Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die feste Adhäsion von Neutrophilen mithilfe eines Durchflusskammer-Assays zu messen, der die Adhäsion menschlicher Neutrophiler unter Scherbelastung ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Substrat aus gereinigten Adhäsionsmolekülen oder einer endothelialen Zelloberfläche, wie beispielsweise menschlichen Nabelvenenendothelzellen oder ve, präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Neutrophile aus menschlichem peripherem Blut mittels einer zweischichtigen PHI-Call-Zentrifugationsmethode zu isolieren.

Anschließend wird die Flusskammer zusammengesetzt, um die Injektion der isolierten humanen Neutrophilen unter Scherstress auf das Substrat aus Adhäsionsmolekülen, Liganden oder ve zu ermöglichen. Im letzten Schritt werden Adhäsionsereignisse der Neutrophilen in der Flusskammer aufgezeichnet und anschließend eine sorgfältige Quantifizierung der festen Adhäsion durchgeführt. Letztendlich dient der Flusskammer-Assay dazu, die feste Adhäsion von Neutrophilen gegenüber gereinigten Adhäsionsmolekülen und einer HX-Oberfläche nachzuweisen.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Autoimmunität zu beantworten, beispielsweise die funktionelle Bedeutung genetischer Variationen in Gewebemolekülen, die mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen assoziiert sind. Genetische Studien an Patienten mit systemischem Lupus erythematodes haben eine starke Assoziation mit Varianten des Proteins Abeta zwei Integrin gezeigt, das an der festen Adhäsion von Neutrophilen beteiligt ist. Wir haben dieses Assaysystem entwickelt, um die funktionellen Auswirkungen genetischer Variationen in diesem beta zwei Integrin, genannt Mac-1, auf die feste Adhäsion zu untersuchen. Um die Kulturschalen für die Verwendung in der Durchflusskammer vorzubereiten.

Geben Sie ein Milliliter einer Fibrin- und Gelatinlösung in jede 35-Millimeter-Zellkulturschale und pipettieren Sie mehrmals, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche der Schale beschichtet ist. Entfernen Sie die überschüssige Fibronectin- und Gelatinlösung und lassen Sie die Schalen mindestens 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Um die Bildung der Proteinmatrix zu optimieren, gewinnen Sie humane Nabelvenenendothelzellen oder qve, die mit Trypsin-EDTA bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90 % kultiviert wurden, und säen Sie 500.000 Zellen in jede beschichtete Zellkulturschale aus.

Geben Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium in jede Petrischale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Die Zellen mit 5 % CO2 sollten täglich visuell überprüft und alle zwei Tage mit frischem Medium versorgt werden. Lassen Sie die Zellen bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90 % wachsen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einem Stift oder Marker einen Kreis mit einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern in die Mitte einer 35-Millimeter-Zellkulturplatte zeichnen. Geben Sie 20 Mikroliter einer 20 Mikrogramm pro Milliliter Protein-A-Lösung in den markierten Bereich. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Protein-A-Lösung gleichmäßig über die gesamte Fläche innerhalb des Kreises mit 0,5 Zentimeter Durchmesser zu verteilen.

Es ist wichtig, die Oberfläche der Schale nicht zu berühren oder zu verkratzen. Inkubieren Sie die Zellkulturschalen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie danach jede mit Protein a beschichtete Platte dreimal mit je einem Milliliter PBS.

Nach dem Entfernen des PBS aus der dritten Waschplatte 50 Mikroliter 1 % BSA in den markierten Bereich geben, um unspezifische Bindungen auf der Platte zu blockieren. Zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach zwei Stunden.

Spülen Sie die blockierte Platte dreimal mit je einem Milliliter PBS. Bereiten Sie die Lösungen des FC-Adhäsionsrezeptor-Liganden-Chimärenproteins für die Beschichtung und dieses Experiment vor; verwendet werden ICAM-1-Fc-Kyra bei 25 Mikrogramm pro Milliliter und P-Selectin-Fc-Kyra bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter. Beschichten Sie den markierten Bereich mit 50 Mikrolitern der Substanzlösung und inkubieren Sie die Zellkulturgefäße über Nacht bei vier Grad Celsius.

Die Schalen sollten innerhalb von zwei Tagen verwendet werden, und der beschichtete Bereich darf nicht austrocknen. Falls nötig, geben Sie PBS hinzu, um die 50 Mikroliter Lösung auf der Platte aufrechtzuerhalten.

Neutrophile für diese Studie werden aus dem Blut von Teilnehmern isoliert, die eine schriftliche informierte Einwilligung gegeben haben. Nach der Blutentnahme mittels Phlebotomie in ein Antikoagulans-Blutentnahmeröhrchen oder Vakuumröhrchen wird das Blut im Verhältnis 1:1 mit PBS verdünnt; alle Schritte dieses Verfahrens werden bei Raumtemperatur durchgeführt. In 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen wird eine zweischichtige Phy-Lösung zur Trennung peripherer mononukleärer Blutzellen oder pBMCs und Neutrophiler vorbereitet.

Fügen Sie zuerst 15 Milliliter schweres PHI call hinzu und schichten Sie vorsichtig 10 Milliliter leichtes fi call auf das schwere fi call auf. Es sollte eine scharfe Grenze zwischen der Schicht aus leichtem fi call und der aus schwerem fi call bestehen. Schichten Sie abschließend 25 Milliliter der verdünnten Blutprobe vorsichtig auf das leichte fi call auf, ohne das PHI zu stören.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen in der Call-Schicht 30 Minuten bei Raumtemperatur; nach der Zentrifugation sollten mehrere Schichten vorhanden sein. Die Neutrophilen-Schicht mit wenigen roten Blutkörperchen befindet sich zwischen der leichten und der schweren Phi-Schicht. Heben Sie mithilfe einer Transferpipette die Neutrophilen-Schicht ab und überführen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie PBS hinzu, um ein Endvolumen von 50 Milliliter zu erreichen.

Zentrifugieren bei 225 × g für 10 Minuten. Bei Raumtemperatur können nach der Zentrifugation noch rote Blutkörperchen mit den Neutrophilen vermischt sein. Den Überstand bis auf 10 Milliliter abpipettieren.

Markieren Sie Resus. Das Neutrophilen-Erythrozyten-Pellet durch kurzzeitiges Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit resuspendieren und anschließend erneut mit 50 Milliliter PBS waschen. Den Überstand abziehen, um verunreinigende rote Blutkörperchen zu entfernen. Die pelletierten Zellen im verbleibenden PBS durch kurzes Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit resuspendieren.

Geben Sie 25 Milliliter Wasser hinzu und wirbeln Sie vorsichtig 10 Sekunden lang. Bei Läusen geben Sie 25 Milliliter 1,8 %iger Natriumchloridlösung zu den roten Blutkörperchen hinzu und mischen sofort durch Zentrifugation bei 225 × g für 10 Minuten.

Die verunreinigenden roten Blutkörperchen sollten nun lysiert sein, sodass ein weißes Pellet aus neutrophilen Zellen zurückbleibt. Waschen Sie das neutrophile Zellpellet mit PBS, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die isolierten Neutrophilen in RPMI-Medium mit 10 % FBS. Nach Bestimmung der Zellkonzentration im Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer stellen Sie die Zelldichte auf 500.000 Zellen pro Milliliter mit vollständigem RPMI-Medium mit 10 % FBS ein.

Bevor Sie den Adhäsionsassay in der Durchflusskammer beginnen, stimulieren Sie die VE mit 20 Nanogramm pro Milliliter humanem TNF-alpha für vier bis sechs Stunden, um die Expression von Adhäsionsmolekülen hochzuregulieren und zu aktivieren. Wenn die VE bereit sind, bauen Sie die Durchflusskammer zusammen. Stellen Sie die 35-Millimeter-Schale mit den konfluenten VE auf den Mikroskoptisch.

Für die Zwecke dieses Videos wird nur die Adhäsion von Neutrophilen an VE untersucht, doch das gleiche Verfahren gilt für die Untersuchung der Neutrophilen-Adhäsion an gereinigten Adhäsionsmolekülen. Verbinden Sie die Parallelplatten-Flusskammer mit der Spritzenpumpe und dem Vakuumsystem und lassen Sie eine Leitung für die Neutrophilenzufuhr offen. Setzen Sie die Flusskammer auf die Platte und befestigen Sie die Flusskammeranordnung. Starten Sie das Videoaufnahmeprogramm auf dem mit dem Mikroskop verbundenen Computer.

Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass ein klares Bild mit vollständig ausgebildetem VE sichtbar ist. Spülen Sie mit Hilfe der Spritzenpumpe die Durchflusskammer mit RPMI-Medium aus. Achten Sie darauf, dass sich weder in der Kammer noch in der Neutrophilen-Zuführungsleitung Luftblasen befinden.

Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um die Neutrophilen mit definierten Geschwindigkeiten in die Durchflusskammer einzuspritzen. Nehmen Sie ein Video auf, da die Adhäsion der Neutrophilen schnell erfolgen kann; ein Video von vier bis fünf Minuten Dauer ist in der Regel ausreichend, um die Adhäsionsereignisse für die Analyse zu quantifizieren. Dieses Videoclip zeigt ein Beispiel für Neutrophile, die an eine HU E-beschichtete Durchflusskammer binden.

Eine adhärente Zelle ist definiert als eine Zelle, die sich innerhalb von fünf Sekunden weniger als einen Zelldurchmesser bewegt. Auf der HU e-beschichteten Oberfläche. Gezeigt sind hier Bildschirmfotos zu verschiedenen Zeitpunkten aus Beispielvideos von Neutrophilen, die an einer ICAM-eins-P-Selektin-beschichteten Oberfläche oder einer uve-beschichteten Oberfläche adhärieren.

Bei beiden Experimenten beträgt die Flussgeschwindigkeit der Neutrophilen 350 Mikroliter pro Minute bei einer Neutrophilendichte von 500.000 Zellen pro Milliliter. Unter typischen Bedingungen wurde beobachtet, dass 50 bis 70 humane Neutrophile während einer vierminütigen Aufzeichnungsphase fest an der Liganden- oder VE-beschichteten Oberfläche adhärierten. Allerdings könnten allelische Varianten von Neutrophilen-Adhäsionsmolekülen oder allelische Varianten im Substrat die quantitative Neutrophilenadhäsion erheblich verändern, wenn Aufnahmen gleicher Dauer mit verschiedenen Spendern durchgeführt werden.

Neutrophile, die Anzahl der Adhärenzzellen pro Minute kann berechnet werden, um die Adhärenzeigenschaften zwischen verschiedenen Spendern zu vergleichen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die neutrophilen Zellen visuell auf Zellklumpenbildung infolge einer durch die Isolierung induzierten Zellaktivierung zu überprüfen. Zusätzlich kann eine parallele Durchflusszytometrie-Analyse der Zellaktivierung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass der Aktivierungszustand der Zellen zwischen Spendern und zwischen Experimenten übereinstimmt.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Autoimmunität, die Zelladhäsion in primären humanen Zellen von Genotyp-Spendern zu untersuchen, die unterschiedliche Allele im kodierenden Bereich der CD11b-Kette des Beta-2-Integrins MAC-1 aufweisen. Diese Studien ermöglichten eine sorgfältige und quantitative Bewertung der funktionellen Auswirkungen dieser allelischen Varianten im menschlichen System.