Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genexpressionsniveaus einzelner menschlicher embryonaler Stammzellen mittels quantitativer Einzelzell-Rücktranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion, oder R-T-P-C-R, zu bestimmen. Dies wird zunächst erreicht, indem fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren eingesetzt wird, um einzelne Zellen in jedes Loch einer 96-Loch-Platte mit Zelllysepuffer zu sortieren. Der zweite Schritt besteht darin, die RNA rückzutranskribieren, um CDNA aus lysierten Einzelzellen zu erzeugen.

Anschließend wird die cDNA mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Der letzte Schritt besteht darin, eine quantitative RT-PCR an der amplifizierten cDNA durchzuführen. Letztendlich eignet sich dieses Assay zur Untersuchung der Genexpression in heterogenen Populationen wie menschlichen embryonalen Stammzellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden quantitativen Einzelzell-Methoden mit künstlichem Gefäß besteht darin, dass diese Methode EEG-basiert ist und robuster ist als die vorherige FACS-Reinigung. Die OCT4-EGFP-markierten humanen embryonalen Stammzellen oder Hess-Zellen werden von der 60-Millimeter-Schale abgelöst. Entfernen Sie das gesamte Medium, geben Sie ein Milliliter Accutase hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Neutralisieren Sie Accutane mit einem Milliliter humanen ES-Medien. Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren, nachdem Sie den Überstand verworfen haben. Resuspendieren Sie die Zellen in Fax-Puffer und stellen Sie die Konzentration auf eine mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter ein. Danach lassen Sie die Zellprobe durch ein 35-Mikrometer-Zellsieb in einer Kapillare laufen. Lagern Sie die Röhre vor der Zellsortierung auf Eis.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung einer Master-Mix-Lösung, die einen Mikroliter Einzelzell-DNS1 und neun Mikroliter Einzelzell-Lyse-Lösung enthält. Übertragen Sie für jedes Loch 10 Mikroliter der Mischlösung in jedes Loch einer 96-Loch-PCR-Platte für das Fax-Analyseprogramm, der Zellsortierer sortiert dann EGFP-positive Einzelzellen in die Löcher der 96-Loch-PCR-Platte. Nach dem Zellsortieren inkubieren Sie die Proben fünf Minuten bei Raumtemperatur zur Zelllyse. Um die Lyse-Reaktion zu stoppen, geben Sie einen Mikroliter Stop-Lösung hinzu und inkubieren zwei Minuten bei Raumtemperatur.

Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie zunächst in jedes Loch der 96-Loch-Platte 0,5 Mikroliter Eloqua von 20 Mikromolar SMAT 15- und SMAA-Primern. Erhitzen Sie die Proben bei 80 Grad Celsius für fünf Minuten. Geben Sie dann vier Mikroliter 5x-Puffer, zwei Mikroliter DTT, ein Mikroliter Reverse Transkriptase und ein Mikroliter D und tps hinzu.

Führen Sie in jedem Well die Reverse Transkription in einem Thermocycler durch. Stellen Sie das thermische Programm auf 42 Grad Celsius für 90 Minuten ein, gefolgt von 85 Grad Celsius für fünf Minuten. Um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren, sobald die Reverse Transkription abgeschlossen ist, geben Sie vier Mikroliter Exo-Reagenz zu jeder cDNA-Probe hinzu, inkubieren bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um überschüssige Oligonukleotide abzubauen, gefolgt von 80 Grad Celsius für 15 Minuten.

Um das Exo-Reagenz zu inaktivieren, bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung mit zwei Nanomolar des SMAP2-Primers vor. Geben Sie 10 Mikroliter der PCR-Reaktionsmischung zu jeder revers transkribierten Probe hinzu.

Führen Sie die Amplifikation durch, die aus 20 Zyklen der Denaturierung, einer Annealing- und einer Verlängerungsphase besteht. Nach der Amplifikation der Proben wurden zwei Sätze quantitativer RT-PCR-Reaktionen in separaten Platten durchgeführt, um die RT-PCR-Ergebnisse zu bestätigen. Geben Sie in jedes Loch der beiden 96-Loch-Platten jeweils 10 Mikroliter 2x Cyber Green PCR-Mastermix, 1 Mikroliter amplifizierte cDNA, zwei Primer und 7 Mikroliter Wasser. Stellen Sie das Programm auf 95 Grad Celsius für drei Sekunden ein, gefolgt von 60 Grad Celsius für 30 Sekunden.

Für 40 Zyklen wird ein Kniebeuge-Schritt entfernt, um den Primer-Fehler zu verringern. In dieser Studie wurden Mikrogramm-Mengen an Gesamt-RNA von Hess auf Nano- und Pikogramm-Stufen verdünnt, um die technische Variabilität sowie die Detektion von Unterschieden bei geringen Mengen an Gesamt-RNA zu bewerten. Quantitative RT-PCR des G-A-P-D-H-Gens wurde unter Verwendung von MR.NA aus gepoolten Hülsen durchgeführt, die seriell von 10 Nanogramm pro Mikroliter bis auf 0,1 Pikogramm pro Mikroliter verdünnt wurden. Jeder Punkt zeigt den CT-Wert der seriell verdünnten mRNA sowie der Einzelzell-mRNA, die per FACS sortiert wurde.

Es wurde eine Korrelation zwischen jeder Probe und den QR-PCR-Ergebnissen beobachtet, wobei mehrere Einzelzellen ähnliche CT-Werte zeigten. Mithilfe von FACS wurden starke EEG-FP-positive Zellen aus einer OCT4-EGFP-Reporter-hESC-Linie sortiert und ausgewählt. Die Ergebnisse zeigen eine EGFP-positive Population von etwa 60 % im Vergleich zur negativen Population, um die Konsistenz zwischen verschiedenen Ansätzen von reverser Transkription und Amplifikationsreaktionen zu validieren.

Die gereinigten Einzelzell-Lysate wurden halbiert, und das Protokoll auf jede Hälfte angewandt, um Batch-Vergleiche durchzuführen. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen den OCT4-CT-Werten der jeweiligen Hälften der Einzelzell-Lysate beobachtet. Eine Darstellung der Genexpression in einzelnen Zellen als Wärmekarte zeigt ein konsistentes und robustes Niveau der OCT4-Expression, jedoch variable Werte eines weiteren Stammzell-Marker-Gens, NANOG. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser Genexpressions-Test an Einzelzellen nützlich ist, um Populationsheterogenitäten von pluripotenten Stammzellen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der QITP korrekt für das Transkriptom einzelner Zellen durchgeführt wird.