte und richten den X-Tropfen über dem Ziel aus.

Nun, das wurde zuvor ausgewählt. Nun D fünf. Beginnen Sie die Sortierung und geben Sie 25 Tetras in die Mitte des Zytropfens auf der Agarplatte ab.

Entfernen und abdecken Sie die Platte. Wiederholen Sie die Sortierung für jede Platte, bis 25 Tetraden auf jeder Platte im Stapel in Zamo-Tropfen sortiert wurden. Stellen Sie den Stapel der Platten mit den Tetraden in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator zurück.

Bringen Sie den nächsten Stapel mit 10 Platten zum Sortiergerät und wiederholen Sie den Sortiervorgang. Sporen können getrennt werden, nachdem die Agarplatten, die Tetraden enthalten, 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden. Um diesen Vorgang zu beginnen, geben Sie 15 bis 25 sterile Glasperlen mit einem Durchmesser von drei Millimetern zu jeder Platte hinzu und schütteln die Platten als zwei Stapel mit jeweils fünf Platten für drei bis fünf Minuten.

Die beste Sporenseparation wird erreicht, indem die Platten starr von Seite zu Seite oder von vorne nach hinten bewegt werden. Bewegen Sie die Platten nicht so, dass die Kügelchen am Außenrand der Platte wirbeln. Lassen Sie die Kügelchen nach Beendigung auf den Platten.

Stellen Sie den Stapel der Platten mit den Kügelchen nach oben in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius. Entnehmen Sie den nächsten Plattenstapel aus dem Inkubator bei 37 Grad Celsius und wiederholen Sie den Sporen-Trennungsprozess unter Verwendung der Kügelchen. Inkubieren Sie alle Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius am Tag nach der Sporentrennung.

Entfernen Sie die Platten vorsichtig aus dem 30 Grad Celsius warmen Inkubator, ohne die Glasperlen zu stören. Auf den Platten sollten sich kleine Kolonien gebildet haben. Entfernen Sie die Glasperlen, indem Sie die Platten vorsichtig und schnell über einem tiefen Behälter umdrehen.

Wenn die Platte umgedreht wird und man leicht auf den Boden klopft, kann dies helfen, Perlen zu lösen, die an der Platte haften. Die Behälter sollten tief genug sein, um die Perlen aufzufangen, ohne dass diese hochspringen und die Agarplatte berühren. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte und verwenden Sie diese Anzahl, um die Effizienz der Sporenseparation und -rückgewinnung abzuschätzen.

Beispielsweise könnten 25 Tetraden pro Platte bei einem Kreuzungsexperiment mit nahezu 100 %iger Vitalität insgesamt 100 Kolonien pro Platte ergeben, wenn die Platten ausreichend viele Kolonien aufweisen, beispielsweise mehr als 65 bei hoher Vitalität. Übertragen Sie die Zellen von jeder Kolonie in eine separate Vertiefung einer 96-Loch-Platte, die flüssiges YPD plus G vier 18 enthält. Notieren Sie außerdem, welche Vertiefungen Kolonien derselben Agarplatte enthalten.

Diese Informationen werden später zur Unterstützung der Tetradenzuordnung verwendet. Software kann die Geschwindigkeit, mit der Sporen aus Tetrads isoliert werden können, erheblich verbessern. Obwohl die aktuelle Version der Methode einen gewissen Verlust an Effizienz im Vergleich zur manuellen Dissektion aufweist, wurde die Binomialverteilung verwendet, um den erwarteten Anteil an Tetrads mit mindestens einer erfolgreich gewonnenen Spore, die 1, 2, 3 oder vier Kolonien hervorbringt, basierend auf dem Anteil aller erfolgreich gewonnenen Sporen zu berechnen.

Dieses Diagramm kann als grobe Orientierung für die Anzahl der Stämme dienen, die letztendlich zu drei oder vier Sporentetraden zusammengefügt werden, wie hier beobachtet. Die Anzahl der gewonnenen vollständigen Tetraden steigt mit der Anzahl der Kolonien pro Platte in dieser Studie. 25 Radien aus Kreuzungen mit einer Sporenviabilität nahe 100 %, wie durch manuelle Dissektion bestimmt, wurden auf 149 Agarplatten ausgestrichen.

Die maximale Anzahl an Kolonien, die pro Platte beobachtet wurde, betrug 80, was darauf hinweist, dass 20 Sporen keine diskreten Kolonien bildeten. Die durchschnittliche Anzahl an Kolonien pro Platte betrug 62. 4.354 Kolonien von 61 Platten, die 65 oder mehr Kolonien enthielten, wurden geerntet und sequenziert. Von den 3.700 Stämmen, die die Qualitätskontrolle nach der Sequenzierung bestanden, konnten 2.665 oder 72 % computergestützt drei oder vier Sporentetraden zugeordnet werden. Sobald dies beherrscht ist.

Mit dieser Technik können mehr als tausend Tetraden pro Stunde bearbeitet werden. Für Präzisionsarbeiten, die länger als drei Stunden dauern, benötigen Sie jedoch Unterstützung.