Name: Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von Escherichia coli, Salmonellen Spp. Und Listeria monocytogenes Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Erfahren Sie die farbmetrische Papierbasierte Erkennung von Lebensmittelpathogenen in großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers mit Modified Moore Swabs. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und effiziente Überwachung der Wassersicherheit.

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Wir danken für die Finanzierung dieses Projekts durch die Zuschüsse des USDA National Institute of Food and Agriculture 2009-01208 und 2009-01984.

1. Konzentration der Bakterien aus großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser Mit MMS <ol><li> MMS Vorbereitung <ol><li> Schneiden Sie einen rechteckigen Querschnitt von 4-lagige Gaze 40 x 12 cm. </li><li> Falten Sie die Gaze an beiden Achsen, um ein Rechteck von 20 x 6 cm erhalten. </li><li> Rollen Sie die Gaze dicht entlang seiner Längsachse um einen zylindrischen Tupfer von ca. 6 cm hoch und 3 cm im Durchmesser bilden. </li><li> Autoklavieren die Gaze Tupfer in Aluminium-Folie, nicht die Kassette im Autoklaven. Dekontaminieren Kassette durch Eintauchen für 30 min in 10% Haushaltsbleichmittel, und Deaktivieren des restlichen Chlors durch Einweichen der Kassette für 15 min in einer Natriumthiosulfat-Pentahydrat (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O)-Lösung (50 mg / L in sterilem Wasser). </li><li> Legen Sie den Tupfer in die MMS-Kassette. HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, mit einem 4-Blattlage Gaze beginnen michasuring 80 x 22 cm, falten Sie es auf 40 x 11 cm und rollen Sie es zu einem Zylinder etwa 11 cm hoch und 6 cm im Durchmesser bilden. </li><li> Montieren Sie die MMS. </li><li> Bringen Vinylschlauch mit Zapfen auf beiden Seiten der MMS, die Gewährleistung der Schlauch voll haftet an den Zapfen, und fixieren Schlauch in die Schlauchpumpe. Sicherzustellen, dass die Rohrleitung stromaufwärts von der peristaltischen Pumpe eine ausreichende Länge für die Probenahme. </li></ol></li><li> Konzentration der Bakterien <ol><li> Probe mindestens 10 l Wasser landwirtschaftlichen indem die peristaltische Pumpe mit hoher Geschwindigkeit. </li><li> Nach Abschluss der Probenahme ist, ziehen Sie die Schlauchpumpe Einlass aus der Wasserprobe und weiter laufen, bis die Pumpe kein Abwasser beobachtet Verlassen des MMS. </li><li> Wenn ein Verteiler wird verwendet, um mehrere Proben gleichzeitig laufen, sammeln das Abwasser von je MMS, und wenn 10 L wird durch eine einzige MMS gefiltert schließen Sie das Ventil für diese bestimmte MMS und weiterlaufen die Pumpe. <ol><li> Bei der Beprobung is abgeschlossen ist, ziehen Sie die Schlauchpumpe Einlass von der landwirtschaftlichen Wasser, öffnen alle Ventile des Verteilers und die Pumpe läuft weiter, bis kein Abwasser beobachtet Verlassen des MMS. </li></ol></li></ol></li><li> Wenn die Konzentration wurde für alle MMS abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Vinyl-Schläuche von den MMS-Zapfen und der Kappe die Zapfen an beiden Seiten der MMS. Dicht verschlossen MMS kann für bis zu 12 h vor der Zugabe Anreicherungsmedien gespeichert werden. </li></ol> 2. MMS Anreicherung und Probenvorbereitung <ol><li> Bereicherung <ol><li> Schrauben Sie den Deckel der MMS, und aseptisch 20 ml des geeigneten sterilen Anreicherungsbouillon. Verwenden Sie eine MMS für jede selektive Anreicherung. Alternativ führen eine nicht-selektive Anreicherung, alle drei Zielbakterien in der gleichen Probe zu propagieren. HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, aseptisch entfernen Gaze-Filter aus der Kassette und legen Sie in einem sterilen Beutel vor Anzeigeding 225 ml des entsprechenden Anreicherungsmedien. <ol><li> Zur Anreicherung von E. coli, 20 ml gepuffertes Peptonwasser (BPW) mit 8 mg / l Vancomycin-Hydrochlorid ergänzt. </li><li> Zur Anreicherung von Salmonella spp., 20 ml BPW, ergänzt mit der Salmonellen-Ergänzung (4 ml / L). </li><li> Zur Anreicherung von L. monocytogenes, 20 ml VIDAS UP Listeria (LPT) Brühe. </li><li> Für den gleichzeitigen Nicht-selektive Anreicherung für alle drei Mikroorganismen mit Hilfe eines einzigen MMS, Universal Voranreicherung Brühe (UPB). </li></ol></li><li> Schrauben Sie den Deckel der MMS wieder fest. Stellen Sie sicher, dass die Zapfen sind fest verschlossen, um Verschmutzungen und mögliche Kontamination während der Anreicherung zu vermeiden. </li><li> Die MMS inkubieren bis zu 18-24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM. Verwenden Sie 42 ° C für E. coli und Salmonella spp. selektive Anreicherung. Verwenden Sie 30 ° C für L. monocytogenes selektive Anreicherung und verwenden 37 &amp; #176, C für nicht-selektive Anreicherung. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung <ol><li> Wenn Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die MMS aus dem Inkubator, uncap einer der Zapfen, und sanft zu verzichten etwa 0,5 ml in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ lösen Sie die MMS-und Pipette aus 0,5 ml über Nacht Bereicherung. HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, pipettiert 0,5 ml der Anreicherung aus der Tasche. </li><li> Für farbmetrische Analyse von E. coli selektive Anreicherung oder für die Analyse von nicht-selektiven Anreicherung, beschallen 0,5 ml Anreicherungs bei 5 W, 22 kHz für 20 sec unter Verwendung einer Ultraschallsonde. </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung und Einbetten von Farbmetrische Substrate in μPADs <ol><li> Vorbereitung genug μPADs für jede Probe und Ziel getestet. Um zu erkennen, E. coli vorzubereiten CPRG und X-Gluc μPADs, Salmonella spp. Erkennung vorzubereiten MC μPADs und für L. monocytogenes Erkennung bereiten X-InP μPADs. <ol><li> Vorbereitung HEPES-Puffer [0,1 M HEPES mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)] für die kolorimetrische Substrate und der pH-Wert des Puffers nach dem Substrat, die gehen, verwendet werden: pH 7,5 für die Herstellung von CPRG oder X-Gluc, pH 9 für MC und pH 7 für X-InP. </li><li> Stammlösungen der Substrate im pH HEPES-Puffer bei Konzentrationen von 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP). Schützen Sie die Stammlösungen aus Licht. </li><li> Legen Sie die μPADs in einer sterilen Petrischale, die dann einbetten μPAD Mikrospots mit 24 ul jedes Substrat-Stammlösung. </li></ol></li></ol> 4. Erkennung und Datenanalyse <ol><li> Entdeckung <ol><li> In 6 ul der Probe angereichert mit jedem geeigneten μPAD Mikrospots in einer Petrischale enthalten. </li><li> Legen Sie die Abdeckung wieder auf die Petrischale und verschließen Sie diese mit Parafilm. </li><li> Inkubierenmit der μPAD bei 37 ° C für 3 h bis zur Farbentwicklung und Trocknung der Mikrospots zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Visuelle Prüfung der Ergebnisse <ol><li> Führen Erfassung durch einfache visuelle Prüfung der Farbänderungen der μPADs. HINWEIS: In der Regel sind starke Reaktionen, die endgültige Farbveränderungen erzeugen nach 18-24 Stunden der Bereicherung, die die Notwendigkeit zur weiteren Klärung zu vermeiden sollte und was als positiv erwartet. </li><li> Bestimmung der Anwesenheit eines E. coli positive Probe durch Beobachtung Mikrospots mit CPRG Umschlag von gelb nach rot-violett und Mikrospots mit X-Gluc Umschlag von farblos nach blau-grün eingebettet eingebettet. </li><li> Bestimmen Sie die Anwesenheit eines L. monocytogenes-positiven Probe durch Beobachtung Mikrospots mit X-InP Umschlag von farblos nach indigo eingebettet. </li><li> Bestimmung der Gegenwart von Salmonella spp. positive Probe durch Beobachtung Mikrospots mit MC Wechsel von col eingebettetorless bis violett-lila. </li></ol></li><li> Aided Software Data Analysis HINWEIS: geführt, um eindeutig festzustellen, ob schwache Reaktionen positiv oder negativ sind und eine semi-quantitative Analyse der Ergebnisse zu ermöglichen. <ol><li> Lassen Sie die μPADs vollständig trocken. </li><li> Scannen Sie den μPAD mit einem Flachbett-Scanner. </li><li> Verwenden Sie ImageJ-Software, um das Bild zu verarbeiten. <ol><li> &quot;Öffnen&quot;, um das gescannte Bild in ImageJ unter dem Reiter &quot;Datei&quot; im Hauptmenü (oder drücken Sie &quot;Clt + O&quot;) befindet analysiert werden. </li><li> Kehren Sie die Bildauswahl &quot;Invert&quot; unter der Registerkarte &quot;Bearbeiten&quot; im Hauptmenü befindet (oder drücken Sie &quot;Clt + Shift + I&quot;). </li><li> Verwenden Sie die Registerkarte &quot;Analysieren&quot; im Hauptmenü und wählen Sie &quot;Set Maße ...&quot;, um die gemeldeten Messungen analysiert auswählen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die &quot;mittlere Intensität grau&quot;, &quot;Limit to Schwelle&quot; und &quot;Display Label&quot;-Boxen sindüberprüft, und drücken Sie &quot;OK&quot;. Dieser legt fest, wie die Software analysiert jedes Bereich ausgewählt und wie sie es Berichte. </li><li> Verwenden Sie das &quot;Oval&quot;-Tool, um einen Kreis, der den Bereich, den Sie innerhalb messen wollen skizziert ziehen. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Analyze&quot; wählen Sie &quot;Measure&quot; (oder drücken Sie &quot;Clt + M&quot;). Die Software wird die durchschnittliche Grauintensität innerhalb des definierten Bereiches messen und es in einem Pop-up-Bildschirm, kopiert und zur weiteren Analyse übertreffen werden. HINWEIS: Für eine genauere Analyse, zumindest zwei technische Replikate von jeder Probe durchgeführt werden sollte. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+industry%3A+Guide+to+minimize+microbial+food+safety+hazards+for+fresh+fruits+and+vegetables%22">Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables</a>. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).</li>
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<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li>
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<li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost%2C+portable+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li>
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<li>T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt ein integriertes Verfahren zur Detektion von E. coli, Salmonella spp., und L. monocytogenes in landwirtschaftlichen Wasser. Hier MMS Bakterienkonzentration aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser wird mit Bakterienanreicherung gekoppelt und gegen Bakterien anzeigt colorimetrische Detektion mit μPADs. Der MMS-Verfahren mit hoher Partikelgehalt in den Wasserproben zu bewältigen, während die Konzentration der Bakterien 10-fach, ist robust und einfach genug fü...

Es ist wichtig, dass lebensmittelbedingten Krankheitserreger schnell und vorzugsweise im Bereich der Basis-Einstellungen, um die Belastung der Lebensmittelerkrankungen reduzieren erkannt. Gemeinsame Strategien, um lebensmittelbedingten bakteriellen Krankheitserregern erkennen sind biochemische Profiling, selektiven und differentiellen Kultivierung, Isolierung und immunologische Nachweis und molekulare Erkennung. Allerdings sind diese Methoden durch sporadische Kontamination behindert, getestet kleinen Stichproben, die oft geringen Konzentrationen der lebensmittelbedingten pathogenen Bakterien, lange Bearbeitungszeiten, und / oder sind nicht für Feldeinstellungen. Ferner können Verbindungen, in vielen Nahrungs Matrizen hemmend Erkennung und Diagnostik. Um die Wahrscheinlichkeit von mikrobiellen Erkennung verbessern, hat die US-amerikanischen Food and Drug Administration vorgeschlagen, dass die Prüfung der landwirtschaftlichen Wasser (wie z. B. Waschwasser und Bewässerung), die entweder in Kontakt mit einer großen Oberfläche von frischen Produkten oder dient als Vehikel produce Kontamination ist eine praktikable Alternative zur direkten Prüfung von Lebensmitteln ein. Auch so macht der oft geringen natürlichen Erreger-Belastung verbunden mit der Verdünnungseffekt des repräsentativen landwirtschaftlichen Wasserprobe Probenvorbereitungsverfahren für Erreger-Konzentration wesentlich. Ein solches Verfahren würde erfordern Abtasten großer Wassermengen (≥ 10 L), angemessene pathogen-Konzentration und Kompatibilität mit nachgeschalteter Nachweisstrategien. Geändert Moore Tupfer (MMS) sind preiswert, einfach und robuste Geräte für die Konzentration von Bakterien große Mengen (≥ 10 l) Wasser 2-4 verwendet. Der MMS besteht aus einer Kunststoffkassette mit Gaze, die als Grobfilter für große Wassermengen durch die Kassette unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe gepumpt dient gefüllt. Die MMS ist eine nicht-diskriminierende Methode der Bakterienkonzentration (≥ 10 fache Konzentration), die organischen und anorganischen Partikelmaterial erfasst einschließlich Mikroorganismen in verarbeiteten liquid Proben. Es ist wahrscheinlich, dass die ausgezeichnete Wirksamkeit der Konzentration der Ziel-Mikroorganismen durch den MMS kann durch die Tatsache, dass Mikroorganismen sollen zu dem Schluff-Lehm-Fraktion oder organische Mikroaggregate der suspendierten Feststoffe 3 befestigt werden erläutert. Das robuste Design des MMS können für die Überwindung meisten Mängel mit anderen Filtrationsverfahren für die Erfassung und Konzentration von Bakterien aus Wasser, wie das Verstopfen von Filtern, die Unfähigkeit, große Mengen zu verarbeiten, Filterproben mit hoher Trübung und hohen Kosten verbunden. Aus diesen Gründen wird die FDA empfiehlt, dass die MMS in offiziellen Verfahren für Umwelt-und produzieren bezogenen Probensammelverfahren 5 eingearbeitet werden. Hier wird ein Verfahren zur Konzentration, Anreicherung und den Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus landwirtschaftlichen Wasser beschrieben. Eine MMS ist für die Konzentration von bact verwendetEria, und dient auch als Behälter für die selektive oder nicht selektive Bakterienanreicherung. Nachweis von Bakterien biochemisch mit Papier-basierten Analysegeräte (μPADs) 6 gelöst. μPADs als fluidische Netzwerke oder Spot-Tests mit einer Vielzahl von Verfahren der Photolithographie, Tintenstrahldruck, Stanz-, und Wachsdruck 7-11 hergestellt werden. Beispiele von Fluid Motive können dendritische Kanalmuster, wo die Probe in der Mitte abgeschieden und fließt anschließend zu dem distalen Reservoirs oder Einzelkanalmuster in der die Probe oder das Substrat von der äußeren Reservoirs der Kanal durch Kapillarwirkung in der Mitte 12 herausgezogen werden. Aus diesem Protokoll, die wir gewählt haben, um für 7-mm-Durchmesser Wachs-Papier-Spot-Arrays mit chromogenen Substraten eingebettet, die durch Enzyme, die auf den hier getesteten Mikroorganismen verarbeitet werden können, beschäftigen: Chlorphenolrot β-D-galactopyranosid (CPRG) und 5 - Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc)für den Nachweis von β-Galactosidase und β-Glucuronidase von E. hergestellt coli; 5-Brom-6-chlor-3-indolyl Caprylat (magenta Caprylat) zum Nachweis von C8-Esterase von Salmonella spp. und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-myo-inositol-phosphat (X-InP) für die Detektion von Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) von L. hergestellt monocytogenes-6. Somit kann das Vorhandensein eines bestimmten Bakteriums visuell ohne die Notwendigkeit für komplexe Anlagen oder die Interpretation der Daten zu beobachten. Die Spezifität und Sensitivität der Enzymbasis μPAD kolorimetrischen Detektion dieser spezifischen Zielbakterien zuvor erforscht worden 6. Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit der integrierten Konzentrationsnachweisverfahren für diese Zielbakterien durch Aufstocken von großen Volumina von Wasser mit vorbestimmten Mengen an Mikroorganismen (unveröffentlichte Daten und Bisha et al. 13) ausgewertet.

<table><tbody><tr><td>Landwirtschaftliches Wasser</td><td></td><td></td><td>Bewässerungswasser, Waschwasser produzieren, Brunnenwasser usw.</td></tr><tr><td>Vinyl-Schlauch</td><td>Wilmar</td><td>BN-CVT1005</td><td>&nbsp; 1/4" Innendurchmesser,&nbsp; 3/8" Außendurchmesser, verfügbar bei:&nbsp; http://www.wilmar.com</td></tr><tr><td>Modifizierte Moore-Tupfer-Kartusche&nbsp;</td><td>Lumiere Diagnostics</td><td></td><td>11 & frac12; cm in der Länge und 4 & frac12; cm in der Breite, verfügbar unter:&nbsp; http://www.lumierediagnostics.com.&nbsp; Alternativ kann auch eine nicht wegwerfbare Version der Kartusche verwendet werden (siehe Text)</td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>Chesapeake Wiper & Versorgung, Inc.</td><td>CC90</td><td>Grade #90, 44 x 36 Webart, erhältlich bei:&nbsp;</td></tr><tr><td>www.raglady.com Haushaltsbleiche</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Natriumhypochloritkonzentration ca. 6%</td></tr> <tr><td>Natriumthiosulfat 5-hydrat</td><td>Mallinckrodt Baker Inc</td><td>8100-04</td><td></td></tr><tr><td>Verteiler</td><td>Im eigenen Haus</td><td></td> gebaut <td>Optional, Gerät kann aus PVC-Rohren und entsprechenden Armaturen gebaut werden</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>Mikron-Messgeräte</td><td>RPP1300</td><td>Erhältlich bei:&nbsp; http://www.micronmeters.com</td></tr><tr><td>Serologische Pipette</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Einweg-Brühe, 10 ml</td></tr><tr><td>Universal-Voranreicherungsbrühe</td><td>Difco</td><td>223510</td><td></td></tr><tr><td>Gepuffertes Peptonwasser</td><td>Difco</td><td>218105</td><td></td></tr><tr><td>Salmonellen-Ergänzung</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>42650</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>VIDAS UP Listerien (LPT) Bouillon</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>410848</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861987</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Diverse</td><td></td><td>Drummond DP-110 hier verwendet</td></tr><tr><td>Schüttelinkubator</td><td>Diverse</td><td></td><td>Excella E25, New Brunswick Scientific hier</td></tr><tr><td>verwendet Mikropipette&nbsp;</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen</td><td>Various</td><td></td><td>Barrier, 10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>1,5 Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>RNase- und DNase-freie</td></tr><tr><td>Sondensonden Ultraschallgerät</td><td>Q Sonica LLC</td><td>XL-2000 Serie</td><td></td></tr> <tr><td>& Mikro; PADs</td><td>Avant&nbsp;</td><td></td><td>Wachsgedruckte Kreise mit einem Durchmesser von 7 mm und einer Linienstärke von 4 pt. Kontaktieren Sie Dr. Charles Henry für weitere Informationen</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N&prime; -2-ethansulfonsäure]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Chlorphenolrot-Galactopyranosid (CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59767</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&beta;-D-glucuronid (X-Gluc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8174</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-6-chlor-3-indolylcaprylat (magenta caprylate)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53451</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-myo-inositolphosphat (X-InP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38896</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, Polystyrol 100 mm x 15 mm</td><td>Diverse</td><td></td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Flachbettscanner</td><td>Diverse</td><td></td><td>Xerox USB-Scanner</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

farbmetrische papierbasierte erkennung von<em&gt; escherichia coli</em&gt;,<em&gt; salmonellen</em&gt; spp. und<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; von großen mengen von landwirtschaftliche wasser

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Dieses Protokoll beschreibt schnellen kolorimetrischen Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser. Hier wird das Wasser durch sterile Tupfer Modified Moore (MMS), die eine einfache Gewebefilter in einem geschlossenen Kunststoffpatrone aus filtriert, um Bakterien zu konzentrieren. Nach der Filtration sind nicht-selektive oder selektive Anreicherungen für die Ziel Bakterien in der MMS durchgeführt. Zum kolorimetrischen Nachweis der Target-Bakterien sind die Anreicherungen dann unter Verwendung von Papier-basierten Analysevorrichtungen (μPADs) mit Bakterien-Richt Substrate eingebettet getestet. Jedes Substrat reagiert mit dem Ziel anzeigenden bakteriellen Enzymen, die Erzeugung farbigen Produkte auf dem μPAD visuell (qualitativer Nachweis) detektiert werden kann. Alternativ können digitale Bilder der umgesetzten μPADs mit gemeinsamen Scannen oder fotografische Geräte erzeugt und mit ImageJ-Software, al analysiert werdengende für mehr objektive und standardisierte Interpretation der Ergebnisse. Obwohl die biochemischen Screening-Verfahren wurden entwickelt, um die oben genannten bakteriellen Krankheitserregern zu identifizieren, kann in einigen Fällen durch Enzyme Hintergrund Mikrobiota oder den Abbau der farbmetrischen Substraten ein falsch positives zu produzieren. Daher Bestätigung mit einem diskriminierender Diagnose erforderlich ist. Dennoch ist diese Bakterienkonzentration und Detektionsplattform preiswerte, empfindliche (0,1 CFU / ml Nachweisgrenze), leicht durchzuführen und eine schnelle (Konzentration, Anreicherung und Nachweis innerhalb von etwa 24 Stunden durchgeführt wird), rechtfertigen ihre Verwendung als ein Anfangsscreeningverfahren für die mikrobiologische Qualität der landwirtschaftlichen Wasser.

Wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die Konzentration der Bakterien unter Verwendung der MMS (Fig. 1) innerhalb von ca. 15-20 Minuten durchgeführt werden. Die MMS aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) in zwei getrennten Komponenten aufgebaut ist; einen Deckel und eine Kassette sowohl mit einem integrierten Zapfhahnanordnung in die ein zylindrischer Gaze Tupfer eingeführt wird (Fig. 1A). Beide Komponenten werden dann zusammengeschraubt, welche die MMS (Abbildung 1B).</stron...

Ein Protokoll, das die integrierte Konzentration, Anreicherung und den kolorimetrischen Endpunktnachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern in großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers beinhaltet, wird hier vorgestellt. Das Wasser wird durch modifizierte Moore-Tupfer (MMS) gefiltert, die mit selektiven oder nicht-selektiven Medien angereichert sind, und der Nachweis erfolgt mit papierbasierten Analysegeräten (μPAD), die in bakterienindizierte kolorimetrische Substrate eingebettet sind.

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonellen</em&gt; Spp. Und<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensmittelbedingte Krankheitserreger in großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers nachzuweisen. Dazu wird ein modifizierter Mehrfachabstrich, im Folgenden als MMS bezeichnet, hergestellt, indem ein gefaltetes Stück Mull- oder Käsetuch in eine MMS-Kassette eingelegt wird. Anschließend werden am Probenahmeort die Zielbakterien konzentriert, indem große Wassermengen mithilfe einer peristaltischen Pumpe durch den MMS geleitet werden.Die Enden der MMS werden anschließend fest verschlossen und zurück ins Labor transportiert. Selektive oder nicht-selektive Anreicherungsbrühe wird den MMS hinzugefügt, die dann 18 bis 24 Stunden inkubiert werden. Die angereicherten Kulturen werden danach gesammelt und für die E. coli-Detektion werden Lysate hergestellt.Diese werden Mikro-Pads hinzugefügt, die mit Substraten für die farbmetrische enzymatische Detektion imprägniert sind, und bis zu drei Stunden inkubiert. Anschließend werden die Mikro-Pads untersucht und gescannt. Letztendlich zeigen visuelle und quantitative Analysen der Mikrospots das Vorhandensein von E. coli, Salmonellen-Arten und L. monocytogenes in Konzentrationen von bis zu 0,1 KBE pro Milliliter an.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Membranfiltration und der Kultur auf festen Medien besteht darin, dass größere Wassermengen analysiert werden können. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Nachweises und verkürzt gleichzeitig die Anreicherungszeit. Die Zeit bis zum Nachweis wird zudem innerhalb von 24 Stunden verringert, im Vergleich zu 24 bis 48 Stunden bei der Membranfiltrationsmethode.Außerdem können die Mikroplättchen gleichzeitig drei verschiedene lebensmittelbedingte Krankheitserreger nachweisen, was auf einem herkömmlichen festen bakteriellen Medium nicht möglich ist. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Analyse von Wasser in der Landwirtschaft und auch nach extremen Ereignissen wie Waldbränden oder extremen Niederschlägen, die beide zu einer Zunahme der mikrobiellen Kontamination von Oberflächenwasser führen können, das für die Bewässerung von Kulturen verwendet wird. Unsere erste Idee zu dieser Methode entstand, als wir nach den Waldbränden in Colorado während der Sommer 2012 und 2013 große Wassermengen schnell auf das Vorhandensein von Krankheitserregern untersuchen mussten. Die Methode musste vor Ort anwendbar sein, da die Entnahmestellen abgelegen lagen und es daher schwierig war, große Wassermengen zur Analyse ins Labor zu bringen.Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Vorbereitung eines modifizierten Wattestäbchens oder MMS, indem Sie einen rechteckigen Abschnitt aus vierlagigem Mulltuch mit den Maßen 40 mal 12 Zentimeter zuschneiden. Falten Sie das Mulltuch entlang beider Kanten, um ein Rechteck von 20 mal sechs Zentimetern zu erhalten. Rollen Sie das Mulltuch anschließend fest entlang seiner längeren Achse, um einen zylindrischen Tupfer von etwa sechs Zentimetern Höhe und drei Zentimetern Durchmesser zu formen.Legen Sie den Abstrichtupfer in die Aluminiumfolienhülle und autoklavieren Sie ihn 15 Minuten lang bei 15 PSI im Trockenzyklus. Nach der Autoklavierung ist das Gerät betriebsbereit und kann zum Einsatzort gebracht werden. Vor Ort schließen Sie Vinylschläuche an die Hähne auf beiden Seiten des MMS an und stellen sicher, dass die Schläuche vollständig auf den Hähnen sitzen.Befestigen Sie dann den Schlauch in der peristaltischen Pumpe. Stellen Sie sicher, dass der Schlauchabschnitt vor der peristaltischen Pumpe ausreichend lang ist, um eine Probennahme zur Anreicherung der Bakterien zu ermöglichen. Platzieren Sie den Eingang der peristaltischen Pumpe in das landwirtschaftliche Wasser, das beprobt werden soll.Betreiben Sie die peristaltische Pumpe mit einer Flussrate von 300 Millilitern pro Minute und entnehmen Sie mindestens 10 Liter. Nach Abschluss der Probenahme ziehen Sie den Eingang der peristaltischen Pumpe aus der Wasserprobe und lassen die Pumpe weiterlaufen, bis kein Ablaufwasser mehr austritt. Verlassen Sie das MMS, nachdem die Konzentration abgeschlossen ist.Bei allen modifizierten MMS-Swabs wurde das Vinylrohr vorsichtig von den MMS-Auslässen entfernt und die Auslässe auf beiden Seiten des MMS verschlossen. Der dicht verschlossene MMS wurde vor der Anreicherung bis zu 12 Stunden bei Kühlschranktemperatur gelagert. Hier wird die Anreicherung von E. coli, Salmonella-Arten und L. monocytogenes demonstriert. Für jede selektive Anreicherung wird ein MMS verwendet.Lösen Sie die Verschlusskappe des MMS und geben Sie zur Anreicherung von E. coli 20 Milliliter sterilem, gepuffertem Peptonwasser oder BPW, ergänzt mit acht Milligramm pro Liter Vancomycinhydrochlorid, hinzu. Schrauben Sie die Verschlusskappe des MMS wieder fest zu.Zur Anreicherung von Salmonellen hinzufügen 20 Milliliter sterilem BPW, ergänzt mit vier Millilitern pro Liter Salmonellen-Zusatz. Zur Anreicherung von L. monocytogenes hinzufügen 20 Milliliter sterilem Up-List-Area-Brühe. Inkubieren Sie die MMS 18 bis 24 Stunden in einem schüttelnden Inkubator bei 150 U/min, sobald die Inkubation abgeschlossen ist.Entfernen Sie das MMS aus dem Inkubator. Schrauben Sie den Deckel ab. Gießen Sie das Medium vorsichtig in ein Falcon-Röhrchen und überführen Sie mithilfe einer Pipette vorsichtig 0,5 Milliliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Zur Vorbereitung der farbmetrischen Analyse einer e coli-selektiven Anreicherung oder zur Analyse der nicht-selektiven Anreicherungen werden 0,5 Milliliter der Anreicherung bei fünf Watt und 22 Kilohertz für 20 Sekunden sonifiziert. Mithilfe eines Probengrinders werden Stammlösungen der Substrate C-P-R-G-X glue, magenta cap relate und XINP in pH-adjustiertem heebies-Puffer hergestellt. Die Stammlösungen werden vor Licht geschützt, fünf promo sechs.CHLORO drei im Allel, capite oder magenta capite ist lichtempfindlich und könnte durch autodegradative Prozesse potenziell falsch-positive Ergebnisse erzeugen. Für jede getestete Probe und jedes Zielmolekül einen Mikropad in eine sterile Petrischale geben. Zur E. coli-Detektion CPRG- und Xgl-Mikropads vorbereiten.Für den Nachweis von Salmonella-Arten bereiten Sie magenta farbene Mikroplättchen vor, und für den Nachweis von L. monocytogenes bereiten Sie XINP-Mikroplättchen vor. Geben Sie mithilfe eines Pipettiersystems 24 µL jeder Substrat-Stammlösung auf die Mikroplättchen. Geben Sie zur Vorbereitung des Nachweises jeweils 6 µL der angereicherten Probe auf das entsprechende Mikroplättchen.Setzen Sie die Abdeckung wieder auf die Petrischale und verschließen Sie sie mit Parafilm. Inkubieren Sie die Probe mit einem Mikro-Pad bei 37 Grad Celsius bis zu drei Stunden lang, um die Farbentwicklung und das Trocknen der Mikroflecken zu ermöglichen. Führen Sie nach der Inkubation die Detektion durch einfache visuelle Inspektion der Farbänderungen der Mikro-Pads durch.Beachten Sie, dass normalerweise starke Reaktionen mit eindeutigen Farbänderungen nach 18 bis 24 Stunden Anreicherung zu erwarten sind. Solche Reaktionen gelten als positiv und erfordern keine weitere Klärung. Falls E. coli vorhanden ist, verändern sich mikroskopisch kleine Stellen, die mit CPRG versetzt sind, von gelb nach rot. Violette und mikroskopische Flecken. In XLU eingebettete Flecken färben sich von farblos nach blaugrün um, wie hier gezeigt. Wenn L. monocytogenes vorhanden ist, färben sich mikroskopische Flecken, die mit XINP eingebettet sind, von farblos nach indigo um.Wenn Salmonellen-Arten vorhanden sind, verfärben sich mikroskopisch kleine Flecken, die mit Magenta Capite imprägniert sind, von farblos nach lila. Bei schwach positiven Reaktionen verwenden Sie eine Software, um eine semiquantitative Analyse der Ergebnisse zu ermöglichen. Lassen Sie dazu die Mikropads vollständig trocknen. Scannen Sie die Mikropads mit einem Flachbettscanner ein.Verwenden Sie die Image-J-Software, um das Bild zu bearbeiten. Öffnen Sie anschließend in Image J das gescannte Bild, das analysiert werden soll. Um das Bild zu invertieren, klicken Sie dann im Hauptmenü auf den Reiter „Edit“ und wählen Sie „Invert“ aus.Verwenden Sie die Registerkarte „Analyze“ im Hauptmenü und wählen Sie „Set Measurements“, um die zu analysierenden gemeldeten Messungen auszuwählen. Stellen Sie sicher, dass die Felder für den mittleren Grauintensitätsgrenzwert zur Schwellenwertbestimmung und für die Anzeige von Beschriftungsfeldern aktiviert sind, und klicken Sie auf „OK“. Dadurch wird festgelegt, wie die Software jeden ausgewählten Bereich analysiert und wie die Ergebnisse berichtet werden.Als Nächstes wird mithilfe des Oval-Werkzeugs unter der Registerkarte „Analyze“ der zu analysierende Bereich umrissen und „Measure“ ausgewählt. Die Software misst die durchschnittliche Graustufenintensität innerhalb des definierten Bereichs und gibt diese in einem Popup-Fenster aus, das zur weiteren Analyse in Excel kopiert und eingefügt werden kann. Mikro-Pad-Assays basieren auf dem Nachweis bakterieller charakteristischer Enzyme, die mit chromogenen Substraten reagieren.Analysen zum Nachweis von E. coli erzeugen ein blaugrünes Produkt und ein rotviolettes Produkt. Analysen zum Nachweis von Salmonella-Arten und L. monocytogenes erzeugen jeweils violette MOV- und indigofarbene Färbungen. Alternativ können digitalisierte Bilder mithilfe der Image-J-Software bearbeitet werden, um eine objektivere und standardisiertere Dateninterpretation zu ermöglichen.Hier werden digitalisierte Farb- und Messbilder für jeden Test mit jeweils negativen und positiven Proben gezeigt. Die negativen Tests wurden mit Bakterienarten durchgeführt, die die Zielenzyme nicht kodieren, während die positiven Tests mit den Zielbakterien durchgeführt wurden. Die erste Zeile zeigt die unveränderten gescannten Bilder, die in der zweiten Zeile dargestellt sind.Die gescannten Bilder wurden mit der Image-J-Software in Graustufen umgewandelt. In Zeile drei wurde die Farbe invertiert, um die anschließende Interpretation der Graustufenintensität zu ermöglichen.Die vierte Zeile zeigt die durchschnittliche Grauintensität an, gemessen mit ImageJ innerhalb jedes Mikroflecks des Mikrokissens. Ein Beispiel-Mikrofleck ist durch den gelben Pfeil und Kreis markiert. Dieses Diagramm zeigt die durchschnittlichen Grauintensitäten aus vier Wiederholungen, ermittelt mit ImageJ. Für jede Farbe ein metrischer Mikrokissen-Positiv- und -Negativtest.Diese Daten zeigen, dass eine mehrdeutige Detektion der drei Zielmikroorganismen, die aus großen Volumina landwirtschaftlichen Wassers angereichert wurden, mithilfe dieses Verfahrens durchgeführt werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man einen modifizierten Moore-Abstrich zusammenbaut, Mikroorganismen des Interesses aus großen Volumina landwirtschaftlichen Wassers anreichert sowie farbmetrische enzymatische Detektion und Analyse auf papierbasierten Analysegeräten durchführt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, einen Beschallungsschritt zur Detektion von e coli einzubeziehen. Außerdem sollte das magenta farbene Capite-Substrat so viel wie möglich vor Licht geschützt werden. Eine ordnungsgemäße Versiegelung und Montage des MMS vor der Inkubation ist wichtig, damit das Verfahren vollständig mit zusätzlicher Entwicklung abgeschlossen werden kann.Diese Technik verspricht, als einfache, kostengünstige und schnelle Methode für die Diagnostik von mikrobiellen Krankheitserregern und Indikatororganismen am Bedarfspunkt über Anwendungen in der Lebensmittelsicherheit hinaus sehr nützlich zu werden. Diese Technik kann potenzielle Anwendung in der Umwelt- und klinischen Mikrobiologie finden. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit pathogenen Mikroorganismen äußerst gefährlich sein kann, und vermeiden Sie daher das Verschütten bakterieller Anreicherungen sowie die Bildung von Bioaerosolen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten stets die Standardvorkehrungen für den Umgang mit pathogenen Mikroorganismen beachtet werden.

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