Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genexpressionsniveaus einzelner humaner embryonaler Stammzellen unter Verwendung der quantitativen Einzelzell-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (R-T-P-C-R) zu profilieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung verwendet wird, um einzelne Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu sortieren, die Zelllysepuffer enthält. Der zweite Schritt besteht darin, RNA umzukehren, um CDNA aus Einzelzelllysaten zu generieren.

Als nächstes wird das CDNA durch Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Der letzte Schritt besteht darin, quantitative R-T-P-C-R auf dem amplifizierten CDNA durchzuführen. Letztendlich ist dieser Assay nützlich für die Untersuchung der Genexpression in heterogenen Populationen, wie z. B. menschlichen embryonalen Stammzellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden einzelzelligen quantitativen künstlichen Gefäßen besteht darin, dass diese Methode, EEG und robuster vor der Faxreinigung ist. Das OCT enthält vier EGFP-humane embryonale Stammzellen oder Hess, die von der 60-Millimeter-Schale abgetrennt werden. Entfernen Sie das gesamte Medium, fügen Sie einen Milliliter Accutane hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Accutane wird mit einer Milliliter humaner ES-Medienzentrifuge neutralisiert, um die Zellen nach dem Verwerfen des Überstands zu pelletieren, die Zellen in Faxpuffer zu resuspendieren und die Konzentration auf eins mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter einzustellen. Führen Sie anschließend die Zellprobe durch ein 35-Mikrometer-Zellensiebkappenröhrchen. Lagern Sie das Röhrchen vor der Zellsortierung auf Eis.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen Mastermix vorbereiten, der einen Mikroliter einzelliges D, Ns, ein und neun Mikroliter einzellige Lyselösung enthält. Übertragen Sie für jede Vertiefung 10 Mikroliter der Mischlösung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte für das Faxanalyseprogramm, den Zellsortierer, um einzelne EGFP-positive Zellen nach der Zellsortierung in die Vertiefungen der 96-Well-PCR-Platte zu sortieren, und inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur für die Zelllyse. Um die Lysereaktion zu stoppen, fügen Sie einen Mikroliter Stopplösung hinzu und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Um dieses Verfahren zu starten, geben Sie zunächst in jede Vertiefung der 96-Well-Platte ein 0,5-Mikroliter-Eloqua mit 20 mikromolaren SMAT 15- und SMAA-Primern. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 80 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Mikroliter mit fünf x Puffer, zwei Mikroliter DTT, einen Mikroliter reverse Transkriptase und einen Mikroliter D und tps hinzu.

Führen Sie jeweils eine reverse Transkription in einem Thermocycler durch. Stellen Sie das Thermalprogramm für 90 Minuten auf 42 Grad Celsius ein, gefolgt von 85 Grad Celsius für fünf Minuten. Um die reverse Transkriptase nach Abschluss der reversen Transkription zu inaktivieren, geben Sie vier Mikroliter Exo-Reagenz zu jeder CDNA-Probe, inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um überschüssige Oligonukleotidgleiter zu verdauen, gefolgt von 80 Grad Celsius für 15 Minuten.

Um das Exo-Reagenz zu inaktivieren, bereiten Sie den PCR-Reaktionsmix mit zwei Nanomolaren des SMAP-Primers vor. Fügen Sie 10 Mikroliter des PCR-Reaktionsgemisches hinzu. Zu jeder rückseitig transkribierten Probe.

Führen Sie die Amplifikation, bestehend aus 20 Denaturierungszyklen, einem Knien und einer Verlängerung, nach der Amplifikation der Proben durch, führen Sie zwei Sätze quantitativer R-T-P-C-R-Reaktionen in getrennten Platten zur Bestätigung der R-T-P-C-R-Ergebnisse in jede Vertiefung der 2 96 Vertiefungsplatten und fügen Sie 10 Mikroliter von zwei x Cybergrün hinzu. PCR-Mastermix: ein Mikroliter amplifiziertes CDNA, zwei Primer und sieben Mikroliter Wasser. Stellen Sie das Programm für drei Sekunden auf 95 Grad Celsius ein, gefolgt von 60 Grad Celsius für 30 Sekunden.

Für 40 Zyklen wird die kniende Stufe entfernt, um den Fehler der Grundierung zu reduzieren. In dieser Studie wurden Mikrogrammmengen der Gesamt-RNA von Hess auf Nano- und Pikogramm-Niveau verdünnt, um die technische Variabilität zu beurteilen und den Nachweis von Unterschieden bei geringen Mengen der quantitativen R-T-P-C-R der Gesamt-RNA des G-A-P-D-H-Gens mittels MR zu bewerten. NA von gepoolten Schalen, die seriell von 10 Nanogramm pro Mikroliter auf 0,1 Pikogramm pro Mikroliter verdünnt werden. Jeder Punkt zeigt den CT-Wert von seriell verdünnter mRNA und einzelliger mRNA sortiert per Fax.

Es wurde eine Korrelation zwischen jeder Probe und den QR-TPCR-Ergebnissen beobachtet, wobei mehrere Einzelzellen ähnliche CT-Werte zeigten. Per Fax wurden starke EEG-FP-positive Zellen aus einer HESC-Leitung mit OCT vier EGFP-Reportern sortiert und ausgewählt. Die Ergebnisse zeigen eine EGFP-positive Population von etwa 60% im Vergleich zur negativen Population, um die Konsistenz zwischen verschiedenen Chargen von reversen Transkriptions- und Amplifikationsreaktionen zu validieren.

Faxgereinigte Einzelzelllysate wurden in zwei Hälften geteilt und das Protokoll für Chargenvergleiche auf jede Hälfte angewendet. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen dem CT-Wert von OCT vier jeder Hälfte der Einzelzelllysate beobachtet. Eine Heatmap-Präsentation der Genexpression einzelner Schalen zeigt ein konsistentes und robustes Niveau der OCT-4-Expression, aber unterschiedliche Niveaus eines anderen Stammzellmarkergens, NAN og. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser Einzelzell-Genexpressionsassay für die Untersuchung von Populationsheterogenitäten pluripotenter Stammzellen nützlich ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das QITP für Einzelzelltranskriptome richtig durchführen.