Name: Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Lernen Sie die Flusskammer-Adhäsionsassay zur Quantifizierung der Neutrophilenadhäsion unter Scherstress an Endothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Varianten bei Autoimmunerkrankungen.

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Diese Arbeit wird von der Lupus Research Institute (New York, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 und NIH UL1-TR00165 gesponsert. Wir danken Dr. Robert P. Kimberly für seine fortwährende Unterstützung.

Alle Spender für diese Studie rekrutiert gab schriftliche Einwilligung und die Studie wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Review Board genehmigt. 1. HUVEC Erste, Kultur und Subkultur <ol><li> Kultur menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) in vitro in komplettem Wachstumsmedium, das von Endothelzellen Grundmedium besteht (siehe Liste der Materialien) mit einer endothelialen Zellwachstumsfaktoren ergänzt. Anmerkung: Die Wachstumsfaktoren, die in dieser Studie verwendet werden, umfassen: 5 ng / ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (hEGF), 1,0 mg / ml Hydrocortison, 50 mg / ml Gentamicin und 50 ng / ml Amphotericin-B (GA-1000), 2 % fötalem Rinderserum (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), 10 ng / ml menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Basis mit Heparin (hFGF-B), 20 ng / ml menschlichem rekombinantem Insulin-like Growth Factor ( R 3-IGF-1), 1 &amp;mgr; g / ml Ascorbinsäure und 22,5 ug / ml Heparin. Das Komplettmediumzunächst bei 37 ° C hergestellt und dann bei 4 ° C für die Verwendung innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung gelagert werden. </li><li> In einen Kolben für Zellen herzustellen, wird komplettem Wachstumsmedium auf eine 75 cm 2-Gewebekulturkolben (1 ml / 5 cm 2) und dann der Kolben lässt man auf 37 ° C / 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator für äquilibrieren hinzugefügt mindestens 30 min. Menschliche HUVEC direkt in diesem äquilibriert Kulturkolben in einer Dichte von 2.500-5.000 Zellen / cm 2 ausgesät werden. </li><li> Während die Medien ausgleich, schnell auftauen Lager HUVEC Kryoröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad. Dispergieren der Zellen in der ursprünglichen Speicherfläschchen durch Vortexen und fügen sie direkt zu dem Kulturkolben mit dem voräquilibriert HUVEC komplettem Wachstumsmedium, um eine Dichte von 2.500-5.000 Zellen / cm 2 zu erreichen. Die Flasche vorsichtig rocken gleichmäßig zu verteilen und die Zellen dann die Flasche zurück in den Inkubator. Diese Zellen stellen nun die 1. Durchgang. </li> &lt;li&gt; Medium sollte alle zwei Tage gewechselt werden, bis die Zellen 70-80% konfluent. </li><li> Die HUVECs kann nun aus der Kulturflasche mit Trypsin / EDTA geerntet werden. Das Kulturmedium wird aus den Kulturkolben, gefolgt von einer PBS spülen, um restliches Eiweiß und Kalzium aus den Zellen zu entfernen abgesaugt. A 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zugegeben und innerhalb von 2-6 min Zellablösung sollte klar sein, wie durch Lichtmikroskopie untersucht. </li><li> Wenn 90% der Zellen werden von der Platte abgerundet, stoppen Sie die Trypsinierung durch Zugabe eines gleichen Volumens 2x Trypsin-Inhibitor. Um die Ernte der Zellen zu erleichtern, fügen Sie eine weitere gleiche Menge an vollständige Wachstumsmedium. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Die abgelösten Zellen zentrifugiert bei 225 g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und dann Resuspendieren der Zellen in 2-3 ml Vollwachstumsmedium. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit mit einem Hämazytometer und Trypanblau. </li><li> Um th nutzenE geernteten Zellen für Studium, wieder Samen zusätzliche 75 cm 2-Kolben mit Zellen in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 und gehen Sie zu Schritt 2.2. Alternativ können die Zellen an diesem Punkt für zukünftige Studien eingefroren werden. Für Zellgefrier Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 225 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in FBS mit 10% DMSO bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. Die Zellsuspension wird dann nach dem Einfrieren der Zellen in einem Zellgefrierbehälter zu Kryoröhrchen überführt und bei -80 ° C gelagert. </li></ol> 2. HUVEC Layer-Vorbereitung <ol><li> Verwendung von gefrorenem 2. Passage HUVECs: Wiederbelebung und Kultur. Wenn Sie aktiv wachsenden Zellen, gehen Sie zu Schritt 2.2. <ol><li> Auftauen Kryoampulle enthält 2. Passage HUVECs aus Schritt 1.8 schnell in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen Zellen aus dem Kryoröhrchen in ein 15 ml steriles Zentrifugenröhrchen und 10 ml Wachstums medium. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur und saugt den Überstand, um das restliche DMSO zu entfernen. </li><li> Zellpellet mit kompletter Wachstumsmedium und übertragen die Zellen in einer 75 cm 2-Kolben. Hinzufügen Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen etwa 20-25 ml und bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li> Optisch jeden Tag untersuchen die Zellkultur für Zusammenfluss mit Medienwechsel alle zwei Tage. Gewöhnlich versandfertig in 2-4 Tagen werden die Zellen 80-90% Konfluenz zu welcher Zeit sie bereit für den Einsatz in der Strömungskammer Assay zu erreichen. </li><li> Um die Kulturschale, die in der Flusskammer verwendet werden vorzubereiten (siehe Abschnitt 5), 1 ml von 10 ug / ml Fibronektin und 0,05% (w / v) Gelatine zu einer 35-mm-Gewebekulturschale und Pipette mehrmals, um sicher, dass die gesamte Plattenoberfläche beschichtet. Entfernen der übermäßigen Fibronektin und Gelatinelösung und der Luft trocknen die Platte mindestens 30 Minuten, um die Proteinmatrixbildung zu optimieren. Die fibronectin und Gelatine-Lösung kann bis zu 10x wiederverwendet werden. </li><li> Ernte der HUVEC-Zellen aus Schritt 2.2 unter Verwendung von Trypsin-EDTA wie in den Schritten 1.5-1.7 beschrieben. Seed 500.000 Zellen in jedes beschichtete Gewebekulturschale. 2 ml Wachstumsmedium in jeder Schale und bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Lassen Zellen zu wachsen, um, wie in Schritt 2.2 Konfluenz. Zellen sollten visuell täglich mit Mediumwechsel alle zwei Tage überprüft werden. Vor der Flusskammer-Assay, Prime die HUVEC mit 20 ng / ml TNF-α Menschen für 4-6 Stunden zu regulieren und stimulieren Adhäsionsmolekülexpression. </li></ol> 3. Gereinigtes Ligand Coating <ol><li> Zeichnen Sie einen Kreis von 0,5 cm Durchmesser mit einem Marker oder Stift in der Mitte einer 35-mm-Gewebekulturschale. </li><li> Platte 20 ul von 20 ug / ml Protein A in der markierten Fläche. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Protein zu verbreiten, eine Lösung für den gesamten Bereich innerhalb des Kreisdurchmesser 0,5 cm zu bedecken. Es ist wichtig, nicht berühren oder zerkratzen die Oberfläche der dish. Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Mit 1 ml PBS (pH 8,0) waschen die Protein-A-beschichteten Platte 3x. </li><li> Platte 50 ul 1% BSA in dem markierten Bereich zu blockieren unspezifische Bindung auf der Platte. Inkubation für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Mit 1 ml PBS, wie in Schritt 3.3 wasche die Platte 3x blockiert. </li><li> Bereiten Sie die Fc-Rezeptor-Liganden Haftung chimären Proteins Lösungen für die Beschichtung. In diesem Experiment wurde eine Chimäre ICAM-1/Fc Lösung bei 25 &amp;mgr; g / ml und eine P-Selectin/Fc Chimäre bei 0,5 ug / ml in PBS (pH 8,0) wurde verwendet. </li><li> Bestreichen Sie die markierte Fläche mit 50 ul Substrat. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Die Schale sollte innerhalb von zwei Tagen verwendet werden, und der beschichtete Bereich sollte nicht austrocknen. In PBS, wenn notwendig, die 50 ul Lösung auf der Platte zu halten. </li></ol> 4. Neutrophilen-Separation (alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt) <ol><li> Nach Einholung der Einwilligung, sammeln Teilnehmer Blut durch Aderlass in einn Antikoagulans Blutröhrchen oder Vacutainer (EDTA oder Heparin). Nach der Blutentnahme, verdünnen das Blut 1:1 mit PBS vor der Trennung. </li><li> Bereiten Sie eine Zwei-Schicht Ficoll zur Trennung von PBMC und Neutrophilen in 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Zuerst 15 ml Ficoll schwer (siehe Liste der Materialien, ρ = 1,118 bis 1,120), und dann sorgfältig Schicht 10 ml Ficoll leuchten (siehe Liste der Materialien, ρ = 1,077 bis 1,080) auf der Oberseite der schweren Ficoll. Es sollte eine scharfe Grenze zwischen dem Licht und Schwer Ficoll Ficoll Schichten sein. Anschließend vorsichtig Schicht 25 ml der verdünnten Blutprobe auf der Oberseite der Licht Ficoll, ohne die Ficoll-Schicht zu stören. </li><li> Das Röhrchen bei 250 × g für 30 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Der Zentrifugenrotorbremse sollte ausgeschaltet sein, diese Spins um mögliche Störung der Zelltrennung während der Rotorverzögerung am Ende der Zentrifugation zu minimieren. Nach der Zentrifugation werden die folgenden Schichten (von oben nach unten) vorhanden sind: die oberste Schicht ist die Plasma foldurch die PBMC-Schicht auf der Licht Ficoll-Schicht heiraten, ist die Neutrophilen-Schicht mit wenigen roten Blutkörperchen (RBC) zwischen den leichten und schweren Ficoll gefolgt von der schweren Ficoll-Schicht und Erythrozyten am Boden der Röhre. </li><li> Ernte und übertragen die Neutrophilen-Schicht in ein neues 50 ml-Röhrchen mit einem Transfer-Pipette PBS auf ein Endvolumen von 50 ml und zentrifugiert bei 225 g für 10 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Nach der Zentrifugation, kann es immer noch mit den Erythrozyten Neutrophilen gemischt sein. Saugen Sie den Überstand bis zur 10 ml-Marke. Resuspendieren des Neutrophilen-RBC Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre (oder einer kurzen niedriger Geschwindigkeit Vortex) und dann wieder waschen mit 50 ml PBS. </li></ol></li><li> Nach dem zweiten Waschen, saugen Sie den Überstand. Um die kontaminierenden Erythrozyten zu entfernen, Resuspendieren der pelletierten Zellen in der Rest PBS durch Bewegung (oder kurz Vortex), 25 ml H 2 O und sanft Wirbel für 10 Sekunden, um die RBC lysieren. <ol><li> 25 ml 1,8% NaCl und sofort mischendurch Zentrifugation bei 225 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Die verunreinigenden RBC sollte nun lysiert, wobei ein weißer neutrophilen Zellpellet werden. </li></ol></li><li> Mit PBS Waschen Sie die neutrophilen Zellpellet. </li><li> Resuspendieren der isolierten Neutrophilen in RPMI-Medium mit 10% FBS und bestimmen die Zellkonzentration unter dem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer. </li><li> Stellen Sie die Zelldichte zu 500.000 Zellen / ml mit RPMI-10% FBS-Medium. </li></ol> 5. Flusskammer Adhesion Assay <ol><li> Montieren Sie die Flusskammer. Legen Sie die 35 mm-Schale, die die konfluente HUVECs oder gereinigtes Haftung Rezeptor-Liganden auf dem Mikroskoptisch. Schließen Sie das Parallelplattenlaufkammer mit Spritzenpumpe, Vakuumsystem und lassen Sie eine Zeile offen für die Neutrophilen-Eingang. Legen Sie die Flusskammer auf der Platte und befestigen Sie die Flusskammer Anordnung 13. (Siehe Fig. 1) </li><li> Starten Sie das Video-Aufnahme-Programm auf dem Computer verbunden to das Mikroskop. Stellen Sie das Feld und Fokus des Mikroskops, bis eine klare Feld mit ausgewachsenen HUVEC Zellen oder einem Feld innerhalb der Ligand Beschichtungsbereich sichtbar ist. </li><li> Mit der Spritzenpumpe, spülen Sie die Flusskammer mit RPMI Medium. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Kammer oder der Neutrophilen-Eingabezeile. </li><li> Wenn gewünscht, können die Neutrophilen mit niedriger Dosis (10 -8 M) für 10 min fMLP grundiert werden. Dies wird für eine Anpassung der basalen Ebene der Aktivierung von Neutrophilen zwischen 14 verschiedenen Spendern zu ermöglichen. </li><li> Verwenden der Spritzenpumpe, die Neutrophilen in die Strömungskammer in definierten Geschwindigkeiten zu injizieren (eine Geschwindigkeit von 350 &amp;mgr; l / min, was einer Scherspannung von 1,5 dyn / cm 2 entspricht in dieser Studie). Nehmen Sie das Video. Da die Adhäsion von Neutrophilen kann schnell erfolgen, ist ein Video mit einer Länge von 4-5 min in der Regel ausreichend, um die Haftung Ereignissen zur Analyse quantifizieren. </li><li> Eine anhaftende Zelle als eine Zelle, die weniger als ein Zelldurchmesser bewegt definiertinnerhalb von 5 Sekunden auf der HUVEC oder Liganden-beschichteten Oberfläche 15,16. Zählen Sie die Anzahl der adhärenten Zellen in das Feld in der aufgezeichneten Videos mit dieser Regel vor. Durch die Aufnahme von Videos mit ähnlicher Länge der verschiedenen Geber Neutrophilen, kann man die adhärenten Zellen / min berechnen, um die Hafteigenschaften zwischen verschiedenen Spendern zu vergleichen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll führt die Trennung und Isolierung von minimal-aktivierten Neutrophilen für die sorgfältige Quantifizierung der neutrophilen Haftung unter schiere Stressbedingungen. Neutrophilen-Adhäsion ist ein kritischer Prozess bei der Entzündung. Da genetische Varianten in mehrere Moleküle in diesem Verfahren nachgewiesen wurden, zur Entwicklung von Autoimmunerkrankungen 1,2 prädisponieren, wird ein Assay-System in der Lage, quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen feste Haftung erforderlich. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methode ermöglicht die sorgfältige und quantitative Bestimmung der feste Klebepotenzial von Neutrophilen in einer kontrollierten Umgebung unter in vitro lauter Stress. Dieses Verfahren ermöglicht somit die direkte Vergleich von quantitativen neutrophile Adhäsion zwischen genotypisierten Individuen, die Bedeutung der genetischen Variation in Adhäsionsmoleküle 14 zu bestimmen. Mehrere Schritte in diesem Verfahren verdienen sich sorgfältig überlegen, achieve hoch quantitative und reproduzierbare Ergebnisse. In HUVEC Herstellung ist es entscheidend, zu 100% Zellen Konfluenz vor der Verwendung in der Durchflusskammer zu erreichen. Für die Verwendung mit gereinigtem Liganden beschichteten Oberflächen sollte die Substratbeschichtungsbereich nie austrocknen zu vermeiden Denaturieren des Liganden gestattet. Darüber hinaus ist die Herstellung von Human-Neutrophilen entscheidend für den Erfolg des Experiments. Zentrale Themen bei der Isolierung von Neutrophilen Blut umfassen sanft Handhabung durch Minimierung von Verwirbelung, um die Aktivierung zu vermeiden, halten die Zellen bei Raumtemperatur (dh das Blut nicht auf Eis und Zentrifugationsschritte gespeichert sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann) und der Vollendung der Isolation und das Experiment in kürzester Zeit möglich. Es gibt noch weitere Methoden, die Isolierung von Neutrophilen auch genutzt werden, um Zellen für diese Tests 17,18 vorzubereiten. Aus praktischer Sicht, Haft Tests unter Verwendung von frisch isolierten menschlichen Neutrophilen<html> sollte innerhalb von 3-6 Stunden nach der Aderlass Teilnehmer initiiert werden. Wie Neutrophile sind extrem empfindlich auf Handhabung, könnte längere Zeiten zwischen der Blutentnahme und Nutzungsuntersuchungsergebnisse beeinflussen. Sorgfältige Bestimmung der neutrophilen Zellkonzentration vor der Durchflusskammer Assay ist auch notwendig, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Während der Strömungskammer Assay ist es wichtig, die Videoaufzeichnung sorgfältig zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Strömungsgeschwindigkeit ist konstant und es gibt keine Turbulenz in der gesamten Länge des Experiments. Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit oder das Vorhandensein von Turbulenz würde erfordern, dass der Versuch wiederholt werden. Nach dem Experiment ist es auch wichtig, um die verbleibenden Neutrophilen mikroskopisch beurteilt, um sicherzustellen, dass die Neutrophilen keiner Verklumpung. Verklumpung an diesem Punkt würde bedeuten, dass die Neutrophilen haben sich aktiviert, die Neutrophilen-Dichte während des Experiments deutlich verändern könnten. Inhalt &quot;&gt; Die Flusskammer sorgt für eine nahezu homogene Scherspannung in der Kammer (τ = 6Qμ / (wh 2), wobei Q = Durchfluss, μ = dynamische Viskosität, und w = Breite des Flusskammer, h = Höhe der Flusskammer 15). In unseren Untersuchungen verwendeten wir eine Fließrate von 350 ml / min für die Adhäsion von Neutrophilen, was eine Scherbeanspruchung von 1,5 dyn / cm 2 erzeugt (w = 0,25 cm, h = 0,01 in., die Viskosität von Wasser bei 37 ° C (0.007 Poise) als eine Annäherung der Viskosität des RPMI Medien). Für eine bestimmte Strömungskammer, kann man die Strömungsgeschwindigkeit zu ändern, um verschiedene Ebenen der Scherspannung zu erzielen, um verschiedene physiologische Bedingungen imitieren. Typische physiologischen Scherspannungs in der menschlichen Blutgefäße im Bereich zwischen 0,5 bis 5,0 dyn / cm 13,16. Schubspannung in anderen Blutgefäßen und andere Tiere sind in Tabelle 1 113,16,19 20 aufgeführt. Während unsere Methode auf die Untersuchung der Adhäsion von menschlichen neutrophi fokussiertls, diese Methode ist nicht auf Neutrophilen beschränkt und kann leicht an Haftung oder Roll Studien anderer Zelltypen mit einfachen Modifikationen angewendet werden. Außerdem können die Substrate in diesem Verfahren für verschiedene Zwecke verändert werden. Obwohl dieses Protokoll leicht an verschiedene Studien gibt es einige Einschränkungen. Das Protokoll wie hier implementiert erfordert große Anzahl von primären Zellen für die Analyse. Dies kann die Analyse von Primärzellen von Kleintieren nicht aus. Darüber hinaus kann die Notwendigkeit, gereinigtes Adhäsionsliganden in einer Aktiv / verfügbar Konformation immobilisieren den Bereich der Liganden zu begrenzen. Die Verwendung von Fc-Fusionsproteine ​​stark erhöht die Chancen, eine angemessene Konformation des Liganden auf der Plattenoberfläche. Dennoch hat unsere Methode erhebliche Flexibilität bei der quantitativen Analyse von Haft Ereignisse ermöglichen. Diese Studien werden unser Verständnis der Adhäsion Rezeptor-Ligand-Paare, und die Potentialfunktion Bedeutung der genetischen Varianten erheblich verbessernin diesen Proteinen in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen.

Genetische Varianten, sowohl β 2-Integrine und ICAM-Liganden sind nun erkannt, mit der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen 1,2 zugeordnet werden. Die Bestimmung der funktionellen Konsequenzen dieser Varianten in Zellen von Individuen mit diesen Varianten abgeleitet ist, für das Verständnis, wie diese Varianten tragen zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen erforderlich. Solche funktionellen Untersuchungen ermöglichen die Bestimmung der Mechanismen, durch die natürlich vorkommende genetische Varianten Form die Immunantwort sowohl in Gesundheit und Krankheit. Im konkreten Beispiel von SLE, wir wissen jetzt, dass Varianten in ITGAM (CD11b) und sein Ligand, ICAM-1, stark mit der Entwicklung der Krankheit 1,2 verknüpfen. Da Neutrophile sind entscheidend für Entzündungsreaktionen kann die quantitative Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen liefern mechanistische Einblicke in die genetischen Varianten in ITGAM / ICAM ändern Entzündung. NeutropHIL feste Adhäsion von Zellen (EG) Endothelzellen ist ein hoch regulierter Prozess und spielt eine wesentliche Rolle bei Entzündungsreaktionen 3,4. Die feste Adhäsion von neutrophilen folgt Anfangs Neutrophilen-Roll-und Capture auf die EG und schließlich in Trans in vivo führen. Diese Verfahren umfassen viele verschiedene Arten von Adhäsionsmolekülen, wie ICAM-1, ICAM-2, P-Selectin, E-Selectin in den Endothelzellen und β 2-Integrine auf der Neutrophilen 5-9. Somit wird eine sorgfältige Quantifizierung der Adhäsion von Neutrophilen von Spendern mit verschiedenen Allelvarianten von Adhäsionsmolekülen wichtig sein, um die funktionalen und pathologischen Folgen dieser genetischen Varianten zu verstehen. Erprobung eines Strömungskammer kann eine in vitro-Umgebung mit Schubspannung ähnlich der in dem Blutgefäß in vivo Umgebung 10-12 beobachtet erstellen. In der Tat, eine Flusskammer-Assay mit menschlichen Nabel gekoppeltcal Venenendothelzellen (HUVEC), die in vivo Umgebung eines Blutgefßes zu simulieren. Mit dieser Methode kann man die Gesamtzellhafteigenschaften gegenüber Endothelzellen zu untersuchen. Zusätzlich ermöglicht auch die sehr kontrollierter Umgebung der Strömungskammer Beurteilung der Zellbindung an gereinigtes Haftliganden, wie ICAM-1, um die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen erleichtern. Wir stellen hier ein Verfahren, das eine Strömungskammer Haftung Assaysystem, um die Klebeeigenschaften des menschlichen peripheren Neutrophilen zu HUVEC und gereinigten Liganden Substraten zu untersuchen. Mit dieser Methode mit Zellen von Spendern, die verschiedene Adhäsionsmolekül Allel-Varianten können wir beurteilen, wie diese genetischen Varianten humanen neutrophilen feste Haftung verändern.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>mit Phenolrot</td></tr><tr><td>2x Trypsin-Inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Gewebekulturschale</td><td>Corning Inc.</td><td>430165</td><td>Standard-Gewebekultur-behandelte Oberfläche</td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturflasche</td><td>Corning Inc.</td><td>430641 Standard-CCD-Kamera</td> für <td>gewebekulturbehandelte Oberflächen</td></tr><tr><td></td><td>Dage-MTI</td><td>Modell 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>Behälter zum Einfrieren von Zellen</td><td>Biocision</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC Wachstumsbasalmedium</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>HUVEC Wachstumsfaktoren für Basalmedium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Zertifizierte, hitzeinaktivierte</td></tr><tr><td></td><td>Gelatine Sigma</td><td>G9391</td><td>aus Rinderhaut</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>aus menschlichem Plasma</td></tr><tr><td>Strömungskammer</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>Zirkuläre Durchflusskammer für 35 mm Schalen</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Heavy Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC</td><td>Fc-Chimäre</td></tr><tr><td>Lymphozyten-Trennmedium</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25072CV</td><td>Light Ficoll</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td>mit L-Glutamin und Phenol Red</td></tr><tr><td>Protein A</td><td>Sigma</td><td>P6031</td><td>resuspendiert in PBS</td></tr><tr><td>P-Selectin</td><td>R& D Systems</td><td>137-PS</td><td>Fc Chimäre</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>KD Scientific</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&#945;</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Rekombinante humane</td></tr><tr><td>Protein-Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

humanen neutrophilen flusskammer adhesion assay

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophilen feste Haftung an Endothelzellen spielt eine kritische Rolle bei der Entzündung in Gesundheit und Krankheit. Der Prozess der neutrophilen feste Haftung sind viele verschiedene Adhäsionsmoleküle einschließlich der Mitglieder der β 2-Integrin-Familie und ihre Gegenrezeptoren der ICAM-Familie. Kürzlich, natürlich vorkommende genetische Varianten in beiden β 2-Integrine und ICAMs wird berichtet, dass mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht werden. Daher ist die quantitative Haftvermögen der Neutrophilen von Individuen mit unterschiedlichen allelen Formen dieser Adhäsionsmoleküle wichtig in Bezug auf die Mechanismen der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen zugrunde liegenden studieren. Haftungsuntersuchungen in Strömungskammer-Systeme können eine Umgebung mit Schubspannung ähnlich der in dem Blutgefäß in vivo-Umgebung beobachtet erstellen. Hier mit einer Durchflusskammer-Assay-System, um die quantitative Hafteigenschaften der menschlichen peripheren Blut Neutrophilen studieren präsentieren wir eine Methodes für die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) und gereinigten Liganden Substraten. Mit diesem Verfahren können die Neutrophilen Klebe Kapazitäten von Spendern mit verschiedenen Allelvarianten in Adhäsionsrezeptoren bewertet und verglichen werden. Dieses Verfahren kann auch modifiziert werden, um die Haftung der anderen Primärzelltypen oder Zelllinien zu beurteilen.

Beispiele von Neutrophilen-Bindung an gereinigte Ligand (ICAM-1/P-Selectin) beschichteten Strömungskammer (2) oder die Bindung an einen Neutrophilen-HUVEC beschichtet Strömungskammer Assay (Fig. 3) gezeigt. Wie in den Figuren gezeigt, Neutrophilen weiterhin zu akkumulieren / haften an der beschichteten Oberfläche oder HUVEC unter Bedingungen der kontinuierlichen Fluss. Unter unseren typischen Versuchsbedingungen, können wir 50-70 menschlichen Neutrophilen während eines Vier-Minuten Aufzeichnungsdauer fest an der beschichteten Oberfläche haften oder HUVEC beobachten. Jedoch Allelvarianten Neutrophilen Adhäsionsmoleküle oder Allelvarianten in dem Substrat (gereinigt Ligand oder HUVEC), konnte im Wesentlichen quantitative neutrophile Adhäsion 14 verändern. Ferner beurteilten wir die Zeitabhängigkeit der in unseren Studien beobachtet Adhäsion von Neutrophilen Ereignisse. Während wir eine konstante Strömungsverhältnisse ist es möglich, dass die Hafteigenschaften der Zellen über die Zeit ändern. However, über die relativ kurze Zeit Kurse in unseren Studien haben wir keine konsistenten Unterschiede in der Rate der Haftung über die Zeit einhalten. Zum Beispiel die Beurteilung Haftung an den 1-2 Minuten-Zeitpunkten verglichen, um die Haftung zwischen den 3-4 min Zeitpunkten beobachtet wurden, sind nicht konsequent anders. Natürlich, wenn Zellen, die während des Experiments Adhäsion stimuliert, wechselt dann in Hafteigenschaften über die Zeit zu erwarten. In unseren Studien zur Isolierung induzierte Aktivierung von Neutrophilen gesteuert wir durch absichtlich Grundierung der Zellen mit niedriger Dosis fMLP (10 -8 M) für 10 min vor der Studie. Endothelzellen (HUVEC in unseren Studien) bedarf einer vorherigen Aktivierung Adhäsionsmolekülexpression für optimale Leukozyten feste Haftung hochregulieren. In Abwesenheit von Vorbehandlung, wird Endothelzellen (HUVECs) sehr wenig Neutrophilen-Adhäsion zu unterstützen. In unseren Untersuchungen haben wir 10 ng / ml TNF-Behandlung für 4-6 Stunden vor der Verwendung. IL-1β (10 ng / ml) und<html> LPS (0,5-1 ug / ml) können auch verwendet werden, um vor Aktivierung der Endothelzellen werden. Wichtiger ist, kann unbehandelt HUVEC als Negativkontrolle verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zelladhäsion wird durch spezifische (Rezeptor-vermittelte) Neutrophilen-Endothel-Zell-Wechselwirkungen verursacht werden. Alternativ können Anti-Rezeptor-Antikörper verwendet, um spezifische Rezeptoren zu blockieren, um die Spezifität der Haftung zu beurteilen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flusskammer-Konfiguration auf dem Mikroskoptisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 2 Screenshots von einem Beispielvideo von Neutrophilen Einhaltung beschichteten Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten (A ICAM-1/P-Selectin: 0 Zeitpunkt, B: 1 min Zeitpunkt, C: 2 min Zeitpunkt und D: 4 Minuten Zeitpunkt). Die Konzentration von ICAM-1 ist 25 ug / ml und P-Selectin ist 0,5 ug / ml. Neutrophilen-Strömungsgeschwindigkeit von 350 ul / min mit Neutrophilen Dichte auf 500.000 Zellen / ml. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> . Abbildung 3 Screenshots von einem Beispielvideo von Neutrophilen Einhaltung HUVEC beschichteten Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten (A: Zeitpunkt 0, B: 1 min Zeitpunkt, C: 2 min Zeitpunkt und D: 4 min Zeitpunkt).Neutrophile Strömungsgeschwindigkeit beträgt 350 ul / mit neutrophilen Dichte bei 500.000 Zellen / ml ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Spezies </td><td > Lage </td><td > Scherbeanspruchung (dyn / cm 2) </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 11,6 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Kiemenarterie </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> A. femoralis communis </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Nebenniere Aorta </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Supraceliac Aorta </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Oberflächliche fermoral Arterie </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Venolen </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut ersten Arteriolen </td><td> 40,2 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut zweiten Arteriolen </td><td> 0,001 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut ersten Venolen </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut zweiten Venolen </td><td> 0,43 </td></tr><tr ><td> Hund </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 15,8 </td></tr><tr ><td> Kaninchen </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 23,3 </td></tr><tr ><td> Ratte </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 46,6 </td></tr><tr ><td> Maus </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 64,8 </td></tr><tr ><td> Hund </td><td> A. femoralis communis </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Kaninchen </td><td> A. femoralis communis </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Ratte </td><td> A. femoralis communis </td><td> 65,9 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispielscherspannung in verschiedenen Organen und verschiedenen Arten. * Von Artikeln 13, 16, 19 und 20 zusammengefaßt.

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die feste Adhäsion von Neutrophilen mithilfe eines Durchflusskammer-Assays zu messen, der die Adhäsion menschlicher Neutrophiler unter Scherbelastung ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Substrat aus gereinigten Adhäsionsmolekülen oder einer endothelialen Zelloberfläche, wie beispielsweise menschlichen Nabelvenenendothelzellen oder ve, präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Neutrophile aus menschlichem peripherem Blut mittels einer zweischichtigen PHI-Call-Zentrifugationsmethode zu isolieren.Anschließend wird die Flusskammer zusammengesetzt, um die Injektion der isolierten humanen Neutrophilen unter Scherstress auf das Substrat aus Adhäsionsmolekülen, Liganden oder ve zu ermöglichen. Im letzten Schritt werden Adhäsionsereignisse der Neutrophilen in der Flusskammer aufgezeichnet und anschließend eine sorgfältige Quantifizierung der festen Adhäsion durchgeführt. Letztendlich dient der Flusskammer-Assay dazu, die feste Adhäsion von Neutrophilen gegenüber gereinigten Adhäsionsmolekülen und einer HX-Oberfläche nachzuweisen.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Autoimmunität zu beantworten, beispielsweise die funktionelle Bedeutung genetischer Variationen in Gewebemolekülen, die mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen assoziiert sind. Genetische Studien an Patienten mit systemischem Lupus erythematodes haben eine starke Assoziation mit Varianten des Proteins Abeta zwei Integrin gezeigt, das an der festen Adhäsion von Neutrophilen beteiligt ist. Wir haben dieses Assaysystem entwickelt, um die funktionellen Auswirkungen genetischer Variationen in diesem beta zwei Integrin, genannt Mac-1, auf die feste Adhäsion zu untersuchen. Um die Kulturschalen für die Verwendung in der Durchflusskammer vorzubereiten.Geben Sie ein Milliliter einer Fibrin- und Gelatinlösung in jede 35-Millimeter-Zellkulturschale und pipettieren Sie mehrmals, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche der Schale beschichtet ist. Entfernen Sie die überschüssige Fibronectin- und Gelatinlösung und lassen Sie die Schalen mindestens 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Um die Bildung der Proteinmatrix zu optimieren, gewinnen Sie humane Nabelvenenendothelzellen oder qve, die mit Trypsin-EDTA bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90 % kultiviert wurden, und säen Sie 500.000 Zellen in jede beschichtete Zellkulturschale aus.Geben Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium in jede Petrischale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Die Zellen mit 5 % CO2 sollten täglich visuell überprüft und alle zwei Tage mit frischem Medium versorgt werden. Lassen Sie die Zellen bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90 % wachsen.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einem Stift oder Marker einen Kreis mit einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern in die Mitte einer 35-Millimeter-Zellkulturplatte zeichnen. Geben Sie 20 Mikroliter einer 20 Mikrogramm pro Milliliter Protein-A-Lösung in den markierten Bereich. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Protein-A-Lösung gleichmäßig über die gesamte Fläche innerhalb des Kreises mit 0,5 Zentimeter Durchmesser zu verteilen.Es ist wichtig, die Oberfläche der Schale nicht zu berühren oder zu verkratzen. Inkubieren Sie die Zellkulturschalen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie danach jede mit Protein a beschichtete Platte dreimal mit je einem Milliliter PBS.Nach dem Entfernen des PBS aus der dritten Waschplatte 50 Mikroliter 1 % BSA in den markierten Bereich geben, um unspezifische Bindungen auf der Platte zu blockieren. Zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach zwei Stunden.Spülen Sie die blockierte Platte dreimal mit je einem Milliliter PBS. Bereiten Sie die Lösungen des FC-Adhäsionsrezeptor-Liganden-Chimärenproteins für die Beschichtung und dieses Experiment vor; verwendet werden ICAM-1-Fc-Kyra bei 25 Mikrogramm pro Milliliter und P-Selectin-Fc-Kyra bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter. Beschichten Sie den markierten Bereich mit 50 Mikrolitern der Substanzlösung und inkubieren Sie die Zellkulturgefäße über Nacht bei vier Grad Celsius.Die Schalen sollten innerhalb von zwei Tagen verwendet werden, und der beschichtete Bereich darf nicht austrocknen. Falls nötig, geben Sie PBS hinzu, um die 50 Mikroliter Lösung auf der Platte aufrechtzuerhalten.Neutrophile für diese Studie werden aus dem Blut von Teilnehmern isoliert, die eine schriftliche informierte Einwilligung gegeben haben. Nach der Blutentnahme mittels Phlebotomie in ein Antikoagulans-Blutentnahmeröhrchen oder Vakuumröhrchen wird das Blut im Verhältnis 1:1 mit PBS verdünnt; alle Schritte dieses Verfahrens werden bei Raumtemperatur durchgeführt. In 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen wird eine zweischichtige Phy-Lösung zur Trennung peripherer mononukleärer Blutzellen oder pBMCs und Neutrophiler vorbereitet.Fügen Sie zuerst 15 Milliliter schweres PHI call hinzu und schichten Sie vorsichtig 10 Milliliter leichtes fi call auf das schwere fi call auf. Es sollte eine scharfe Grenze zwischen der Schicht aus leichtem fi call und der aus schwerem fi call bestehen. Schichten Sie abschließend 25 Milliliter der verdünnten Blutprobe vorsichtig auf das leichte fi call auf, ohne das PHI zu stören.Zentrifugieren Sie die Röhrchen in der Call-Schicht 30 Minuten bei Raumtemperatur; nach der Zentrifugation sollten mehrere Schichten vorhanden sein. Die Neutrophilen-Schicht mit wenigen roten Blutkörperchen befindet sich zwischen der leichten und der schweren Phi-Schicht. Heben Sie mithilfe einer Transferpipette die Neutrophilen-Schicht ab und überführen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie PBS hinzu, um ein Endvolumen von 50 Milliliter zu erreichen.Zentrifugieren bei 225 × g für 10 Minuten. Bei Raumtemperatur können nach der Zentrifugation noch rote Blutkörperchen mit den Neutrophilen vermischt sein. Den Überstand bis auf 10 Milliliter abpipettieren.Markieren Sie Resus. Das Neutrophilen-Erythrozyten-Pellet durch kurzzeitiges Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit resuspendieren und anschließend erneut mit 50 Milliliter PBS waschen. Den Überstand abziehen, um verunreinigende rote Blutkörperchen zu entfernen. Die pelletierten Zellen im verbleibenden PBS durch kurzes Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit resuspendieren.Geben Sie 25 Milliliter Wasser hinzu und wirbeln Sie vorsichtig 10 Sekunden lang. Bei Läusen geben Sie 25 Milliliter 1,8 %iger Natriumchloridlösung zu den roten Blutkörperchen hinzu und mischen sofort durch Zentrifugation bei 225 × g für 10 Minuten.Die verunreinigenden roten Blutkörperchen sollten nun lysiert sein, sodass ein weißes Pellet aus neutrophilen Zellen zurückbleibt. Waschen Sie das neutrophile Zellpellet mit PBS, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die isolierten Neutrophilen in RPMI-Medium mit 10 % FBS. Nach Bestimmung der Zellkonzentration im Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer stellen Sie die Zelldichte auf 500.000 Zellen pro Milliliter mit vollständigem RPMI-Medium mit 10 % FBS ein.Bevor Sie den Adhäsionsassay in der Durchflusskammer beginnen, stimulieren Sie die VE mit 20 Nanogramm pro Milliliter humanem TNF-alpha für vier bis sechs Stunden, um die Expression von Adhäsionsmolekülen hochzuregulieren und zu aktivieren. Wenn die VE bereit sind, bauen Sie die Durchflusskammer zusammen. Stellen Sie die 35-Millimeter-Schale mit den konfluenten VE auf den Mikroskoptisch.Für die Zwecke dieses Videos wird nur die Adhäsion von Neutrophilen an VE untersucht, doch das gleiche Verfahren gilt für die Untersuchung der Neutrophilen-Adhäsion an gereinigten Adhäsionsmolekülen. Verbinden Sie die Parallelplatten-Flusskammer mit der Spritzenpumpe und dem Vakuumsystem und lassen Sie eine Leitung für die Neutrophilenzufuhr offen. Setzen Sie die Flusskammer auf die Platte und befestigen Sie die Flusskammeranordnung. Starten Sie das Videoaufnahmeprogramm auf dem mit dem Mikroskop verbundenen Computer.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass ein klares Bild mit vollständig ausgebildetem VE sichtbar ist. Spülen Sie mit Hilfe der Spritzenpumpe die Durchflusskammer mit RPMI-Medium aus. Achten Sie darauf, dass sich weder in der Kammer noch in der Neutrophilen-Zuführungsleitung Luftblasen befinden.Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um die Neutrophilen mit definierten Geschwindigkeiten in die Durchflusskammer einzuspritzen. Nehmen Sie ein Video auf, da die Adhäsion der Neutrophilen schnell erfolgen kann; ein Video von vier bis fünf Minuten Dauer ist in der Regel ausreichend, um die Adhäsionsereignisse für die Analyse zu quantifizieren. Dieses Videoclip zeigt ein Beispiel für Neutrophile, die an eine HU E-beschichtete Durchflusskammer binden.Eine adhärente Zelle ist definiert als eine Zelle, die sich innerhalb von fünf Sekunden weniger als einen Zelldurchmesser bewegt. Auf der HU e-beschichteten Oberfläche. Gezeigt sind hier Bildschirmfotos zu verschiedenen Zeitpunkten aus Beispielvideos von Neutrophilen, die an einer ICAM-eins-P-Selektin-beschichteten Oberfläche oder einer uve-beschichteten Oberfläche adhärieren.Bei beiden Experimenten beträgt die Flussgeschwindigkeit der Neutrophilen 350 Mikroliter pro Minute bei einer Neutrophilendichte von 500.000 Zellen pro Milliliter. Unter typischen Bedingungen wurde beobachtet, dass 50 bis 70 humane Neutrophile während einer vierminütigen Aufzeichnungsphase fest an der Liganden- oder VE-beschichteten Oberfläche adhärierten. Allerdings könnten allelische Varianten von Neutrophilen-Adhäsionsmolekülen oder allelische Varianten im Substrat die quantitative Neutrophilenadhäsion erheblich verändern, wenn Aufnahmen gleicher Dauer mit verschiedenen Spendern durchgeführt werden.Neutrophile, die Anzahl der Adhärenzzellen pro Minute kann berechnet werden, um die Adhärenzeigenschaften zwischen verschiedenen Spendern zu vergleichen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die neutrophilen Zellen visuell auf Zellklumpenbildung infolge einer durch die Isolierung induzierten Zellaktivierung zu überprüfen. Zusätzlich kann eine parallele Durchflusszytometrie-Analyse der Zellaktivierung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass der Aktivierungszustand der Zellen zwischen Spendern und zwischen Experimenten übereinstimmt.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Autoimmunität, die Zelladhäsion in primären humanen Zellen von Genotyp-Spendern zu untersuchen, die unterschiedliche Allele im kodierenden Bereich der CD11b-Kette des Beta-2-Integrins MAC-1 aufweisen. Diese Studien ermöglichten eine sorgfältige und quantitative Bewertung der funktionellen Auswirkungen dieser allelischen Varianten im menschlichen System.

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Dieses Video zeigt den Chemotaxis-Assay von Neutrophilen mit einer All-on-Chip-Methode. Die Methode ermöglicht die direkte Isolierung von Neutrophilen aus dem Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion, gefolgt von einem Chemotaxis-Assay auf einem mikrofluidischen Chip.

Eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zur schnellen Chemotaxis-Analyse von Neutrophilen mit Vollblut

Dieses Video zeigt einen auf Laminarströmung basierenden Assay zur Charakterisierung der Interaktion von Leukozyten und zellulären Partnern wie Endothelzellen. Diese Methode liefert dynamische Einblicke in die Adhäsion, Deadhäsion und Transmigration von Leukozyten, wenn sie über eine intakte und konfluente Schicht von Gefäßzellen perfundiert werden.

Ein Laminar-Flow-basierter Assay zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen

Das Video zeigt eine Methode zur Untersuchung des Einflusses von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten. In einem Modell mit paralleler Plattenströmungskammer induzieren proinflammatorische Zytokine die Expression von Adhäsionsrezeptoren durch Endothelzellen, was die Rekrutierung und Migration von Neutrophilen erleichtert. Die Wechselwirkung zwischen Stromazellen und Endothelzellen verringert die Rekrutierung von Neutrophilen zu den Endothelzellen.

Eine in vitro Flow-Untersuchung der Wirkung von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das...

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Lernen Sie die Flusskammer-Adhäsionsassay zur Quantifizierung der Neutrophilenadhäsion unter Scherstress an Endothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Varianten bei Autoimmunerkrankungen.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

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