Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von Escherichia coli, Salmonellen Spp. Und Listeria monocytogenes Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lebensmittelbedingte Krankheitserreger in großen Mengen landwirtschaftlicher Gewässer nachzuweisen. Zu diesem Zweck wird ein modifizierter Tupfer, der im Folgenden als MMS bezeichnet wird, zusammengesetzt, indem ein gefaltetes Stück Gaze oder Käsetuch in eine MMS-Kassette gelegt wird. Anschließend werden an der Probenahmestelle die Zielbakterien konzentriert, indem große Mengen Wasser mit einer Schlauchpumpe durch das MMS geleitet werden.

Die Enden des MMS werden dann fest verschlossen und zurück ins Labor transportiert. Dem MMS wird selektive oder nicht-selektive Anreicherungsbrühe zugesetzt, die 18 bis 24 Stunden lang inkubiert wird. Die angereicherten Kulturen werden dann gesammelt und für den Nachweis von E-coli Lysate hergestellt.

Diese werden mit Mikro-Pad-Mikrospots imprägniert, um den farbmetrischen enzymatischen Nachweis zu ermöglichen, und bis zu drei Stunden lang inkubiert. Anschließend werden die Mikropads inspiziert und gescannt. Letztendlich zeigen visuelle und quantitative Analysen der Mikrospots das Vorhandensein von E. coli, Salmonellenspezies und L monocytogenes in Konzentrationen von nur 0,1 KBE pro Milliliter.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Membranfiltration und der Kultivierung auf festen Medien besteht darin, dass größere Mengen an Wasserproben entnommen werden können. Dies erhöht die Sensitivität des Assays und verkürzt auch die Anreicherungszeit. Die Zeit bis zum Nachweis verkürzt sich ebenfalls innerhalb von 24 Stunden im Vergleich zu 24 bis 48 Stunden bei der Membranfiltrationsmethode.

Darüber hinaus können mit den Mikropads gleichzeitig drei verschiedene lebensmittelbedingte Krankheitserreger nachgewiesen werden, was auf dem herkömmlichen festen Bakterienmedium nicht möglich ist. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Analyse von landwirtschaftlichen Gewässern und auch auf Extremereignisse wie Waldbrände oder extreme Regenfälle, die beide zu einer Zunahme der mikrobiellen Kontamination von Oberflächenwasser führen können, das für die Bewässerung von Pflanzen verwendet wird. Und wir hatten diese Idee für diese Methode zum ersten Mal, als wir nach den Waldbränden in Colorado in den Sommern 2012 und 2013 große Wassermengen schnell auf das Vorhandensein von Krankheitserregern untersuchen mussten. Die Methode musste aufgrund der abgelegenen Probenahmegebiete, die es schwierig machten, große Wassermengen für Analysen zu sammeln und zurück zum Labor zu transportieren, für den Einsatz im Feld anpassbar sein.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie einen modifizierten Tupfer oder MMS-Schnitt vorbereiten, einen rechteckigen Abschnitt aus vierlagigem Käsetuch mit den Maßen 40 x 12 Zentimeter. Falten Sie das Käsetuch entlang beider AEs, um ein Rechteck von 20 x sechs Zentimetern zu erhalten. Rollen Sie dann das Seihtuch fest entlang seiner längeren Achse, um einen zylindrischen Tupfer zu bilden, der etwa sechs Zentimeter hoch ist und einen Durchmesser von drei Zentimetern hat.

Führen Sie den Tupfer in die Alufolienpackung ein und autoklavieren Sie ihn 15 Minuten lang. Bei 15 PSI unter Verwendung eines Trockenzyklus nach dem Autoklavieren ist das Gerät bereit, auf das Feld gebracht zu werden. Sobald Sie vor Ort sind, befestigen Sie die Vinylschläuche an den Zapfen auf beiden Seiten des MMS und stellen Sie sicher, dass die Schläuche vollständig an den Zapfen haften.

Befestigen Sie dann den Schlauch in der Schlauchpumpe. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch vor der Schlauchpumpe ausreichend lang ist, um die Probenahme zur Konzentration der Bakterien zu ermöglichen. Platzieren Sie den Einlass der Schlauchpumpe in das zu beprobende landwirtschaftliche Wasser.

Lassen Sie die Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 300 Millilitern pro Minute laufen und nehmen Sie nach Abschluss der Probenahme mindestens 10 Liter Probe. Entnehmen Sie den Einlass der Schlauchpumpe aus der Wasserprobe und lassen Sie die Pumpe so lange laufen, bis kein Abwasser mehr zu sehen ist. Beenden des MMS, wenn die Konzentration abgeschlossen ist.

Entfernen Sie bei allen modifizierten Tupfern vorsichtig die Vinylschläuche von den MMS-Zapfen und verschließen Sie die Zapfen auf beiden Seiten des MMS. Lagern Sie das fest verschlossene MMS bis zu 12 Stunden bei Kühltemperatur, bevor Sie es anreichern. Medium wird hier die Anreicherung von e coli, Salmonellenarten und l monocytogenes demonstriert. Für jede selektive Anreicherung wird ein MMS verwendet.

Schrauben Sie den Deckel des MMS ab und zur Anreicherung von E-coli. Fügen Sie 20 Milliliter steriles gepuffertes Peptidwasser oder BPW hinzu, ergänzt mit acht Milligramm Vancomycinhydrochlorid pro Liter. Schrauben Sie den Deckel des MMS wieder fest auf.

Zur Anreicherung von Salmonellenarten fügen Sie 20 Milliliter steriles BPW hinzu, ergänzt mit vier Millilitern pro Liter. Salmonellenpräparat zur Anreicherung von L monocytogenes, fügen Sie 20 Milliliter sterile Brühe hinzu. Inkubieren Sie das MMS 18 bis 24 Stunden lang in einem Schüttelinkubator bei 150 U/min, wenn die Inkubation abgeschlossen ist.

Nehmen Sie das MMS aus dem Inkubator. Schrauben Sie den Deckel ab. Gießen Sie das Medium vorsichtig in ein Falcon-Röhrchen und geben Sie mit einer Pipette vorsichtig 0,5 Milliliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Zur Vorbereitung der farbmetrischen Analyse der selektiven Anreicherung von E. coli oder zur Analyse der nichtselektiven Anreicherungen werden 0,5 Milliliter Anreicherung bei fünf Watt 22 Kilohertz für 20 Sekunden beschallt. Bereiten Sie mit einem Sondenator Stammlösungen der Substrate C-P-R-G-X-Kleber, Magenta-Kappen-Rerelate und XINP in pH-angepasstem Heebies-Puffer vor. Schützen Sie die Lagerlösungen vor Licht fünf Promo sechs.

CHLORO drei in Allel, Capit oder Magenta-Capit ist lichtempfindlich und könnte durch Autodegradation möglicherweise zu falsch positiven Ergebnissen führen. Legen Sie für jede getestete Probe und jedes getestete Ziel ein Mikropad in eine sterile Petrischale. Bereiten Sie für den Nachweis von E-Coli CPRG- und xgl-Mikropads vor.

Bereiten Sie für den Nachweis von Salmonellenarten magentafarbene Capite-Mikropads und für den Nachweis von l-Monocytogenes XINP-Mikropads vor. Betten Sie den Micro Padd Micro Spot mit einer Pipette mit 24 Mikrolitern jeder Substrat-Stammlösung ein. Zur Vorbereitung der Detektion geben Sie sechs Mikroliter der angereicherten Probe auf jedes geeignete Mikropad.

Setzen Sie den Deckel wieder auf die Petrischale und verschließen Sie ihn mit Parafolie. Inkubieren Sie die Probe mit einem Mikropad bei 37 Grad Celsius für bis zu drei Stunden, um die Farbentwicklung und das Trocknen der Mikroflecken zu ermöglichen. Führen Sie nach der Inkubation die Detektion durch eine einfache Sichtprüfung der Farbveränderungen der Mikropads durch.

Beachten Sie, dass starke Reaktionen, die endgültige Farbveränderungen hervorrufen, in der Regel nach 18 bis 24 Stunden Anreicherung zu erwarten sind. Diese werden als positiv bewertet und bedürfen keiner weiteren Klärung. Wenn E-coli vorhanden sind, wechseln die mit CPRG eingebetteten Mikroflecken von gelb zu rot.

Violette und Mikroflecken. Eingebettet mit xlu ändert sich von farblos zu blaugrün, wie hier gezeigt. Wenn l monocytogenes vorhanden ist, ändern sich die mit XINP eingebetteten Mikroflecken von farblos zu indigofarben.

Wenn Salmonellenarten vorhanden sind, ändern sich die mit magentafarbenem Capite eingebetteten Mikroflecken von farblos zu violett M.In Fällen, in denen die Reaktionen wöchentlich positiv sind, verwenden Sie eine Software, um eine semiquantitative Analyse der Ergebnisse zu ermöglichen. Lassen Sie dazu die Mikropads vollständig trocknen. Scannen Sie das Mikropad mit einem Flachbettscanner.

Verwenden Sie die Image J-Software, um das Image zu verarbeiten. Öffnen Sie als Nächstes in Bild J das gescannte Bild, das analysiert werden soll. Um das Bild zu invertieren, klicken Sie dann im Hauptmenü auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie "Umkehren".

Verwenden Sie die Registerkarte "Analysieren" im Hauptmenü und wählen Sie "Messungen festlegen", um die zu analysierenden gemeldeten Messungen auszuwählen. Vergewissern Sie sich, dass die Kontrollkästchen für die mittlere Grauintensität auf den Schwellenwert und die Anzeigebeschriftung aktiviert sind, und drücken Sie auf OK. Damit wird festgelegt, wie die Software jeden ausgewählten Bereich analysiert und wie sie ihn meldet.

Umreißen Sie anschließend mit dem ovalen Werkzeug den zu analysierenden Bereich auf der Registerkarte "Analysieren" und wählen Sie "Messen" aus. Die Software misst die durchschnittliche Grauintensität innerhalb des definierten Bereichs und meldet sie in einem Popup-Fenster, das zur weiteren Analyse kopiert und in Excel eingefügt werden kann. Micro-Pad-Assays basieren auf dem Nachweis von bakteriellen indikativen Enzymen, die mit cholemetrischen Substraten reagieren.

Assays, die E-coli nachweisen, erzeugen ein blau-grünes und ein rot-violettes Produkt. Assays, die Salmonellenspezies und L-monocytogenese nachweisen, erzeugen violette MOV- bzw. Indigofarben. Alternativ können digitalisierte Bilder mit der Image J-Software bearbeitet werden, um eine objektivere und standardisiertere Dateninterpretation zu ermöglichen.

Hier werden digitalisierte Farb- und metrische Bilder für jeden Assay mit einem negativen und einem positiven Test gezeigt. Negative Tests wurden mit Bakterienspezies durchgeführt, die nicht für die Zielenzyme kodieren, und positive Tests mit Zielbakterien. In der ersten Zeile werden in der zweiten Zeile unveränderte gescannte Bilder angezeigt.

Die gescannten Bilder wurden mit der Software Image J in Graustufen umgewandelt. Und in Reihe drei wurde die Farbe invertiert. Zur nachträglichen Interpretation der Grauintensität.

Zeile vier zeigt die durchschnittliche Grauintensität, die mit Bild J in jedem Mikrofleck des Mikropads gemessen wurde. Ein Beispiel für einen Mikrofleck ist durch den gelben Pfeil und Kreis gekennzeichnet. Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche Grauintensität von vier Replikaten, die durch Bild J bestimmt wurden. Für jede Farbe wird ein positiver und ein negativer Test des Mikropads gemessen.

Diese Daten zeigen, dass mit diesem Verfahren ein mehrdeutiger Nachweis der drei Zielmikroorganismen, die aus großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers konzentriert sind, durchgeführt werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen modifizierten Moore-Tupfer zusammenbaut. Konzentrieren Sie Mikroorganismen von Interesse aus großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers und führen Sie farbmetrische enzymatische Detektionen und Analysen auf papierbasierten Analysegeräten durch.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen Ultraschallschritt zum Nachweis von E-coli einzuschließen. Es ist auch wichtig, daran zu denken, den magentafarbenen Capite-Untergrund so weit wie möglich vor Licht zu schützen. Die richtige Decke und Montage des MMS vor der Inkubation ist wichtig, damit das Verfahren mit zusätzlicher Entwicklung abgeschlossen werden kann.

Diese Technik verspricht, als einfacher, kostengünstiger und schneller Ansatz für die bedarfsgerechte Diagnostik von mikrobiellen Krankheitserregern und Indikatormikroorganismen über Anwendungen in der Lebensmittelsicherheit hinaus sehr nützlich zu werden. Diese Technik kann das Potenzial finden und einen potenziellen Einsatz in der Umwelt- und klinischen Mikrobiologie finden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Mikroorganismen äußerst gefährlich sein kann, und daher ist es wichtig, das Verschütten von bakteriellen Anreicherungen und auch die Bildung von Bioaerosolen zu vermeiden.

der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit pathogenen Mikroorganismen beachtet werden.