Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die feste Adhäsion von Neutrophilen mit Hilfe eines Durchflusskammer-Assays zu messen, der die Adhäsion von Neutrophilen beim Menschen in Gegenwart von Scherspannung ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Substrat aus gereinigten Adhäsionsmolekülen oder eine Endothelzelloberfläche, wie z. B. eine menschliche Nabelvene, Endothelzellen oder ve, hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Neutrophile aus dem menschlichen peripheren Blut mit Hilfe einer zweischichtigen PHI-Zentrifugationsmethode zu trennen.

Als nächstes wird die Durchflusskammer zusammengebaut, um die Injektion der isolierten humanen Neutrophilen unter Scherspannung auf das Substrat von Adhäsion, Liganden oder ve zu ermöglichen. Der letzte Schritt besteht darin, die Adhäsionsereignisse der Neutrophilen in der Durchflusskammer aufzuzeichnen, gefolgt von einer sorgfältigen Quantifizierung der festen Adhäsion. Letztendlich wird der Durchflusskammer-Assay verwendet, um eine feste Adhäsion von Neutrophilen gegenüber gereinigten Adhäsionsmolekülen und einer HX-Oberfläche zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Autoimmunität zu beantworten, wie z. B. die funktionelle Bedeutung genetischer Variationen in Gewebemolekülen, von denen bekannt ist, dass sie mit der Entwicklung von Autoimmunität in Verbindung gebracht werden. Genetische Studien an Patienten mit systemischem Lupus erythema Ptosis haben eine starke Assoziation mit Varianten und Abeta zwei Integrin gezeigt, einem Protein, das an der festen Adhäsion von Neutrophilen beteiligt ist. Wir haben dieses Assay-System entwickelt, um die funktionellen Konsequenzen der genetischen Variation in diesem Beta zwei endokrinen namens Mac one auf feste Adhäsion zu bewerten, um die Kulturschalen für die Verwendung in der Durchflusskammer vorzubereiten.

Geben Sie je einen Milliliter einer Fibrin- und Gelatinelösung in jede 35-Millimeter-Gewebekulturschale und pipettieren Sie mehrmals, um sicherzustellen, dass die gesamte Plattenoberfläche beschichtet ist. Entfernen Sie das überschüssige Fibronektin und die Gelatinelösung und trocknen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang an der Luft. Um die Bildung der Proteinmatrix zu optimieren, ernten Sie humane Nabelvenendothelzellen oder QVE, die mit Trypsin-EDTA auf 80 bis 90 % Konfluenz kultiviert wurden, und säen 500.000 Zellen in jede beschichtete Gewebekulturschale.

Geben Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium in jede Schale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. 5%CO2-Zellen sollten täglich visuell inspiziert werden, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt werden sollte. Lassen Sie die Zellen auf 80 bis 90 % Konfluenz wachsen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, zeichnen Sie mit einem Marker oder Stift einen Kreis von 0,5 Zentimetern Durchmesser in die Mitte einer 35-Millimeter-Gewebekulturschalenplatte. 20 Mikroliter eines 20 Mikrogramm pro Milliliter Proteins, eine Lösung in den markierten Bereich. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Protein zu verteilen, eine Lösung, um die gesamte Fläche innerhalb des Kreises mit einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern abzudecken.

Es ist wichtig, die Oberfläche des Gerichts nicht zu berühren oder zu zerkratzen. Inkubieren Sie die Gewebekulturschalen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend jedes Protein dreimal mit einem Milliliter PBS auf einer beschichteten Platte.

Nach der Entnahme des PBS von der dritten Waschplatte 50 Mikroliter 1%BSA in den markierten Bereich geben, um eine unspezifische Bindung auf der Platte zu blockieren. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nach zwei Stunden.

Waschen Sie die verstopfte Platte dreimal mit einem Milliliter PBS. Bereiten Sie die chimären Proteinlösungen für den FC-Adhäsionsrezeptor-Liganden für die Beschichtung vor, und in diesem Experiment und ICAM werden eine FC Kyra mit 25 Mikrogramm pro Milliliter und eine P-Selektion FC Kyra mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verwendet. Die markierte Stelle mit 50 Mikrolitern des Substrats bestreichen, die Gewebekulturschalen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Das Geschirr sollte innerhalb von zwei Tagen verwendet werden und die beschichtete Fläche sollte nicht austrocknen. Gegebenenfalls. Fügen Sie PBS hinzu, um die 50 Mikroliter Lösung auf der Platte zu halten.

Neutrophile für diese Studie wurden aus dem Blut von Teilnehmern isoliert, die eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben haben. Nachdem Sie Blut durch Phlebotomie in ein gerinnungshemmendes Blutentnahmeröhrchen oder einen Vacutainer entnommen haben, verdünnen Sie das Blut eins zu eins mit PBS und führen Sie alle Schritte dieses Verfahrens durch. Bereiten Sie bei Raumtemperatur ein zweischichtiges phy call für die Trennung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder p BMCs und Neutrophilen in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor.

Fügen Sie zuerst 15 Milliliter schweren PHI-Aufruf hinzu und schichten Sie dann vorsichtig 10 Milliliter leichten Fi-Anruf auf den starken Fi-Aufruf. Es sollte eine scharfe Grenze zwischen den Schichten Light Fi Call und Heavy Fi Call vorhanden sein. Zum Schluss schichten Sie vorsichtig 25 Milliliter der verdünnten Blutprobe auf den Light-Fi-Call, ohne den PHI zu stören.

Rufen Sie die Schicht auf: Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur, nach der Zentrifugation sollten mehrere Schichten vorhanden sein. Die neutrophile Schicht mit wenigen roten Blutkörperchen befindet sich zwischen dem leichten und dem schweren Phi. Rufen Sie mit einer Transferpipettenentnahme auf und übertragen Sie die Neutrophilenschicht in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie PBS auf ein Endvolumen von 50 Millilitern hinzu.

10 Minuten lang bei 225 mal G zentrifugieren. Bei Raumtemperatur nach der Zentrifugation können sich noch rote Blutkörperchen mit den Neutrophilen vermischen. Saugen Sie den Überstand bis auf 10 Milliliter an.

Mark Resus. Suspendieren Sie das neutrophile Pellet der roten Blutkörperchen, indem Sie es kurz mit niedriger Geschwindigkeit vortexen und dann erneut mit 50 Millilitern PBS waschen, den Überstand aspirieren, um die kontaminierenden roten Blutkörperchen zu entfernen. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen im verbleibenden PBS durch einen kurzen Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit.

Fügen Sie 25 Milliliter Wasser hinzu und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang vorsichtig ein. Zu Läusen. Die roten Blutkörperchen fügen 25 Milliliter 1,8% Natriumchlorid hinzu und mischen sofort durch Zentrifugation bei 225 mal G für 10 Minuten.

Die kontaminierenden roten Blutkörperchen sollten nun liegen, so dass ein weißes Neutrophilen-Zellpellet übrig bleibt. Waschen Sie das neutrophile Zellpellet mit PBS, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die isolierten Neutrophilen in RPMI-Medium mit 10 % FBS. Nachdem Sie die Zellkonzentration unter einem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer bestimmt haben, stellen Sie die Zelldichte auf 500.000 Zellen pro Milliliter mit vollständigem RPMI 10%FBS-Medium ein.

Vor Beginn des Adhäsionsassays in der Durchflusskammer wird der VE vier bis sechs Stunden lang mit 20 Nanogramm pro Milliliter humanem TNF alpha grundiert, um die Expression des Adhäsionsmoleküls hochzuregulieren und zu stimulieren. Wenn die VE fertig sind, montieren Sie die Durchflusskammer. Stellen Sie die 35-Millimeter-Schüssel mit dem konfluenten VE auf den Mikroskoptisch.

Für die Zwecke dieses Videos wird nur die Adhäsion von Neutrophilen an VE untersucht, aber das gleiche Verfahren gilt für die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an gereinigten Adhäsionsmolekülen: Verbinden Sie die Parallelplatten-Durchflusskammer mit der Spritzenpumpe und dem Vakuumsystem und lassen Sie eine Leitung für den Neutrophileneingang offen. Setzen Sie die Durchflusskammer auf die Platte ein und befestigen Sie die Durchflusskammerbaugruppe. Starten Sie das Videoaufzeichnungsprogramm auf dem Computer, der mit dem Mikroskop verbunden ist.

Passen Sie das Feld und den Fokus des Mikroskops an, bis ein klares Feld mit ausgewachsenem VE sichtbar ist. Spülen Sie die Durchflusskammer mit der Spritzenpumpe mit RPMI-Medium. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Kammer oder der Neutrophileneingangsleitung befinden.

Mit der Spritzenpumpe injizieren Sie die Neutrophilen mit definierten Geschwindigkeiten in die Durchflusskammer. Nehmen Sie das Video auf Da die Adhäsion von Neutrophilen schnell erfolgen kann, reicht in der Regel ein vier- bis fünfminütiges Video aus, um Adhäsionsereignisse für die Analyse zu quantifizieren. Dieser Videoclip zeigt ein Beispiel für die Bindung von Neutrophilen an eine HU E-beschichtete Strömungskammer.

Eine adhärente Zelle ist definiert als eine Zelle, die innerhalb von fünf Sekunden weniger als einen Zelldurchmesser bewegt. Auf der HU e beschichteten Oberfläche. Hier sind Screenshots zu verschiedenen Zeitpunkten aus Beispielvideos von Neutrophilen zu sehen, die an einer mit ICAM one P selectin beschichteten Oberfläche oder einer uve-beschichteten Oberfläche haften.

In beiden Experimenten beträgt die Flussgeschwindigkeit der Neutrophilen 350 Mikroliter pro Minute bei einer Neutrophilendichte von 500.000 Zellen pro Milliliter. Unter typischen Bedingungen wurde beobachtet, dass 50 bis 70 humane Neutrophile während eines vierminütigen Aufzeichnungszeitraums fest an der Liganden- oder VE-beschichteten Oberfläche hafteten. Allelische Varianten von Neutrophilenadhäsionsmolekülen oder allelische Varianten im Substrat könnten jedoch die quantitative Neutrophilenadhäsion erheblich verändern, indem Videos ähnlicher Länge mit verschiedenen Donatoren aufgenommen werden.

Neutrophilen, die Anzahl der Adhärenzzellen pro Minute, kann berechnet werden, um die Adhäsionseigenschaften zwischen verschiedenen Spendern zu vergleichen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Neutrophilen visuell auf Zellklemmungen zu überprüfen, die durch die isolierung induzierte Zellaktivierung verursacht werden. Darüber hinaus kann eine parallele durchflusszytometrische Beurteilung der Zellaktivierung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass der Aktivierungszustand der Zellen zwischen den Spendern und zwischen den Experimenten übereinstimmt.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Autoimmunität den Weg, um die Zelladhäsion in primären menschlichen Zellen von Genotypspendern zu untersuchen, die unterschiedliche kodierende Allele der CD 11 B-Kette des Beta-Integrins und MAC haben. Diese Studien haben eine sorgfältige und quantitative Bewertung der funktionellen Auswirkungen dieser allelischen Varianten auf das menschliche System ermöglicht.