Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten In Vivo
28. August 2014
Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Blutgefäße in Tissue-Engineering-Konstrukten sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem ein standardisierter vollständiger Hautdefekt auf dem Rücken von Mäusen erzeugt wird. Als nächstes wird eine Probe des Tissue Engineering Materials in den Hautdefekt implantiert.
Am Ende der Beobachtungszeit wird das Material dann implantiert und in ein Trans-Beleuchtungsgerät gelegt. Schließlich werden hochauflösende Fotos des Gefäßnetzes mit einer handelsüblichen Digitalkamera aufgenommen. Letztendlich wird das Gefäßnetzwerk durch digitale Segmentierung und Quantifizierung mit der Vest Egg Tool Software analysiert.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Mikroskopie, Computertomographie oder Magnetresonanztomographie besteht darin, dass sie eine effektive Visualisierung und Quantifizierung von Gefäßprozessen innerhalb von Biomaterialien ermöglicht, die alle neuen funktionellen Gefäße fokussieren. Diese Methode kann einen Einblick in die Vaskularisierung von Hautersatzmaterialien geben. Es kann auch auf andere Modellorganismen angewendet werden oder um die Vaskularisation in anderen Organen zu untersuchen.
Verwenden Sie zunächst 12-Millimeter-Biopsiestempel, um Proben von Gerüsten zu erzeugen, z. B. aus rindern, auf Kollagen basierenden Hautersatzmaterialien, die runde Tetinnetzstücke mit einem Durchmesser von 14 Millimetern schneiden, um sie unter jedem Gerüst zu platzieren. Nach der Betäubung einer Maus die Narkosetiefe mit einem Zehenkneifen überprüfen und das hintere Fell gemäß dem Textprotokoll entfernen. Bringen Sie das Tier in Bauchlage und markieren Sie mit einem permanenten Stift mit feiner Spitze die Mittellinie des Rückens der Maus.
Definieren Sie einen Exzisionsbereich, der nicht zu weit entfernt ist, um zu verhindern, dass das Tier das Gerüst entfernt. Erzeugen Sie mit einem 10-Millimeter-Biopsienstanzen runde bilaterale Defekte, indem Sie den Stempel vorsichtig gegen die Haut drücken. Um den Exzisionsbereich mit einer Pinzette abzugrenzen, heben Sie die markierte Haut vorsichtig ab und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere entlang des markierten Kreises.
Wenn Blutungen auftreten, verwenden Sie sterile Gaze, um den Bereich vorsichtig zusammenzudrücken, um Platz für das Titanic-Netz zu schaffen. Verlängern Sie die Trennung von Haut und darunterliegendem Gewebe am Wundrand um weitere zwei bis vier Millimeter. Legen Sie das Netz direkt auf dem Wundbett und unter den Wundrändern in den Defekt.
Platzieren Sie dann die Gerüste direkt über dem Netz. Verwenden Sie vier bis sechs einfache Knoten, um das Gerüst zu nähen, so dass die angrenzenden Wundränder die Kanten leicht über dem Gerüst belassen. Nähen Sie dann einen transparenten Wundverband über den Defekten, um das Gerüst zu schützen und gleichzeitig eine Überwachung des Wundbereichs zu ermöglichen.
Beurteilen Sie den allgemeinen Zustand des Tieres täglich, indem Sie die motorische Aktivität, das Körpergewicht, die Anzeichen von Schmerzen, die Toleranz gegenüber dem Verband und die Selbstverstümmelung überwachen. Überwachen Sie auch den Wundbereich auf Blutungen, lokale und systemische Anzeichen einer Infektion und die Position des Verbandes. Nach dem Einschläfern des Tieres zum gewünschten Zeitpunkt.
Verwenden Sie gemäß dem Textprotokoll einen Permanentmarker, um die Exzisionsstelle zu markieren, zu der sich die Gerüste befinden. Verwenden Sie eine Schere oder ein Skalpell, um die Haut entlang der markierten Linien durch eine stumpfe Exzision zu schneiden, lösen Sie die gesamte Haut, einschließlich der Gerüste und des Netzes, vom darunter liegenden Gewebe und legen Sie ein kopfüber gespanntes Gewebe in eine Petrischale. Um die Probe zu visualisieren, platzieren Sie sie über einem Trans-Beleuchtungsgerät.
Im Makromodus können Sie Bilder von den gesamten Gerüsten und gleich großen Bereichen der normalen Haut aufnehmen und die Bilder in einem TIFF-Format für die weitere digitale Analyse speichern. Nachdem Sie die ves EQ-Tool-Software heruntergeladen haben, öffnen Sie ein Bild und wählen Sie einen Bereich von Interesse für die Analyse aus, indem Sie die Rücktaste drücken. Drücken Sie dann auf Umkehren.
Um das Gefäßnetzwerk in Weiß zu visualisieren, wählen Sie Bildgefäßverstärkungsfilter, Hysterese-Schwellenwerte, Top-Hat-Transformation und berechnen Sie die Gefäßvergrößerung in allen vorherigen Schritten. Scrollen Sie, um das Bild zu vergrößern und zu verkleinern. Segmentieren Sie die Schiffskarte, indem Sie den ersten Schwellenwert oder die erste Schiffsabdeckung auswählen, sodass jedes Pixel, das auch nur im Entferntesten schiffsähnlich ist, als Schiff gekennzeichnet wird.
Drücken Sie auf Berechnen. Um eine Vorschau der Auswahl anzuzeigen, wählen Sie den zweiten Schwellenwert oder die Hintergrundabdeckung aus, sodass nur die Pixel, die besonders gefäßähnlich sind, als Gefäße gekennzeichnet werden. Um die Länge der Schiffe und die von ihnen bedeckte Gesamtfläche zu berechnen, klicken Sie auf Bild, Bildstatistik und Binärbildstatistik.
Die Gefäßlänge lässt sich am besten schätzen, indem das Gefäßnetz auf eine Pixelbreite vorausgedünnt wird. Gehen Sie dazu vor der Berechnung zu bildmorphologischen Filtern und Skelettierung. Das Verhältnis von Schiffsfläche zu Schiffslänge ergibt einen Wert für die Schiffsgröße in der interessierenden Region.
Beseitigen Sie bei Bedarf Artefakte, indem Sie nur die gewünschten Gefäße auswählen. Wenn Sie unter den Auswahlmodus klicken, drücken Sie die Rücktaste, um die ausgewählten Gefäße in ein neues Bild zu kopieren. Analysieren Sie abschließend den nativen Hautbereich unter den gleichen Parametern wie ein Gerüst, indem Sie dem nativen Gewebe einen Wert von 100 % zuweisen und das Gerüst mit diesem Wert in Beziehung setzen.
Wenn der Anteil der weißen Pixel beispielsweise 30 % im normalen Gewebe und 15 % im Gerüst beträgt, entspricht dies einer Vaskularisierung von 50 % der Gesamtfläche des Gerüsts. Bitte beachten Sie, dass die Werte dem gesamten Bildbereich entsprechen. Daher ist es notwendig, sie auf den Bereich des ausgewählten Bereichs zu korrigieren, wie hier gezeigt.
Zwei Wochen nach der Implantation des Gewebes ermöglichte die Trans-Beleuchtung die klare Visualisierung von Gefäßstrukturen mit einer Breite von bis zu 30 Mikrometern in einer ganzen Gewebeprobe, die sowohl natives Gewebe als auch implantierte Gerüste umfasste. Unter Verwendung der digitalen Segmentierung wurde im Gerüst im Vergleich zur nativen Haut ein Vaskularisationsgrad von 62,28 plus oder minus 8,6 % beobachtet. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, reproduzierbare Vollhautdefekte zu erzeugen und das Biomaterial zuverlässig auf der Wunde zu fixieren.
Nach diesem Verfahren kann expandiertes Gewebe für weitere Analysen wie Histologie oder RNA- und Proteinexpression verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Vaskularisierung in gewebeengineeringbasierten Konstrukten vor. Mithilfe eines standardisierten Hautdefektmodells an Mäusen kann das vaskuläre Netzwerk effektiv analysiert werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gewebetechnik
- Wassertechnik
- Bildgebung im lebenden Organismus
Hintergrund
- Die Vaskularisierung ist entscheidend für den Erfolg des Gewebeengineerings.
- Es werden zuverlässige Technologien zur Beurteilung vaskulärer Netzwerke benötigt.
- Aktuelle Methoden weisen möglicherweise Mängel hinsichtlich Kosteneffizienz und Einfachheit auf.
- Diese Studie zielt darauf ab, diese Lücken zu schließen.
Zweck der Studie
- Visualisierung von Blutgefäßen in gewebeengineeringtechnischen Konstrukten.
- Entwicklung einer kosteneffektiven Methode zur Analyse von vaskulären Netzwerken.
- Verbesserung des Verständnisses der Vaskularisierung im Gewebeengineering.
Verwendete Methoden
- Erstellung eines standardisierten vollständigen Hautdefekts an Mäusen.
- Implantation von gewebetechnisch hergestelltem Material in den Defekt.
- Verwendung eines Durchlichtgeräts zur Bildgebung.
- Hochauflösende Fotografie des vaskulären Netzwerks.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Blutgefäßen in den Konstrukten.
- Quantifizierung des vaskulären Netzwerks mittels digitaler Segmentierung.
- Nutzung der Vest-Ei-Tool-Software zur Analyse.
- Nachweis der Wirksamkeit und Kosteneffizienz der Methode.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet ein zuverlässiges Mittel zur Beurteilung der Gefäßbildung.
- Sie kann in verschiedenen Studien zur Gewebeengineering angewendet werden.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesem Ansatz aufbauen, um verbesserte Ergebnisse zu erzielen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine zuverlässige Quantifizierung der Vaskularisierung in Biomaterialien stellt einen entscheidenden Wendepunkt für die Weiterentwicklung gewebeengineeringbasierter Konstrukte in Richtung translationeller und präklinischer Validierung dar. Dieses Modell eines vollständigen Hautdefekts ermöglicht eine direkte, hochauflösende Visualisierung und digitale Quantifizierung der Neovaskularisierung und unterstützt so die Vorhersage der Scaffold-Leistung. Der Ansatz beschleunigt die Risikominderung in frühen Entwicklungsstadien und die Selektion von Biomaterialkandidaten für Anwendungen in der regenerativen Medizin.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Überprüfung von Hypothesen zur Gefäßbildung in technisch hergestellten Gerüsten.
- Unterstützt die funktionelle Validierung pro-angiogener Modifikationen oder eingebauter bioaktiver Moleküle.
- Ermöglicht die biologische Ent风险ierung durch Quantifizierung des Gefäßwachstums in vivo.
- Bietet vergleichende interne Kontrollen durch ein bilaterales Wunddesign und reduziert so die Variabilität zwischen den Tieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, reproduzierbare in-vivo-Testbedingungen zur Biomaterialbewertung.
- Erzeugt quantitative Ergebnisse durch digitale Segmentierung und Metriken zur Gefäßbedeckung.
- Ermöglicht hochauflösende Untersuchung mehrerer Gerüstformulierungen oder Bioaktivierungsstrategien.
- Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform zur iterativen Optimierung von Vaskularisierungseigenschaften.
Translationale und präklinische Forschung
- Passt zu modellen der gewebe-reparatur und regenerativen medizin, die für die Krankheitsforschung relevant sind.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der entdeckungsphasenbezogenen Gerüstbewertung zur präklinischen Validierung der vaskulären Integration.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf quantitativen Benchmarks zur Vaskularisierung.
- Ermöglicht nachgeschaltete Analysen wie Histologie oder molekulares Profiling von explantiertem Gewebe.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Modell schließt die Lücke zwischen der frühen Entdeckung und der präklinischen Bewertung, indem es einen standardisierten Workflow für die in-vivo-Bewertung der Vaskularisierung von Biomaterialien bereitstellt.
- Entdeckungsbioanalyse: Unterstützt die Hypothesenprüfung zum angiogenen Potenzial und zur Aktivierung von Signalwegen in konstruierten Geweben.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Vergleiche von Gerüstvarianten und Methoden der biofunktionalen Aktivierung.
- Analytik: Liefert durch digitale Bildanalyse quantitative Messgrößen wie Gefäßlänge, -fläche und -bedeckung für fundierte, datengestützte Entscheidungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung auf Endpunkte der regenerativen Medizin und die Anforderungen an die präklinische Gewebestabilität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare, kosteneffiziente Testplattform zur kontinuierlichen Bewertung von Biomaterialien in der Entwicklungs-Pipeline.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Gefäßversorgung des Gerüsts und verringert mechanistische Unschärfen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die in-vivo-Bewertung, verbessert die Reproduzierbarkeit und unterstützt die skalierbare Untersuchung.
- Strategischer Wert: Leitet Go/No-Go-Entscheidungen ab und optimiert die Ressourcenallokation, indem Schlüsselparameter biologischer Endpunkte quantifiziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Biomaterial-Kandidaten für die weitere Entwicklung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Chirurgie an Kleintieren und der Wundbehandlung.
- Benötigt Zugang zu Durchlichtbildgebung und digitaler Analyse-Software (z. B. Vest-Ei-Tool).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei chirurgischen und bildgebenden Protokollen zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Kann durch Anpassung des Protokolls auf verschiedene Gerüsttypen und möglicherweise auch andere Organsysteme übertragen werden.
- Zu den Einschränkungen gehören die Notwendigkeit einer sorgfältigen Minimierung von Artefakten und die Korrektur des interessierenden Bereichs während der Analyse.
