Name: Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Erfahren Sie, wie Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) zur Identifizierung von zyklischen di-GMP-Bindungsproteinen in Bakterien eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht spezifische Proteinbindung und rigorose Waschbedingungen durch kovalente Vernetzung.

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Wir danken Alberto Reinders für seine Arbeit zur Optimierung der CCMS-Bedingungen für P. aeruginosa. Wir danken auch Pablo Manfredi für die Annotation der P. aeruginosa-Proteine. Diese Arbeit wurde durch das Sinergia-Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (SNF) CRSII3_127433 unterstützt.

1. Lysatherstellung <ol><li> Wachsen P. aeruginosa-Zellen in LB an die gewünschte OD. HINWEIS: Für Hinweise: Verwenden ≈ 100 ml Kultur / Probe für stationäre Phase Kulturen und ≈ 500 ml cultur / Probe für log-Phase Kulturen (OD 600nm = 0,5). </li><li> Pellet durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g. </li><li> Resuspendieren 0,5-1 g Pellet in 1 ml Lyse-Puffer (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, 1 mM DDT, pH 7,5) und füge einen Proteaseinhibitor (vollständige Mini, EDTA-frei) sowie als DNaseI. </li><li> Lyse der Zellen durch 3 Passagen durch einen Französisch Druckzelle bei 20.000 psi (siehe Materialliste). </li><li> Ultrazentrifuge das Zelllysat bei 100.000 x g für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Speichern Sie den Überstand (gehen Sie zu Schritt 2). </li><li> Durch Auf- und Abpipettieren Waschen des Pellets mit 1 ml 1x Lysepuffer. </li><li> Ultrazentrifuge bei 100,000 x g für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Flash-einfrieren des Pellets inflüssigem Stickstoff und bei -20 ° C bis zur Erfassung von Membranproteinen (siehe Schritt 3). </li></ol> 2. Entfernung von Freier c-di-GMP und andere Nukleotide (lösliche Fraktion Only) <ol><li> Mit 10 ml kaltem Lysepuffer Waschen eine PD10-Entsalzungssäule (siehe Materialliste). </li><li> Gießen Sie den Überstand (≈ 1 ml) auf die PD10, um Nukleotide zu entfernen. </li><li> Eluiert mit 4 ml kaltem Lysepuffer (500 ul Stufen). </li><li> Wählen Sie die am stärksten konzentrierten Fraktionen wie von Bradford bestimmt und sie gemeinsam. </li></ol> 3. Pellet Resuspension und Solubilisierung (Membranfraktion Only) <ol><li> Das Pellet in 500 bis 1000 ul 1x Sammlungspuffer (ohne Reinigungsmittel) (siehe Tabelle 1). HINWEIS: Das Pellet ist schwierig, wieder zu suspendieren. Es ist mit der ersten Pipette auf und ab mit einer Pipette wird empfohlen, etwa das Pellet, dann, eine Spritze 27 G zu verwenden, um auch die Lösung zu homogenisieren. </li><li> 1% (w / v) n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM). </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 h (oder O / N) auf einem rotierenden Rad. </li><li> Ultrazentrifuge bei 100,000 x g für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Ernten Sie den Überstand. </li></ol> 4. Proteinkonzentrationsmessung <ol><li> Messung der Proteinkonzentration durch Bradford-Assays (BCA-Assay für Membranfraktion). </li><li> Stellen Sie die Gesamtproteinkonzentration auf 10 mg / ml. </li></ol> 5. Erfassen <ol><li> Mischungs 300 ug Protein und mit 1 mM GDP, GTP, ATP, CTP und 20 ul 5x Aufnahmepuffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% Glycerin, pH 7,5) (Tabelle 1). Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 100 ul mit H 2 O. HINWEIS: das Gesamtvolumen umfasst das Volumen des CDG-CC und c-di-GMP bei der Wettbewerbskontrolle (siehe Schritt 5.3 und Tabelle 2). HINWEIS: Alle Experimente wurden in 200 &amp; geführt# 181; l 12-Rohr-PCR-Streifen (Thermo Scientific). HINWEIS: für die Membranfraktion, stellen Sie sicher, immer die DDM-Konzentration zu halten über der kritischen Mizellenkonzentration (0,01% w / v), bis das Protein Solubilisierungsschritt in 8 M Harnstoff (Schritt 7.1). </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 30 min auf einem sich drehenden Rad. </li><li> In 10 uM CDG-CC (Endkonzentration). HINWEIS: eine Steuer ohne CDG-CC (als &quot;Perle Steuerung&quot; bezeichnet), und eine Steuer mit 1 mM c-di-GMP (&quot;Wettbewerbskontrolle&quot;) ergänzt (siehe Tabelle 2). Hinweis: Die CDG-CC-Konzentration von 1 bis 10 &amp; mgr; M eingestellt werden. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 h (O / N für die Membranfraktion) auf einem rotierenden Rad, in der Dunkelheit. </li><li> Nach einer kurzen Spin, vernetzen durch Aktivierung des reaktiven Rest des CDG-CC mit UV-Licht für 4 Minuten mit einem CaproBox (siehe Materialliste, λ = 310 nm, Bestrahlungsstärke ≥10 mW / cm², Entfernung von der Quelle = 2 cm). HINWEIS: Entfernen Sie den Deckel der Streifen vor der Vernetzung. </li><li> Man gebe 25 &amp; mgr; l 5x-Waschpuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) und 50 ul gut resuspendierten Streptavidin-Magnetkügelchen, sanft zu homogenisieren. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 1 h auf einem rotierenden Rad. </li></ol> 6. Waschschritte HINWEIS: (Magnet: siehe Materialliste). Beginnen Sie mit einer Erfassung der magnetischen Kügelchen in der PCR-Streifen Deckel, mit dem Magneten. Dann ersetzen Sie die PCR Streifen durch eine neue mit dem nächsten Waschlösung. Entfernen Sie den Magneten und resuspendieren die Perlen, und Inkubation 2 min. Spin down, und ersetzen Sie den Deckel durch eine frische Deckel. <ol><li> Waschschritte (lösliche Fraktion nur) <ol><li> 6-mal in 200 ul 1x Waschpuffer waschen. </li><li> Einmal in 200 ul HPLC-Qualität H 2 O Waschen </li><li> 6-mal in 200 ul 80% Acetonitril waschen. </li><li> Waschen Sie 2-mal in 200 ul HPLC-Qualität H 2 O </li></ol></li><li> Waschschritte (membrane Bruch nur) <ol><li> 5 mal in 200 ul 1x Waschpuffer + 0.1% DDM waschen. </li><li> In 200 ul 1x Waschpuffer + 0,05% DDM waschen 2 mal. </li><li> Einmal in 200 ul 1x Waschpuffer + 0,025% DDM waschen. </li><li> Einmal in 200 ul 1x Waschpuffer + 0,0125% DDM waschen. </li><li> 3 Mal Waschen in 200 ul 100 mM ABC (Ammoniumbicarbonat, NH 4 CO 3) + 2 M Harnstoff. </li></ol></li></ol> 7. MS Probenvorbereitung <ol><li> Resuspendieren der Beads (direkt im Deckel) in 20 ul 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M Harnstoff für die Membranfraktion) und Überführung in 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Nur Membranfraktion: Inkubation bei 60 ° C für 5 min, bei 500 Upm Schütteln. </li><li> In 0,5 ul 200 mM TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) und Inkubation bei 60 ° C für 1 h, bei 500 Upm schüttelnd. Abkühlen auf 25 ° C. </li><li> In 0,5 ul frisch hergestelltes 400 mM Iodacetamid und Inkubation bei 25 ° C für 30 min, Schütteln einT 500 Umdrehungen pro Minute und in der Dunkelheit. </li><li> Mit 0,5 ul 0,5 M N-Acetyl-Cystein und Inkubieren bei 25 ° C für 10 min, bei 500 Upm Schütteln. </li><li> Nur Membranfraktion: fügen 1 ul Lys-C und bei 37 ° C, O / N. </li><li> In 2 ug Trypsin und Inkubation O / N bei 37 ° C, bei 500 Upm (wrap in Parafilm Austrocknen zu verhindern) Schütteln. HINWEIS: Die Proben können bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert. HINWEIS: Membranfraktion nur: mit 100 mM ABC, um die Harnstoffkonzentration auf &lt;2 M vor der Zugabe von Trypsin anpassen. </li><li> Kurz Spin-Down der Rohre und sammeln Kügelchen mit dem Magneten. </li><li> Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen (wiederholen Sie diesen Schritt, wenn Perlen gelassen werden). </li><li> Mit 5 &amp; mgr; l 5% TFA (Trifluoressigsäure) + 1 &amp; mgr; l 2 M HCl (15 &amp; mgr; l 5% TFA + 5 &amp; mgr; l 2 M HCl für die Membranfraktion). </li><li> Bedingung C18 Microspin-Säulen (The Nest Group, MA, USA) mit 150 &amp; mgr; l Acetonitril (spin 20 sec bei 2400 rpm). </li><li> Equilibrate der C18-Säulen 2 mal mit 150 ul 0,1% TFA (Spin 20 Sekunden, 2400 rpm). </li><li> Laden Sie die Probe und Spin 2 min, 2000 Upm. </li><li> Neuladen des Durchfluss auf die Säule und wiederholen den Spinnschritt (2 min, 2.000 rpm). </li><li> 3x waschen mit 150 ul 0,1% TFA, 5% Acetonitril (20 sec, 2.400 rpm). </li><li> Nehmen Sie eine neue Röhre und eluieren zweimal mit 150 ul 0,1% TFA, 50% Acetonitril (2 min, 2.000 rpm). </li><li> Man trocknet die Peptide in einer Speed-vac. </li><li> Resuspendieren in 40 &amp; mgr; l 98% H 2 O, 2% Acetonitril, 0,15% Ameisensäure. </li><li> Ultraschallbehandlung 20 s (Impulszyklus 0,5, Amplitude 100%, siehe Materialliste) und Spin-down 5 s, 12.000 min (Tischzentrifuge). Vortex 10 Sekunden, und Spin-down 5 s, 12.000 min. Übertragen Sie in einem HPLC-Ampulle für LC-MS / MS-Analyse. </li><li> Bei -20 ° C. HINWEIS: Die Proben können bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert. </li></ol> 8. LC-MS / MS-Analyse <ol><li> Führen Sie einen Nano-LC (nano-LC-Systeme) equipped mit einer RP-HPLC-Säule (75 um x 37 cm) mit C18 Harz gepackt (Magic C18 AQ 3 &amp; mgr; m) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 95% Lösungsmittel A (0,15% Ameisensäure, 2% Acetonitril) und 5% Lösungsmittel B ( 98% Acetonitril, 0,15% Ameisensäure) bis 35% Lösungsmittel B über 60 min bei einer Flussrate von 0,2 ul / min. </li><li> Analyse der Peptide mittels LC-MS / MS (Zweidruck LTQ-Orbitrap Velos Massenspektrometer, mit einem Elektrospray-Ionenquelle verbunden ist). HINWEIS: Die Datenaufnahme-Modus wurde eingestellt, um eine hochauflösende MS-Scan in der FT Teil des Massenspektrometers mit einer Auflösung von 60.000 FWHM gefolgt von MS / MS-Scans in der linearen Ionenfalle der 20 intensivsten Ionen zu erhalten. Um die Effizienz der MS / MS-Versuche zu erhöhen, wurde der Ladezustand Screening Modus aktiviert werden, damit nicht zugeordnete auszuschließen und einzeln berechnet Ionen. Collusion induzierte Dissoziation wurde ausgelöst, als der Vorläufer über 100 Ionen zählt. Die dynamische Ausschluss Dauer wurde auf 30 Sekunden eingestellt. Der Ionenakkumulationszeit auf 300 ms (MS) und 50 eingestelltms (MS / MS). </li></ol> 9. Datenbanksuche <ol><li> Laden Sie die P. aeruginosa NCBI-Datenbank über die NCBI-Homepage ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ). </li><li> Konvertieren Sie die MS Rohspektren in Maskottchen Generika-Dateien (mp) mit dem MassMatrix Konvertierungstool ( <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a> ). </li><li> Suche auf der mp-Datei mit MASCOT Version 2.3 gegen die P. aeruginosa NCBI-Datenbank, die vorwärts und rückwärts-Köder-Protein-Einträge. </li><li> Führen Sie ein in silico Trypsinverdau nach Lysin und Arginin (es sei denn, durch Prolin gefolgt) tolerieren zwei verpasst Spaltungen in voll tryptischen Peptide. </li><li> Stellen Sie die Datenbanksuchparameter, um oxidierte Methionine (15,99491 Da) als variable Änderungen und Carboxyamidomethylierung (57,021464 Da) von Cysteinresten als feste Modifikation kann. Für MASCOT sucht unsing hochauflösende Scans, stellen Sie den Vorläufer Massentoleranz bis 15 ppm und stellen Sie die Fragmentmassentoleranz von 0,6 Da. Schließlich, stellen Sie den Protein FDR auf 1%. </li><li> Importieren Sie die Maskottchen-Durchsuchungen von P. aeruginosa CCMS Experimente in Scaffold (Proteomesoftware, Version 3), stellen Sie die Parameter, um ein Protein FDR knapp 1% zu erhalten, und extrahieren Sie die gesamte spektrale zählt. </li><li> Für in diesem Papier die repräsentativen Ergebnisse präsentiert, haben wir eine gepaarte T-Test, den Versuch mit der Wettbewerbskontrolle zu vergleichen und nur dann als Treffer mit einem p-Wert von weniger als 0,1 und einer spektralen Zahlverhältnis über 2 (experimentieren spektrale counts / Wettbewerbskontrolle Spektralbereich Aktivität). </li><li> Die Daten können in jedem Tabellenkalkulations-Software zur weiteren Analyse exportiert werden. </li></ol> 10. Markierungsfreie Quantifizierung <ol><li> Importieren Sie die Raw-Dateien in Progenesis LC-MS-Software (Nichtlineare Dynamik, Version 4.0). </li><li> Führen LC-MS Ausrichtung und Feature-Erkennung in Verzug settings. </li><li> Exportieren Sie die Daten in mgf Format von Progenesis LC-MS. </li><li> Durchsuchen Sie die MS / MS-Spektren mit Hilfe des MASCOT gegen die NCBI P. aeruginosa Datenbank, die vorwärts und rückwärts-Köder-Protein-Einträge. </li><li> Importieren Sie die Datenbanksuchergebnissen in Progenesis LC-MS und Karte der Peptide Identifikationen zu MS1 Funktionen. </li><li> Für die Datenauswertung (Berechnung der Signifikanzniveaus, klappbar Änderungsverhältnisse) die ProteinSQAnalysis Skript SafeQuant verwendet (Schwelle: q-Wert unter 0,1, spektrale Zahlverhältnis über 2). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Besondere Sorgfalt sollte bei verschiedenen Stufen des Protokolls gefaßt. Die Proteinkonzentration ist ein kritischer Parameter bei einer Konzentration von 10 mg / ml, schwierig zu erreichen, wenn die Zellen unter bestimmten Wachstumsbedingungen (zB Biofilmen oder kleine Kolonie Varianten) gezüchtet. Somit sollte das Pellet resuspendiert in einem niedrigen Volumen Lysepuffer geführt werden. Proteinkonzentrationen können bis zu 8 mg / ml reduziert werden. Im Vergleich zu der durch Nespers et al. Veröffe...

c-di-GMP ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff von den meisten Bakterien verwendet, um verschiedene Aspekte des Wachstums und des Verhaltens zu steuern. Zum Beispiel regelt c-di-GMP Zellzyklusprogression, Motilität und die Expression von Exopolysacchariden und Oberflächen Adhäsine 2-4. Durch die Koordination solcher Prozesse c-di-GMP fördert Biofilmbildung, ein Verfahren, das mit einer chronischen Infektion einer Reihe von pathogenen Bakterien 5 zugeordnet ist. c-di-GMP wird durch Enzyme genannt diguanylate Cyclasen (DGCs), die eine katalytische Domäne GGDEF 4 Hafen synthetisiert. Einige DGCs besitzen eine hemmende Website, die nach unten reguliert die Cyclase-Aktivität bei der c-di-GMP verbindlich. Der Abbau von c-di-GMP wird durch zwei unterschiedliche Klassen von Phosphodiesterasen (PDEs) beherbergen entweder eine katalytische EAL oder HD-GYP Domain 6,7 katalysiert. Die Mehrzahl der bekannten Effektorproteine, die direkt binden c-di-GMP gehören zu einer von drei Klassen von Proteinen: katalytischeVerbündeter inaktiv GGDEF oder EAL Domains und PilZ Domains, kleine molekulare Schalter, die Konformationsänderungen bei der c-di-GMP verbindlich 8 unterzogen werden. DGCs, PDEs und PilZ Proteine ​​sind gut gekennzeichnet und ihre Domains können in silico relativ sicher vorhergesagt werden. Ein besonderes Interesse gilt nun auf der Identifizierung von neuen Klassen von c-di-GMP Effektoren konzentriert. Einige c-di-GMP Effektoren mit unterschiedlichen Bindungsmotiven wurden kürzlich beschrieben, wie die CRP / FNR-Protein-Familie Bcam1349 in Burkholderia cenocepacia oder der Transkriptionsregulator FleQ in P. aeruginosa 9,10. Zusätzlich wurden c-di-GMP-spezifische RNA-Schalter kürzlich identifiziert und gezeigt, um die Genexpression in einer c-di-GMP-abhängige Weise 11 steuern. Die c-di-GMP-Bindungsmotive von verschiedenen Effektoren nur schlecht konserviert machen bioinformatischen Vorhersagen solcher Proteine ​​schwierig. Um dieses Problem anzugehen, ein biochemisches Verfahren, das auf der Verwendung eines c-di-GMP spe basiert entwickelten wirsche Erfassung Verbindung mit der Massenspektrometrie 1,12,13 kombiniert. Wir haben vor kurzem entwickelt, eine neuartige dreiwertigen c-di-GMP-Capture Verbindung (CDG-CC, Abbildung 1) 1. Diese chemischen Gerüst besteht aus: 1) als Köder, um c-di-GMP erfassen bindenden Proteinen verwendet eine c-di-GMP-Einheit, 2) eine UV-photoaktivierbare reaktive Gruppe verwendet werden, um vernetzen CDG-CC zu den gebundenen Proteine ​​und 3) einem Biotin, um die aufgenommenen Proteine ​​unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen zu isolieren. Die CDG-CC kann verwendet werden, um direkt und spezifisch einzufangen c-di-GMP-Effektoren aus komplexen Mischung von Makromolekülen, wie Zell-Lysaten. Capture-Verbindung auf der Basis chemischer und Proteomik Ansätze wurde bereits berichtet Anwendbarkeit auf einen breiten Bereich von Organismen, wie zB Caulobacter crescentus, Salmonella enterica Serovar typhimurium und S. aeruginosa 1,14. In diesem methodischen Papier,bieten wir eine eingehende Beschreibung des CCMS Verfahren unter Verwendung von Extrakten von P. aeruginosa als ein Beispiel. Diese Studie stellt CCMS als eine leistungsfähige und vielseitiges Werkzeug, um biochemisch identifiziert neue Komponenten in kleinen Molekülen Signalgebung beteiligt.

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>UV-Lampen gekoppelt an einen kühlenden 96-Platten-Kühlblock, für die Photoaktivierung</td></tr><tr><td>caproMag</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>im CCMS Starter Kit enthalten</td><td>Für die einfache Handhabung von magnetischen Partikeln ohne Pipettieren</td></tr><tr><td>c-di-GMP</td><td>caproKit caprotec bioanalytics</td><td>auf Anfrage</td><td>Das Kit enthält die c-di-GMP-Capture-Verbindung, c-di-GMP (für die Wettbewerbskontrolle), Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen, Capture-Puffer und Waschpuffer</td></tr><tr><td>Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Streifen für 12 Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v Ultraschallgerät mit VialTweeter</td>, <td>Hielscher Ultraschalltechnologie</td><td>UIS250v und VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>Miniatur Französische Druckzelle</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

capture compound mass spectrometry - ein leistungsfähiges tool zum identifizieren novel c-di-gmp effektorproteinen

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Beachtliche Fortschritte wurden im letzten Jahrzehnt auf die Identifizierung und Charakterisierung von Enzymen bei der Synthese (diguanylate Cyclasen) und Abbau (Phosphodiesterasen) beteiligt der second messenger c-di-GMP hergestellt. Im Gegensatz dazu ist wenig Information über die molekularen Mechanismen und Zellkomponenten durch die dieses Signalmoleküls reguliert eine Vielfalt von zellulären Prozessen. Die meisten der bekannten Effektor-Proteine ​​gehören zur Familie PilZ oder degeneriert diguanylate Cyclasen oder Phosphodiesterasen, die sich auf die Katalyse gegeben haben und Effektor-Funktion übernommen. So, um besser die zelluläre c-di-GMP-Netzwerk in einem weiten Bereich von Bakterien experimentelle Methodik zur Identifizierung und Validierung von neuartigen Effektoren für die zuverlässige in silico Vorhersage nicht definieren. Wir haben vor kurzem eine neuartige Erfassung Verbindung Massenspektrometrie (CCMS) basierte Technologie als ein mächtiges Werkzeug, umbiochemisch zu identifizieren und zu charakterisieren, c-di-GMP-bindende Proteine. Diese Technik wurde bereits berichtet anwendbar auf einen weiten Bereich von Organismen 1 sein. Hier geben wir eine ausführliche Beschreibung des Protokolls, die wir verwenden, um solche Signalkomponenten zu untersuchen. Als ein Beispiel verwenden wir P. aeruginosa, ein opportunistisches Pathogen in dem c-di-GMP spielt eine kritische Rolle bei der Virulenz und Biofilmkontrolle. CCMS identifizierten 74% (38/51) der bekannten oder vorhergesagten Komponenten des c-di-GMP-Netzwerk. Diese Studie erklärt die CCMS-Verfahren im Detail und stellt es als ein leistungsfähiges und vielseitiges Werkzeug, um neue Komponenten in kleinen Molekülen Signalisierung beteiligt sind.

Um neue c-di-GMP-Effektoren in P. identifizieren aeruginosa wir systematisch genutzt CCMS die löslichen und Membranfraktionen P. analysieren aeruginosa Stamm PAO1 aus einer log-Phase Kultur (OD 600 = 0,5). Hier werden wir zusammenfassen und diskutieren Vertreter Ergebnisse dieser Angelausflug. Vier unabhängige biologischen Replikate wurden verwendet. Für jeden Versuch zwei verschiedenen CDG-CC-Konzentrationen wurden verwendet (5 uM und 10 uM). Um die Spezifität zu untersuch...

Der allgegenwärtige Botenstoff c-di-GMP steuert das Wachstum und Verhalten vieler Bakterien. Wir haben eine neuartige, auf der Capture Compound-Massenspektrometrie basierende Technologie entwickelt, um c-di-GMP-bindende Proteine in praktisch jeder Bakterienspezies biochemisch zu identifizieren und zu charakterisieren.

Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Das übergeordnete Ziel des Massenspektrometrie-Experiments ist es, zyklische GMP-bindende Proteine zu erfassen und zu identifizieren. Dies wird durch Fraktionierung, eine Zellkultur durch French Press und Entfernen der freien zyklischen Düse GMP erreicht. Unter Verwendung einer PD 10-Säule als zweiten Schritt wird die Capture-Verbindung hinzugefügt und durch UV-Licht aktiviert, um die zyklischen Die-GMP-bindenden Proteine, die an die Capture-Verbindung gebunden sind, entweder in Abwesenheit oder in Anwesenheit eines Überschusses an freiem zyklischem die-GMP kovalent zu vernetzen.Als nächstes wird die Einfangverbindung an Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen gebunden, um die eingefangenen Proteine intensiv zu waschen. Schließlich werden die eingefangenen Proteine verdaut und für die Massenspektrometrie vorbereitet, um die erzeugten Peptide zu identifizieren. Die Ergebnisse werden dann in silico analysiert. Der Hauptvorteil des CCMS gegenüber unseren bestehenden Methoden wie der Co-Fällung besteht darin, dass die Abscheidungsverbindung die spezifische Abscheidung von direkten Partnern verbessert und dank der kovalenten Kostenkopplung raue Waschbedingungen ermöglicht.Nun kann diese Methode Einblicke in die bakterielle zyklische Di-GMP-Signalgebung geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Nukleotidsignalisierung im Allgemeinen und praktisch jedes Molekül, das mit der Einfangverbindung befeuert wird. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie p Aerogenzellen vor und lysieren Sie sie durch eine französische Druckzelle ultraultrazentrifugieren Sie das Zelllysat bei 100.000 Mal G für eine Stunde bei vier Grad Celsius.Nach dem Aufbewahren des Überstands wird das Pellet mit einem Milliliter eines x Lysepuffers gewaschen, indem es nach der Ultrazentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor auf und ab pipettiert. Frieren Sie das Pellet in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die gefrorene Probe dann bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die Erfassung von Membranproteinen verwendet wird. Nach dieser Spülung wird eine PD 10 Entsalzungskolonne mit 10 Millilitern Kaltlysepuffer gewaschen.Gießen Sie das Supra natant auf das PD 10, um Nukleotide zu entfernen, und eluieren Sie dann mit vier Millilitern Kaltlysepuffer in 500-Mikroliter-Schritten. Verwenden Sie den Bradford-Assay, um die am stärksten konzentrierten Fraktionen zu bestimmen. Anschließend werden die ausgewählten Fraktionen in einem 1,5 Milliliter Röhrchen-Resus zusammengefasst.Suspendieren Sie das zuvor gelagerte Pellet in 500 bis 1000 Mikrolitern eines x Capture-Puffers ohne Reinigungsmittel. Geben Sie eine Lösung von 1 Gew.-% pro Volumen Beta D Multipurin zur Probe beiseite. Inkubieren Sie die Probe anschließend mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad.Wenn Sie fertig sind, ultrazentrifugieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 100.000 G bei vier Grad Celsius. Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Mischen Sie zu diesem Zeitpunkt 300 Mikrogramm Protein mit einem Millimolar G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P und 20 Mikrolitern fünf x Capture-Puffer.Stellen Sie das Reaktionsvolumen mit Wasser auf 100 Mikroliter ein. Nachdem Sie die Probe bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubiert haben, fügen Sie 10 Mikromolare der zyklischen GMP-Auffangverbindung hinzu. Dann inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius für mindestens zwei Stunden für die lösliche Fraktion oder über Nacht für die Membranfraktion auf einem rotierenden Rad im Dunkeln.Nach kurzem Schleudern und Entfernen des Deckels durch Aktivierung des reaktiven Anteils der zyklischen Die GMP-Capture-Verbindung mit UV-Licht für vier Minuten unter Verwendung einer Kappenreihenbox vernetzen. Anschließend werden 25 Mikroliter fünf x Waschpuffer und 50 Mikroliter gut resuspendiertes Streptokokken-AVID in magnetische Beads gegeben. Homogenisieren Sie die Probe vorsichtig.Anschließend wird die Probe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubiert. Nachdem Sie die Kügelchen mit einem Magneten im Deckel eingefangen haben, waschen Sie die löslichen Fraktionen sechsmal in 200 Mikrolitern eines X Waschpuffers, nachdem Sie einmal in 200 Mikrolitern Wasser in HPLC-Qualität, sechsmal in 200 Mikrolitern 80 % Acetonitril und zweimal in 200 Mikrolitern Wasser in HPLC-Qualität gewaschen haben, waschen Sie die Membranfraktion fünfmal in 200 Mikrolitern eines X Waschpuffers und verringern Sie die Konzentrationen des Endablaufs Beta D multi purin beiseite. Als nächstes resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat für die lösliche Fraktion und 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat plus acht molaren Harnstoff.Für die Membranfraktion werden die einzelnen Suspensionen in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Nach der Inkubation der Membranfraktion werden 0,5 Mikroliter 200 millimolare Tris hinzugefügt. Zwei Carboxyethylphosphin zu beiden Fraktionen und inkubieren eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius unter Schütteln bei 500 U/min.Sobald die Proben auf 25 Grad Celsius abgekühlt sind, werden nach der Inkubation im Dunkeln 0,5 Mikroliter frisch zubereitetes 400 Millimolar Ito Acetamid zugegeben. Fügen Sie 0,5 Mikroliter 0,5 molar und Acetylcystein zu jeder Fraktion hinzu. Anschließend werden die Proben 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius unter Schütteln bei 500 U/min inkubiert.Zu diesem Zeitpunkt fügen Sie der Membranfraktion nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius einen Mikroliter LY C hinzu. Geben Sie zwei Mikrogramm Trypsin zu jeder Probe und wickeln Sie sie in Paraform ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Nach dem Inkubieren und Schleudern der Proben wird der Überstand mit Hilfe des Magneten in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt, um ein Einsammeln der Kügelchen zu vermeiden.Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter 5%ige Trichloressigsäure und einen Mikroliter zweimolare Salzsäure zur löslichen Fraktion hinzu, fügen Sie 15 Mikroliter 5%ige Trichloressigsäure und fünf Mikroliter zweimolare Salzsäure zur Membranfraktionsbedingung hinzu. C 18 Mikrospinsäulen mit 150 Mikrolitern Acetonitril durch 20 Sekunden Schleudern bei 2.400 U/min. Nachdem die Säulen zweimal mit 150 Mikrolitern 0,1 %iger Trifluoressigsäure äquilibriert wurden, laden Sie die Probe und drehen Sie sie zwei Minuten lang.Bei 2000 U/min wird der Durchfluss wieder auf die Säulen geladen. Nachdem Sie das Schleudern wiederholt und die Säulen mit 0,1 Trifluoressigsäure und Acetonitril gewaschen haben, nehmen Sie ein neues Röhrchen und eluieren Sie zweimal mit 150 Mikrolitern 0,1 % Trifluoressigsäure und 50 % Acetonitril. Nachdem die Peptide in einem Speed Vac Resus getrocknet wurden, resuspendieren Sie sie in 40 Mikrolitern 98 % Wasser, 2 % Acetylnitril und 0,15 % Ameisensäure.Nachdem die Proben 20 Sekunden lang beschallt wurden, drehen Sie sie fünf Sekunden lang bei 12.000 U/min herunter. Nach dem Vortexen und Schleudern werden die Proben für die lc MS MS-Analyse in HPLC-Fläschchen überführt. Die anfängliche Trefferliste aus einer P-Aerogen-Log-Phasenkultur umfasst 768 lösliche Fraktionsproteine und 433 Membranfraktionsproteine. Nach der Entfernung unspezifisch eingefangener Proteine wurde die Liste auf 76 lösliche Frakturproteine und 133 Membranfraktionsproteine reduziert. Dazu gehörten 13 lösliche und 21 Membranproteine aus dem P-Aerogen, von denen bekannt ist oder von denen bekannt ist oder vorhergesagt wird, dass sie zyklische Farbstoffe binden. GMP.Die anderen 63 löslichen und 112 Membranproteine sind neue mutmaßliche zyklische Matrizen. GMP-bindende Proteine, die keine der bekannten zyklischen GMP-Bindungsdomänen enthalten. CCMS mit Zellextrakten, die unter verschiedenen Wachstumsbedingungen und mit verschiedenen intrazellulären zyklischen Matrizen gewonnen wurden.Es wurden auch GMP-Konzentrationen verwendet. Insgesamt wurden 74 % der bekannten oder vorhergesagten p Aerogen-, PO one cyclic die- und GMP-Signalkomponenten eingefangen. Angesichts der Tatsache, dass gezeigt wurde, dass mindestens neun dieser Gene unter bestimmten Bedingungen transkribiert werden konnten und dass einige möglicherweise überhaupt nicht an zyklischen Sterben, GMP, binden, könnte dieser Grad der Abdeckung nahe der Sättigung liegen.Dies, gepaart mit der Beobachtung, dass die meisten dieser Komponenten mit hoher Spezifität erfasst wurden, spricht dafür, dass diese Technik effektiv und leistungsstark ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Auswahl der potenten Kandidaten durch den Vergleich der Capture-Spezifität bekannter psychischer DGP-Effektoren erreicht wird. Nach diesem Verfahren können Methoden wie Drac, ubi, Crosslinking, Differentialscanning, Fluorometrie-Mikros oder isotherme Telemetrie durchgeführt werden, um eine spezifische Bindung der Kandidaten an den Zyklus dieses GMP zu validieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

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Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound...

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Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine ​​liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.

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Eine verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP-Verfahren zur Genotypisierung Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie beschrieben. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith Säule wird zur Trennung verdaut Amplikons eingesetzt. Dieses Verfahren kann die monoisotopisch Massen von Oligonukleotiden aufzuklären, die zur Identifizierung Basenzusammensetzung nützlich ist.

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Sample-Multiplexing-Strategie, die in der Lage ist, die Anzahl der Proben zu erhöhen, die gleichzeitig mit verfügbaren isobarischen Tags analysiert werden können. Die Integration einer Roboterplattform hat den experimentellen Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit erheblich erhöht.

Automatisiertes Sample-Multiplexing mit kombinierter Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobaischer Kennzeichnung (cPILOT)

Erfahren Sie, wie Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) zur Identifizierung von zyklischen di-GMP-Bindungsproteinen in Bakterien eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht spezifische Proteinbindung und rigorose Waschbedingungen durch kovalente Vernetzung.

Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

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